Daniel Renčiuk
BFU AV ČR, v.v.i.
Enzymy v molekulární biologii
VFU, Brno
10.10.2019
1
Dělení enzymů
Dle typu reakce:
• Polymerázy – syntéza nového polynukleotidového řetězce dle matrice
• Nukleázy – štěpení polynukleotidového řetězce
• Kinázy – fosforylace substrátu – připojení fosfátové skupiny na 5‘ konec
• Fosfatázy – defosforylace substrátu – odštěpení fosfátové skupiny z 5‘ konce
• Ligázy – spojení dvou konců polynukleotidového řetězce
• Transferázy – připojení funkční skupiny nebo nukleotidu (bez matrice)
Dle typu substrátu:
• DNA
• RNA
2
Terminologie
3
PO3 5‘
OH 3‘
PO3 5‘
OH 3‘
PO3 5‘
OH 3‘
Konce řetězců NK
Tupý konec (blunt end)
Lepivé /kohezivní konce
(sticky / cohesive ends)
3‘ recessed x 5‘ protruding 5‘ recessed x 3‘ protruding
Jednořetězcový zlom (single-strand break; nick) Mezera (gap)
Dvouřetězcová DNA - dsDNA
Jednořetězcová oblast v dsDNA
3‘ OH PO3 5‘
Jednořetězcová DNA - ssDNA
• syntéza nového řetězce DNA (RNA) dle matrice DNA (RNA)
• DNA polymerázy - připojováním nukleotidů k 3‘-OH primeru
• RNA polymerázy – pomocí komplementarity de novo a následně připojováním nukleotidů k 3‘-OH nukleotidů
připojených dříve
• anabolické enzymy
DNA-dependentní DNA-polymerázy
DNA polymeráza I
Klenowův fragment polymerázy I
Termostabilní DNA polymerázy – izolované z termofilních mikroorganizmů – přednáška o PCR
RNA-polymerázy
T7 RNA polymeráza
poly-A polymeráza – bez templátu
RNA-dependentní DNA-polymerázy
Reverzní transkriptáza
Polymerázy
4
• 5‘-3‘ polymerázová aktivita, 5‘-3‘ i 3‘-5‘ (proofreading) exonukleázová aktivita – převažující aktivita v závislosti na
templátu a koncentraci dNTP
• Jeden protein (109 kDa) se třemi doménami pro příslušné enzymové aktivity
• Zdroj: bakteriální, nyní jako rekombinantní protein
• Kofaktor: Mg2+
• Využití: Značení DNA („nick-translace“), syntéza dvouřetězcové cDNA, modifikace konců molekul DNA
DNA polymeráza I
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘ 5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘ OH 3‘5‘ PO3
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘
nick-translace
polymerázová + 5‘-3‘ exo aktivita
S1
S2
S3
S4
S2S1 S3 S4
Nativní gel
S2S1 S3 S4
Denaturační gel
5
• 5‘-3‘ polymerázová aktivita, pouze 3‘-5‘ exonukleázová aktivita
• Vzniká odstraněním N-koncové domény DNA polymerázy I štěpením subtilizinem
• Zdroj: nyní jako rekombinantní protein
• Kofaktor: Mg2+
• Využití: Doplnění zkrácených 3‘ konců („fill-in reaction“), syntéza dvouřetězcové cDNA, polymerase-stop assay
Klenowův fragment DNA polymerázy I
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘ 5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘ OH 3‘5‘ PO3
fill-in reakce
polymerázová aktivita
S1
S1
S3
S4
S2S1 S3 S4
Nativní gel
S2S1 S3 S4
Denaturační gel
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘
6
• Syntéza nového řetězce DNA dle matrice DNA připojováním nukleotidů k 3‘-OH primeru
