Přístupy k analýze buněčných
proteinů
Metody pro studium buněčných proteinů
Stanovení fyzické přítomnosti buněčných proteinů:
- polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE)
- westernový přenos
- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
- imunoprecipitace
- imunohistochemie
- izoelektrická fokusace
- dvourozměrná elektroforéza v polyakrylamidovém gelu
2MB-2019-analýza proteinůainterakcí
3MB-2019-analýza proteinůainterakcí
Elektroforetické techniky
- založeny na schopnostipohybu elektricky
nabitých molekul v elektrickém poli
- proteiny se obvykle rozdělují vertikální
polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (PAGE)
- polymerovaný gel se vloží mezi dvě nádoby
naplněné pufrem, do kterých se ponoří elektrody
- u deskové varianty se vzorky nanesou do
jamek na horní straně gelu
- používají se alkalické pufry, které proteinům
udílejí negativní náboj - v elektrickém poli se
pohybují směrem k anodě
4MB-2019-analýza proteinůainterakcí
5
Faktory ovlivňující pohyblivost proteinů v gelu
- velikost: se vzrůstající velikostí molekuly se snižuje pohyblivost
proteinů v gelu (efekt molekulárního síta)
- tvar: globulární proteiny se pohybují rychleji než vláknité
- hustota náboje (náboj/jednotka hmoty): čím vyšší hustota náboje tím vyšší
pohyblivost v gelu
- koncentrace akrylamidu: se vzrůstající koncentrací pohyblivost klesá
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
6
SDS-polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS-PAGE)
- proteiny běžně zaujímají různé tvary a disponují různými náboji (na rozdíl od
molekul DNA, které jsou uniformní z hlediska tvaru a rozdělení náboje)
- interpretace elektroforetogramu v nativní podobě je obtížná
- pro separaci proteinů se běžně používá denaturační varianta PAGE zvaná
SDS-PAGE:
- proteiny se rozpouštějí v roztoku obsahujícím negativně nabité molekuly
SDS
- disulfidové vazby v proteinech se eliminují redukčním činidlem
(β-merkaptoetanolem)
- Příprava vzorků proteinů je dokončena varem
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
7
SDS-PAGE
Negativní náboj SDS a jeho vazba k proteinům způsobí:
- zamaskování vlastního náboje proteinu
- natažení proteinu (denaturaci) a eliminuje tak vliv tvaru
proteinu na pohyblivost (díky elektrostatickémuodpuzování
molekul SDS)
- počet molekul SDS navázaných na protein je zhruba úměrný
jeho molekulové hmotnosti; proto má každý protein, bez
ohledu na svou velikost, ekvivalentní hustotu náboje
- větším proteinům bude kladen v gelu větší odpor a jejich
pohyb bude pomalejší (efekt molekulárního síta).
Proteiny se při SDS-PAGE separují pouze
podle jediné vlastnosti: molekulové hmotnosti.
Ulrich K. Laemmli
University of Geneva
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
8
Zviditelněníproteinů separovaných PAGE
- nespecificky: obarvení všech proteinů v gelu proteinovými barvivy
- stříbrem, „coomassie brilliant blue“
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
9
specificky:
- westernový přenos (=„immonoblotting“), tj. detekce
proteinů rozdělených elektroforézou protilátkami
- přenos rozdělených proteinů z gelu na pevný filtr
- navázání protilátky na příslušný antigen při promývání
filtru roztokem specifické
primární protilátky (protilátka musí rozeznat lineární
epitop – protein je obvykle denaturován)
- zviditelnění protilátky na filtru např.
radioaktivní sondou nebo sekundární
protilátkou konjugovanou s určitým
enzymem
Zviditelněníproteinů separovaných PAGE
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
10
Zviditelněníproteinů westernovým přenosem
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
11
- konkrétníepitopy proteinů se detekujípomocí
specifických protilátek, které slouží jako sondy
- protilátky mohou být:
Monoklonální - získávají se z hybridomů
Polyklonální - získávají se z krve
imunizovaných zvířat
Základem jsou protilátky (Ab)
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
12
Příprava monoklonálních Ab
Produkuje se pomocí hybridomů
- hybridom vzniká fůzí:
- nádorové leukemické buňky → nesmrtelnost
- B-lymfocytu imunizovaného zvířete →
produkce Ab
- drahá příprava, ale na konci téměř neomezený
zdroj Ab
- specifické pouze k jednomu epitopu
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
13
Příprava polyklonálních Ab
Získávají se ze séra imunizovaných laboratorních zvířat
- relativně levná a rychlé příprava
- reagují s více epitopy
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
14
Sendvičové uspořádání Ab
- primární Ab se váže na specifický epitop
antigenu
- značená sekundární Ab se váže na primární
protilátku
- výhoda – výroba drahých značených Ab pouze
proti malému počtu primárních Ab (anti-myší
IgG, anti-králičí IgG,…) Primary antibody
Antigen
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
15
- radioaktivně
- křenová peroxidáza (horseradish peroxidase – HRP)
- alkalická fosfatáza
- biotin
- fluorescenční značka
Typy značení sekundární Ab
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
16
- kolorimetrické metody
- chemiluminiscence
- bioluminiscence
- chemifluorescence
- fluorescence / autoradiografie
- zlatem značené Ab
Detekční metody
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
17
- rozdělení proteinů daného vzorku gelovou elektroforézou
- přenos proteinů na membránu („westernblotting“ - přesávka)
- inkubace membrány se specifickou protilátkou
- inkubace membrány se sekundární značenou protilátkou
- detekce navázané protilátky
Imunobloting
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
18
- kapilární přenos
- elektroforetický přenos
- vakuový přenos
Způsoby přenosu („blotingu“)
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
19
Výsledek Westernova přenosu
Sample: HeLa cell lysate.
Antibody: Specific for human CDK7 protein
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
20
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Využívá 2 Ab proti jednomu proteinu (2 různé epitopy),
jedna Ab je vázaná na nosiči – nejčastěji na stěně reakční
nádoby
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
21
- vysoká citlivost – pg/ml => potřeba malého množství vzorků
- možnost využití poloautomatických systémů
ELISA
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
22
Provedení ELISA
Vazba proteinu na 1. Ab
Promytí a vazba 2. Ab na protein
Promytí a detekce 2. Ab
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
23
- modifikace ELISA
- „ELISA v roztoku“
AlphaLISA
MB-2019-analýza proteinůainterakcí
24
SDS-PAGE
https://www.youtube.com/watch?v=iqTHx9aUVcY
Western blotting
https://www.youtube.com/watch?v=VgAuZ6dBOfs
ELISA
https://www.youtube.com/watch?v=849HN1ueUhs
MB-2019-analýza proteinůainterakcí