METODY ZALOŽENÉ
NA HYBRIDIZACI
NUKLEOVÝCH KYSELIN
CytDsine [c]
ÍJH-
C^N
H-C II
I I
/     C l\ H     I O H
Guanine
O
í H
r
N
I
H
Adenine |~A~|
tJH-
y"**^c*** N
Nitrogenous Bases
RNA
Nitrogenous
Bases
Bases Pair
\
Sugar ^ Phosphate backbone
DNA
[Č] Cytosine NH-
H
I
H
Guanine
0
[Ä] Adenine
■
I
H-C      II I
I
H
pF] Thymine
O
H3.C X CT VH II I
Nitrogenous Bases
HYBRIDIZACE NA
RNA strsnd DfJA strand
Nucleic Heid Hybridization
http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/nucleic.php
Southernuv prenos northern blotting (hybr. RNA) slot-, dot-, blot-hybridizace in situ hybridizace
PŘENOS DNA / RNA NA MEMBRÁNU - KAPILÁRNÍ
Weight Glass plate
Capillary blotting paper
Capillary blotting paper with wick to transfer buffer
Paper towels
Dlot membrane Agarose gel Tiansiei buffer
Support
Příprava gelu před blotováním:
DNA: kyselá depurinace (0.25 M HCI)
alkalická denaturace (0.4 M NaOH), blotování v NaOH + neutralizace (3 M NaAc, pH 5.5), blotování v 10xSSC
RNA: MÍRNÁ denaturace (0.05 M NaOH), blotování ve 20xSSC
3
PŘENOS DNA / RNA NA MEMBRÁNU - KAPILÁRNÍ
Wei a hi Glass plate
Capillary blotting paper
Capillary blotting paper with wick to transfer buffer
Paper towels
B tot membrane Agarose gel Tidnsfei buffer
Support
Přenos DNA / RNA na nylonovou membránu: (srovnání s nitrocelulózovou) mechanicky odolná
pozitivně nabité membrány, blotting v alkalickém prostředí
- kovalentní vazba DNA na membránu (UV crosslink, zapékání při 80°C) vazba krátkých fragmentů (< 50 pb) vyšší pozadí
4
PŘENOS DNA / RNA NA MEMBRÁNU - ELEKTROBLOTTING
PŘENOS DNA / RNA NA MEMBRÁNU - VAKUOVÝ
Kimura et al., Nature Protocols 2010
6
HYBRIDIZACE
V pufrech s vyšší koncentrací solí, s detergentem (SDS)
RNA: RNA   >    RNA:DNA   >    DNA: DNA Značená ssRNA: vysoká afinita k homolognímu úseku
silný signál X
citlivost próby k RNázám
HYBRIDIZACE
Teplota hybridizace:
• obsah CG
• délka hybridizační próby
• homologie mezi próbou a sekvencí na membráně
• koncentrace solí
• pH
• složení hybridizačního pufru (formamid, PEG 6000, dextransulfát)
8
HYBRIDIZACE
Teplota hybridizace a koncentrace solí:
Vodné roztoky:
Tm = 69.3 °C + 0.41(%G+C)°C
CG 40% Tm = 85.7 °C CG 45% Tm = 87.5 °C CG 60%   Tm = 93.9 °C
Roztoky solí (SSC):
EflTm = 81.5 + 16.6(logM(Na+)) + 0.41(%G+C) - 0.72(%formamide)
1% „nehomologie" snižuje Tm o 1.4 °C
Teplota hybridizace Tm - 20 °C
9
HYBRIDIZACE
Próba > 100 pb: hybridizace při ~ 65 °C Oligonukleotidy: hybridizace při ~ 55 °C
Formamid: snižuje Tm (hybridizace RNA), hybridizace při ~ 42 °C PEG 6000: 1
Dextran sulfát"   í   moleku|y PróbV síťuJ' " zvÝšení citlivosti (10-1 OOx)
Komerční hybridizační pufry: vysoce senzitivní a SPECIFICKÁ
hybridizace při nízké teplotě (42 °C)
Stringence: nastavení podmínek hybridizace a odmývání, reflektuje homologii sekvencí a typ próby
Vysoká stringence. homologní sekvence (~95%) a delší próby;