• Izolace z termofilních organizmů
• Katalytická aktivita maximální při 70-80°C, klesá s klesající teplotou
• Nyní spíše rekombinantní upravené varianty s optimalizovanými vlastnostmi
• Optimalizovaná procesivita – schopnost polymerovat dlouhé molekuly DNA (desítky kb)
• Zvýšená fidelity – velmi nízká chybovost – proofreading mechanizmus
• Optimalizovaná schopnost polymerovat GC bohaté oblasti
• Kofaktor: Mg2+
• Využití: polymerázová řetězová reakce (PCR - in vitro amplifikace DNA)
Taq – Thermus aquaticus – poločas cca 1,5 h při 95°C
Pfu – Pyrococcus furiosus – extrémně přesná
Vent – Thermococcus litoralis – poločas až 7 h při 95°C
• Podrobnosti v přednášce o PCR
Termostabilní DNA polymerázy
7
• RNA-dependentní DNA-polymerázy, možná RNáza H aktivita
• syntéza nového řetězce DNA (obvykle tzv. cDNA – complementary DNA) dle matrice RNA
• Vyžaduje primer (náhodné hexanukleotidy, oligo T – pro mRNA, …)
• Zdroj: virového původu (AMV-Avian Mieloblastosis Virus; M-MuLV- Moloney Murine Leukemia Virus), nyní obvykle
rekombinantní (ProtoScript, …)
• Kofaktor: Mg2+
• Využití: syntéza cDNA
Reverzní transkriptázy
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘
S1
S1
8
• štěpení polynukleotidového řetězce DNA (RNA) od konců (exonukleázy) nebo uvnitř řetězce (endonukleázy)
• katabolické enzymy
DNA nukleázy (DNázy)
Bal31
Exonukleáza fága lambda (λ)
Nukleáza ExoIII
Dnáza I
Nukleáza S1
Restrikční endonukleázy – sekvenčně specifické - samostatná přednáška o PCR
RNA nukleázy (RNázy)
RNáza A – DNA-dependentní RNA-polymeráza
RNáza H – bez templátu
RNáza T1
Nukleázy využívané pro editaci genomu
Cas9 – CRISPR/Cas9
ZFN
TALEN
Nukleázy
9
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘
EXO
5‘-3‘
EXO
3‘-5‘
ENDO
• Primárně exonukleázová aktivita od obou konců dsDNA (5‘-3‘ i 3‘-5‘)
• Sekundární endonukleázová aktivita specifická pro jednořetězcové oblasti DNA i RNA v rámci dsDNA (zlomy, mezery, …)
• Netvoří intramolekulární zlomy v dsDNA
• Zdroj: bakterie Alteromonas esperijana
• Kofaktor: Mg2+, Ca2+
• Využití: zkracování dsDNA z obou konců, odstranění jednořetězcových oblastí z DNA:RNA hybridu
Nukleáza Bal31
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘ OH 3‘5‘ PO3S1
S2
S3
S4
S2S1 S3 S4
Nativní gel
S2S1 S3 S4
Denaturační gel
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘ 5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘ OH 3‘5‘ PO3
PO3 5‘ 3‘ OH
10
• Exonukleázová aktivita ve směru 5‘-3‘ na ds DNA, odštěpuje nukleosid-monofosfáty
• Silná preference pro 5‘ fosforylovaný řetězec, ale slabě štěpí i nefosforylovaný a jednořetězcovou DNA
• Není schopna začít štěpit v místě zlomů a mezer
• Zdroj: E. coli infikovaná bakteriofágem T4
• Využití: tvorba jednosměrných delecí, příprava ssDNA z dsDNA
Exonukleáza fága lambda (λ)
S1
S2
3‘ OH OH 5‘
OH 3‘5‘ PO3
3‘ OH OH 5‘
OH 3‘5‘ PO3
S2S1 S3 S4
Nativní gel
S2S1 S3 S4
Denaturační gel
11
