Metody analýzy proteinových komplexů
Pro stabilní komplexy – nelze použít pro charakterizaci
struktury/architektury komplexů a pro analýzu
slabých/přechodných interakcí
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace …
- (kvasinkový) dvou-hybridní systém
- BiFC, FRET, ko-lokalizace, ko-exprese
- Flourescenční anisotropie, SPR, ITC …
- ko-krystalizace, cryoEM …
- databáze (interactom a komplexy …)
- genetické metody (syntetická letalita, suprese)
Uetz and Finley, 2005
Traven et al.: EMBO Report, 2006
Při studiu mechanismů
transkripce v kvasinkách S.
cerevisiae byl vyvinut tzv.
Y2H
Na spínaní/regulaci
metabolismu galaktosy se
podílí transkripční faktor
Gal4p – váže specifické
sekvence v promotorech
genů (Gal enzymů) a
aktivuje jejich transkripci
Dvou-hybridní
systémy
(kvasinkové)
Gal4p
Transkripční
komplex
Luban & Goff, CO Biotech, 1995
DB
DB
AD
AD
DB
AD
DB
AD
- DNA-vazebná doména (DB) bez
aktivační domény (AD)
není schopna aktivace transkripce
Je možné propojit domény jakýmkoli
linkerem a transkripci reaktivovat
Gal4p
DB
AD
DB
AD
plasmid
(TRP1)
plasmid
(LEU2) Transformace plasmidů do kvasinek
MaV203 kmen navíc obsahuje URA3 reporter gen – lze tedy selektovat na uracilovou
auxotrofii + reversní systém tj. mutanty disruptující interakce (na FOA)
- Testuje se schopnost
růstu kvasinek na
médiu bez histidinu
(nebo adeninu –
červená/bílá)
- lze použít i pro
hledání proteinových
interakčních partnerů
(screen knihovny)
Kvasinkový
kmen
His3
His3
Nse3
Nse4
His3
His3
“alaninscan”konservovanýchAMKukázalhydrofobníkapsu
“alanin scan” konzervovaných
AMK ukázal hydrofobní kapsu na
povrchu Nse3
Do níž se váže hydrofobní
šroubovice Nse4 proteinu
Pomocí in silico (MD) analýzy byl
vytvořen model dimeru Nse3Nse4
(docking)
Dvouhybridní systém
94
 využívá umělého spojení testovaných
proteinů s oddělenými
 doménami transkripčního aktivátoru
 transkripční faktory mají často
modulární strukturu:
 doménu pro vazbu na DNA (DBD) a
aktivační doménu (AD)
 interakce obou domén vede k
aktivaci transkripce
 (kovalentní propojení domén není
nutné) cílového genu
Dvouhybridní systém - princip
 Cíl: otestování interakce proteinu X s
proteinem Y
 doména pro vazbu na DNA (DBD)
transkripčního faktoru je spojena
 fúzí s proteinem X – tvoří „návnadu“ („bait“)
 aktivační doména (AD) transkripčního
faktoru je spojena s
 proteinem Y – tvoří „kořist, oběť“ („prey“)
 oba fúzované geny se exprimují v
kvasinkových buňkách obsahujících
 příslušný reportérský gen stabilně začleněný
do genomu
 interakce testovaných proteinů se projeví
aktivací reportérského
 genu
95
96
Reversní systém (Y2H)
-Při použití URA3 reportéru lze použít toxickou 5-fluoroorotátovou
kyselinu (5-FOA) k negativní selekci tj. interakce
povede k záhubě kvasinek, zatímco mutanty neschopné
interakce na FOA plotnách porostou (mutanty nebo syntetické
látky) Vidal & Endoh, T in Biotech, 1999
je vhodnější
pozitivní selekce
(screenovat na
rostoucí kvasinky)
Trojhybridní systém
 Slouží k identifikaci proteinů, jejichž interakci zprostředkovává RNA
98
Analýza vazby protein-RNA (Y3H)
SenGupta et al, PNAS, 1996
Tři fúzní makromolekuly
(2x protein a 1x RNA)
Vazba ligand-receptor (Y3H)
FK506
Licitra & Liu, PNAS, 1996
dexamethasone
glucocorticoid receptor - FKBP12
Tři fúzní makromolekuly
(2x protein a 1x nízkomolekulární
ligand)
- Y2H systémy mají výhodu selekce – přežití kvasinek – je možné
je využít pro hledání nových partnerů
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace …
- (kvasinkový) dvou-hybridní systém
- FRET, BiFC, ko-lokalizace, ko-exprese
- Flourescenční anisotropie, SPR, ITC …
- ko-krystalizace, cryoEM …
- databáze (interactom a komplexy …)
- genetické metody (syntetická letalita, suprese)
Study of Protein-protein
Interactions In Vivo
 Popular technique is “Two-hybrid” screen (yeast,
mammalian or bacterial)
 Various fluorescent techniques are also in use:
FRET – fluorescence resonance energy transfer;
reports on distance between 2 fluorophores
Fluorescent reporters – expressed proteins emit
fluorescence at specific wavelength
FRAP (FLIP) – fluorescence recovery after
photobleaching (fluorescence loss in
photobleaching); allow movement of reporters to
be monitored
Förster/fluorescence resonance energy transferFRET
Bimolecular fluorescence complementation - BiFC
Propojuje se zpět fold/struktura nikoli 2 domény jako u Y2H
(lokalizace proteinů do tkání, buněčných kompartmentů …)
Pekarova et al, Plant J., 2011
Bimolecular fluorescence complementation - BiFC
Protein-fragment complementation
Shekhat & Ghosh, CO in ChB, 2011
„Phage display“
vystavení peptidů nebo
proteinů na povrchu
bakteriofága pro otestování
jeho schopnosti interagovat
s jinými proteiny
 Princip:
 plášťové proteiny vláknitého
 bakteriofága tolerují
 spojení s cizími polypeptidy
 fúzí připojený cizí peptid
 může být vystaven na
 povrchu fága
106
Knihovna „Phage display“
107
- přenesení knihovny „phage display“ do zkumavky nebo
mikrotitrační destičky potažené ligandem,
protilátkou, receptorem nebo jiným testovaným
proteinem: afinitní screening
odmytí nenavázaného fága
lze testovat velmi vysoké
počty fágových částic a
hledat interagující klony
- fragmenty DNA se začlení do klonovacího místa
uvnitř genu, který kóduje jeden z povrchových
proteinů vláknitého fága M13
- fúzovaný gen kóduje proteinovou chiméru, která
bude včleněna do fágové hlavy a to takovým
způsobem, že cizí protein bude vystaven na povrchu
fágové částice
- v malém objemu může být obrovský počet virionů
(1012/ml): lze takto vystavit mnoho různých peptidů
108