0.2xSSC, 65 °C Nízká stringence: 2xSSC, 55 - 65 °C, homologie -80%
10
HYBRIDIZACE
RNA:
RNA:RNA - vysoká Tm - hybridizační pufry s formamidem, odmývání při vysoké stringenci
Všechny reagencie a použité nádobí musí být RNase-free Hybridizace a odmývání: hybridizační pece:
Trigon Plus
HYBRIDIZACE
Detekce radioaktivního signálu:
fosfo-imagery: energie je „uložena" ve fotostimulačních krystalech (BaFBr:Eu2+)
red laser, 633 nm
unstable state
energy stored in bromine vacancies
beta energy stored during exposure
Eu3+
photons of blue light, 390 nm
Eu2+
12
ground state
Fuji-Film
HYBRIDIZACE
Detekce neradioaktivního signálu:
chemiluminiscence, fluorescence
Chemiluminiscenční substrát pro detekci alkalické fosfatázy: CDP Star (Sigma)
13
HYBRIDIZACE
Detekce neradioaktivního signálu:
chemiluminiscence, fluorescence
Chemiluminiscenční substrát pro detekci peroxidázy: Luminol
http://www.anthromed.org/Article.aspx?artpk=74
ECL - enhanced chemiluminiscence
14
VYUŽITÍ HYBRIDIZACE
• PLAQUE HYBRIDIZATION
identifikace pozitivních kolonií
hybridizace
se značenou sondou
VYUŽITÍ HYBRIDIZACE
SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM
identifikace záměn jednotlivých nukleotidů
Predispozice k chorobám, predikce odpovědi na léčbu
SNP v genu pro apolipoprotein E - predispozice pro Alzheimerovu nemoc
Bioinformatické databáze pro SNP: dbSNP (NCBI)
Human Gene Mutation Database International SNP Map
Metody analýzy: sekvenování
hybridizace
SSCP (single strand conformation polymorphism) RFLP (restriction fragments length polymorphism)
16
DETEKCE SNP
• SSCP (SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM)
https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/sscp-analysis
17
DETEKCE SNP
RFLP (RESTRICTION FRAGMENTS LENGTH POLYMORPHYSM)
NORMAL     DISEASE   NORMAL DISEASE
NORMAL Mstl restriction sites
1     1 I
Di^st, separate
DISEASE I
Mutation desirous one restriction site
Gel electrop horesis      Southern blot
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechRFLP.shtml
18
DETEKCE SNP
• RFLP (RESTRICTION FRAGMENTS LENGTH POLYMORPHYSM) identifikace ekotypů
Reveg Edge Esterase        poa alpina 4/2001        _   „   .   _   . _ Cell/2      2   3 4  5 6 7
Trisetumspicatum Koeleria'macrantha       Feshica brachyphylla
9 10 11 12 13 14 15 16    18     20 21 22 23 24 25    27     29 30 31 32 33
««•••• •
kuřin m
III 1
http://www.ecoseeds.com
19
ANALÝZA METYLACE DNA
1. Digesce metylačně citlivou reštrikční endonukleázou
2. Elfo na agarózovém gelu
3. Blotting na nylonovou membránu
4. Hybridizace s radioaktivně značenou sondou
5. Detekce signálu
20
ANALÝZA METYLACE DNA
HRS60 NTRS
Map i HpaM BstNÍ EcoRW
21
Fojtova et al., 1998
ANALÝZA METYLACE DNA
Fojtova et al., 2006
Srna I -CCCGGG
22
ANALÝZA DÉLKY TELOMER
Terminal restriction fragments (TRF)
1. Štěpení genomové DNAfrekventně štěpící RE, která nemá rozpoznávací místo v telomerové repetici (TTAGGG, TTTAGGG)