• Exonukleáza postupně odbourávající nukleosid-monofosfáty z 3‘ OH konců dsDNA (3‘-5‘ exonukleáza)
• Vyžaduje tupé nebo 3‘ recesivní konce, 3‘ přesahující konce jsou rezistentní
• Schopna štěpit i v jednořetězcových zlomech, vytváří mezery
• Zdroj: E. coli
• Využití: příprava delecí, mutageneze, příprava jednořetězcových sond a substrátů pro dideoxy- sekvenování
Nukleáza ExoIII
S1
S1
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘5‘ PO3
S2S1 S3 S4
Nativní gel
S2S1 S3 S4
Denaturační gel
12
• Nespecifická endonukleáza štěpící dsDNA i ssDNA, v DNA vytváří zlomy
• Produkuje di-, tri-, tetra- nukleotid-monofosfáty fosforylované na 5‘ koncích
• Zdroj: bakterie Alteromonas esperijana
• Kofaktor: Mg2+ - náhodné zlomy v obou řetězcích, Mn2+ - zlomy v obou vláknech proti sobě
• Využití: zlomy v dsDNA při nick translaci (nízká koncentrace), vyštěpení DNA při izolaci RNA (vysoká koncentrace),
DNase footprinting (nízká koncentrace)
Dnáza I
S1
S2
13
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘5‘ PO3
S2S1 S3 S4
Nativní gel
S2S1 S3 S4
Denaturační gel
5 5 5 5
5555
S3
3‘ OH
PO3 5‘
OH 3‘
5‘ PO3
5
5
5
5
5
5
5
5
?
?
Sondování DNázou I (Dnase footprinting)
14
• Endonukleáza specificky štěpící ssDNA a jednořetězcové oblasti v rámci dsDNA
• Produkuje di-, tri-, tetra- nukleotid-monofosfáty fosforylované na 5‘ koncích
• Zdroj: bakterie Aspergillus oryzae
• Kofaktor: Zn2+
• Využití: mapování jednořetězcových oblastí DNA, zatupení kohezivních konců
• Obdobné nukleázy P1, Mung Bean atp.
Nukleáza S1
S1
15
S2
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘ 5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘ 5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘
S2S1 S3 S4
Nativní gel
S2S1 S3 S4
Denaturační gel
• Hydrolyzuje preferenčně fosfodiesterové vazby v jednořetězcové molekule RNA na 3‘ konci nespárovaných
pyrimidinových nukleotidů (U a C)
• Produktem jsem ribonukleosid-monofosfáty s fosfátovou skupinou na 3‘ konci a OH skupinou na 5‘ konci
• Neštěpí ssDNA ani dsDNA
• Kofaktor: žádné
• Zdroj: hovězí slinivka – příprava intenzivním vařením hrubého buněčného extraktu – ostatní bílkoviny denaturovány
• Využití: odstranění RNA z roztoku (izolace DNA, …), strukturní studie (nespárované úseky RNA)
RNáza A
A
U
G
5‘
3‘
N
O
O
OHOH
O
O
POH
N
O
O
OH
O
O
POH
NO
O
OH
O
OH
POH
N
N
N
N
N
O
O
N
N
N
N
O
H
H
H
H
H
H
A
U
OH
O
O
POH
N
O
O
OH
O
O
POH
NO
O
OH
O
OH
POH
N
N
N
N
N
O
O
H
H
H
G
OH
N
O
OHOH
N
N
N
N
O
H
H
H
16
• Sekvenčně nespecificky hydrolyzuje preferenčně fosfodiesterové vazby v RNA molekule párované s DNA molekulou
(hybrid RNA:DNA)
• Produktem jsem ribonukleosid-monofosfáty s fosfátovou skupinou na 5‘ konci a OH skupinou na 3‘ konci
• Neštěpí ssDNA ani dsDNA
• Kofaktor: Mg2+
• Zdroj: E. coli
RNáza H
N
O
O
OHOH
O
O
POH
N
O
O
OH
O
O
POH
NO
O
OH
O
OH
POH
N
N
N
N
N
O
O
N
N
N
N
O
H
H
H
H
H
H
N N
N
O
H
H
N
N
N
N
N
H
H
N
N
O
O
CH3
H
O
O
OH
OH
O
O
P
O
O OH
O
O
P
O
O OH
O
OH
P
A
U
G
A
T
C
5‘
5‘
3‘
3‘
N N
N
O
H
H
N
N
N
N
N
H
H
N
N
O
O
CH3
H
O
O
OH
OH
O
O
P
O
O OH
O
O
P
O
O OH
O
OH
P
N
O
O
OHOH
O
POH N
N
N
N
O
H
H
H
OH
OH
N
O
O
OH
O
POH
N
O
O
H
OH
OH
NO
O
OH
O
OH
POH
N
N
N
N
H
H
A
U
G
A
T
C
5‘
3‘
17
• Hydrolyzuje preferenčně fosfodiesterové vazby v jednořetězcové molekule RNA na 3‘ konci guanosinových zbytků
• Produktem jsou oligoribonukleotidy končící G s fosfátovou skupinou na 3‘ konci a OH skupinou na 5‘ konci, případně
GMP (s PO4 na 3‘ konci)
• Neštěpí ssDNA ani dsDNA
• Kofaktor: žádné
• Zdroj: Aspergillus oryzae, dnes rekombinantní protein produkovaný E. coli
• Využití: strukturní studie RNA, sekvenování RNA
RNáza T1
OH
N
O
O
OHO
O
O
POH
N
O
O
OH
O
POH
N
O
O
N
N
N
N
O
H
H
H
H
NO
O
OHO
O
POH
N
N
N
N
O
H
H
H
OH
NO
O
OH
O
POH
N
N
N N
H
H
A
U
G
5‘
3‘
G
OH
OH
NO
OH
N
N
N N
H
H
A
OH
NO
CH3
OHO
N
N
N
N
O
H
H
H
O
POH
G
OH
OH
N
O
O
OHO
O
O
POH
N
O
O
OH
O
POH
N
O
O
N
N
N
N
O
H
H
H
H
O
POH
U
G
18
Cas9 nukleázy – CRISPR/Cas9
19
{New England Biolabs; https://www.neb.com/products/m0386-cas9-nuclease-s-pyogenes#Product%20Information}
Cas9 nukleázy – CRISPR/Cas9 – Genome editing
20
A. Wild-type Cas9 nuclease site specifically cleaves double-stranded DNA activating double-strand break repair machinery. In the absence of
a homologous repair template non-homologous end joining can result in indels disrupting the target sequence. Alternatively, precise
mutations and knock-ins can be made by providing a homologous repair template and exploiting the homology directed repair pathway.
B. Mutated Cas9 makes a site specific single-strand nick. Two sgRNA can be used to introduce a staggered double-stranded break which can
then undergo homology directed repair.
C. Nuclease-deficient Cas9 can be fused with various effector domains allowing specific localization. For example, transcriptional activators,
repressors, and fluorescent proteins.
{New England Biolabs; https://www.neb.com/products/m0386-cas9-nuclease-s-pyogenes#Product%20Information}
{https://www.scbt.com/scbt/whats-
new/crispr-systems}
ZFN nukleázy – Genome editing
21
ZFN-mediated genome editing takes place in the nucleus when a ZFN pair targeting the user’s gene of interest is
delivered into a parental cell line, either by transfection, electroporation or viral delivery.
{Sigma-Aldrich; https://www.sigmaaldrich.com/life-science/zinc-finger-nuclease-technology/learning-center/what-is-zfn.html}
Each Zinc Finger Nuclease (ZFN) consists of two functional
domains: a.) A DNA-binding domain comprised of a chain of twofinger
modules, each recognizing a unique hexamer (6 bp)
sequence of DNA. Two-finger modules are stitched together to
form a Zinc Finger Protein, each with specificity of ≥ 24 bp. b.) A
DNA-cleaving domain comprised of the nuclease domain of Fok I.
When the DNA-binding and DNA-cleaving domains are fused
together, a highly-specific pair of 'genomic scissors' are created.