Tru I (Mse I) TTAA Hae III GGCC Rsa I GTAC
2. Elfo na agarózovém gelu
3. Blotting na nylonovou membránu
4. Hybridizace s radioaktivně značenou sodnou (telomerový oligonukleotid)
5. Detekce hybridizačního signálu
23
ANALÝZA DÉLKY TELOMER
F 385/22
- Ws
g2 g3 g4
[kh)
123412341234123
-10 - i
Telomery A. thaliana, ecotype Wassilevskija
Fojtová et al., 2011
24
ANALÝZA DÉLKY TELOMER
ANALÝZA DÉLKY TELOMER
Majerová et al., 2011
Telomery TBY-2
(suspenzní tkáňová kultura tabáku)
82kb —
48.5kb
15kb —
Roberts et al., 2011
Slezina, dospělé myši
Izolace vysokomolekulárni DNA(HMW DNA), PFGE (pulse field gel electrophoresis)
FISH - FLUORESCENČNÍ IN SITU HYBRIDIZACE
FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)
Gerse
Fixed Cells (on slides)
NICK TRANSLATION
D N Aase    L ^ (ran dg m cut} T
TT.TTT.m
\   - DJg-d UTP (of Bídí I n -dlUTP) ^     ^"^dCTP + dATP + dGTP
Denaturation (Formamtd 42*C)
j i i 11 i i i i 11 n m i i i i j ......t.............
□enaturation \
I I í i 1 I I I
Hybridization (on stítfes)
TT
n
x Vvx O/y   *        Anti bodies a nti-Oig i
/Vs- linked with a f I jo
Dig tor Avid in) linked with afluorophor
HIM LLü
.....
Efhi f I uo reacent M i eroseopy -> The gene is located
27
FISH - FLUORESCENČNÍ IN SITU HYBRIDIZACE
LNA (locked nucleic acid) sondy
Raw.
Base"
ho
OH U LNA Monomer
HQ
OH
DMA Monomer
metylénový můstek - vyšší teplotní stabilita
nižší flexibilita vyšší hybr. interakce
sekvence	bází LNA	Tm
GTGATATGC	0	29 °C
GTGATATGC	3	55 °C
GTGATATGC	9	64 °C
28
FISH - FLUORESCENČNÍ IN SITU HYBRIDIZACE
PNA (peptide nucleic acid) sondy
aase
V
Base
N —
□
NH
Sue
o
o
NH
N-(2-aminoethyl)-glycinové monomery spojené peptidovou vazbou
Silná vazba PNA:DNA (bez elektrostatické repulse) Hydrofobní
29
Telomery Nicotiana tabacum, © T. Mandáková
FISH - FLUORESCENČNÍ IN SITU HYBRIDIZACE
Identifikace intersticiálních (interních) telomerových sekvencí
Telomery A. thaliana, Široký et al., 2002
Telomery Nicotiana tabacum, © T. Mandáková
1 2 3 4 5
n
íha
IB
nic
o
I B
fflD
i a iii e
O
Uchida et al., 2002
30
KOMPARATIVNf GENOMOVA HYBRIDIZACE
Isolation ch! whole-genomic re-lmenoe DMA labsksi wrthTRiTC
COT-1 dna
Hybftdization 48-72 hours to normal rnetapJ-ase CtKjmwsOrnes
1 r™\
Gain of ON A 'is f;.i!;;:
■U
LOSS 01 DIVA snitts color lo reo
M&laphase Chromosome
X-5
Ralio Profile
ratio of intensity {greerVredj
1.0
threshold
X
qj-arm
green regions   amplified In tumor red regions . deleted io tumor yelFow regions : normal copy-number
http://atlasgeneticsoncology.org/
31
CHROMOSOME PAINTING
Vizualizace velkých chromosomových segmentů se specifickými fluorescenčně značenými DNA sondami (BAC).
Savci, ptáci, plazi, hmyz - identifikace chromozomálních aberací (diagnostika), chromosomové přestavby (evoluční studie)
Rostliny - velký počet chromosomové nespecifických signálů (vysoká komplexita rostlinných genomů)
32
CHROMOSOME PAINTING
Lysaket al. 2006
33