TALEN nukleázy – Genome editing
22
Transcription Activator-Like Effector Nucleases
a | Schematic diagram of a TALEN. TALE repeats are shown as colored
cylinders with a final carboxy-terminal truncated “half” repeat. Letters
inside each repeat represent the two hypervariable residues. TALE-derived
amino- and carboxy-terminal domains required for DNA-binding activity
are shown as longer blue and grey cylinders, respectively. The non-specific
nuclease domain from the FokI endonuclease is shown as a larger orange
cylinder. b | TALENs bind and cleave as dimers on a target DNA site. Note
that the TALE-derived amino- and carboxy-terminal domains flanking the
repeats may make some contacts to the DNA. Cleavage by the FokI
domains occurs in the “spacer” sequence that lies between the two
regions of the DNA bound by the two TALEN monomers. c | Schematic
diagram of a TALE-derived DNA-binding domain. The amino acid sequence
of a single TALE repeat is expanded below with the two hypervariable
residues highlighted in orange and bold text. d | TALE-derived DNAbinding
domain aligned with its target DNA sequence. Note the matching
of repeat domains to single bases in the target site according to the TALE
code. Also note the presence of a 5’ thymine preceding the first base
bound by a TALE repeat.
{J.K. Joung a J.D. Sander, Nat Rev Mol Cell Biol (2013)}
Cas13 nukleázy – Genome editing
23
{D. B. T. Cox et al., Science 10.1126/science.aaq0180 (2017)}
A) Schematic of RNA editing by dCas13b-ADARDD fusion proteins. Catalytically dead Cas13b (dCas13b) is fused to the deaminase
domain of human ADAR (ADARDD), which naturally deaminates adenosines to insosines in dsRNA. The crRNA specifies the target
site by hybridizing to the bases surrounding the target adenosine, creating a dsRNA structure for editing, and recruiting the
dCas13b-ADARDD fusion. A mismatched cytidine in the crRNA opposite the target adenosine enhances the editing reaction,
promoting target adenosine deamination to inosine, a base that functionally mimics guanosine in many cellular reactions.
B) Schematic of Cypridina luciferase W85X target and targeting guide design. Deamination of the target adenosine restores the
stop codon to the wildtype tryptophan. Spacer length is the region of the guide that contains homology to the target sequence.
Mismatch distance is the number of bases between the 3’ end of the spacer and the mismatched cytidine. The cytidine
mismatched base is included as part of the mismatch distance calculation.
Komplex katalyticky inaktivní nukleázy Cas13 (dCas13b) s guide RNA a RNA-specifické Adenosin Deaminázy ADAR) místně specificky
(primární sekvence z gRNA, rozpoznána Cas13) katalyzuje deaminaci A na I (ADAR), který funguje jako G
Genome editing
24
{A.A. Nemudryi et al., Acta Naturae (2014)}
A general scheme of the strategy for using the TALEN and CRISPR/Cas systems in genomic engineering
Další enzymy
25
Ligázy – spojování fragmentů nukleových kyselin
T4 DNA ligáza
Transferázy – připojování funkčních skupin a nukleotidů bez templátu
Terminální transferáza (TdT)
DNA metyltransferázy (DNA MTase) – metylace DNA – obvykle na C
Kinázy – připojení fosfátové skupiny
T4 polynukleotid kináza
Fosfatázy – odštěpení fosfátové skupiny
Alkalická fosfatáza
• Spojuje dva konce polynukleotidového řetězce DNA, tupé i lepivé konce
• Vyžaduje přítomnost OH skupiny na 3‘ konci a fosfátové skupiny na 5‘ konci v místě spojení
• Nutné ATP nebo NAD jako zdroj energie pro vytvoření fosfodiesterové vazby
• Zdroj: E. coli infikovaná bakteriofágem T4
• Opravuje jednořetězcové zářezy („nick“) v dsDNA, RNA i DNA/RNA hybridech
T4 DNA ligáza
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
S1
S2
S3
S4
S2S1 S3 S4
Nativní gel
Spojení lepivých konců Oprava tupých konců
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘
26
OH 3‘
5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘
T4 DNA ligáza
{New England Biolabs; www.neb.com}
27
Úprava konců ligací
28
Adaptory Linkery
• Ligázou připojené krátké fragmenty dsDNA
• Specifický výběr modifikovaného konce zajištěn příslušnou fosforylací – T4 DNA ligáza preferenčně spojuje s
fosforylovaným 5‘ koncem
PO3 5‘
OH 3‘
PO3 5‘
OH 3‘
• Mění tupý konec na lepivý
• Specifická sekvence a směr
• Pro připojení inzertu, primeru, …
• Vnáší na konec specifickou sekvenci
• Pro štěpení restrikční endonukleázou
• Pro připojení primeru - PCR
PO3 5‘
OH 3‘
Restrikční místo
• Přidání deoxynukleotidů k 3‘ OH skupině bez nutnosti matrice
• Substrátem jsou jak ssDNA, tak tupé recesivní i přesahující konce dsDNA
• Zdroj: např. hovězí brzlík, nyní rekombinantní v E. coli
• Kofaktor: Mg2+, Co2+ - zvyšuje aktivitu
• Využití: 3‘ terminální značení DNA, přidávání homopolymerních konců, klonování
pomocí TdT, …
Terminální transferáza (TdT)
S1
S2
29
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘5‘ PO3
3‘ OH PO3 5‘
OH 3‘5‘ PO3
• Katalyzuje přesun (forward reaction) nebo výměnu (exchange reaction) γ fosfátu z ATP na 5‘ konec ssDNA, dsDNA, RNA
i dNTP
• Exchange reakce probíhá s nižší efektivitou – pro značení vhodnější defosforylace, pokud je 5‘ konec fosforylován
• Zlomy nejsou výrazněji fosforylovány, mezery ano za vyšší koncentrace ATP
• ATP může být nahrazeno jinými NTP, popřípadě dATP, dTTP
• Zdroj: nyní rekombinantní v E. coli
• Kofaktor: Mg2+
• Využití: 5‘ terminální značení DNA, fosforylace 5‘ konce, odstraňování 3‘ fosfátu z DNA
T4 polynukleotid kináza (T4 PNK)
30
N
O
O
OHOH
P
O
OH
P
O
O
OH
OH
OH
O
O
P N
N
N
NH2
N
N
O
O
O
O
O
P
OH
O
OH
N
N
N
N
O
H
H H
N
O
O
OH
O
P
OH
N
N
N
N
O
H
H H
N
HO
O
CH3
N
N
O
O
O
O
O
P
OH
O
O
N
N
N
N
O
H
H H
N
O
O
OH
O
P
OH
N
N
N
N
O
H
H H
N
HO
O
CH3
OH
O
P
OH
N
N
O
O
O
O
O
P
OH
O
O
N
N
N
N
O
H
H H
N
O
O
OH
O
P
OH
N
N
N
N
O
H
H H
N
HO
O
CH3
OH
O
P
OH
FORWARDEXCHANGE
T4 polynukleotid kináza (T4 PNK)
31
{New England Biolabs; https://www.neb.com/products/m0290-alkaline-phosphatase-calf-intestinal-cip#Product%20Information}
• Katalyzuje odstranění fosfátu z 5‘ i 3‘ konce ssDNA, dsDNA (recesivní, přesahující i tupé konce), RNA, dNTP
• Defosforyluje i proteiny (Ser, Thr, Tyr)
• Zdroj: telecí střevo (CIP) – aktivnější, těžko kontrolovatelná, E. coli (BAP) – méně aktivní
• Kofaktor: Mg2+,
• Využití: defosforylace fragmentů při klonování, značení T4 PNK, odstranění dNTP z reakce
Alkalická fosfatáza
32
N
N
O
O
O
O
O
P
OH
O
O
N
N
N
N
O
H
H H
N
O
O
OH
O
P
OH
N
N
N
N
O
H
H H
N
HO
O
CH3
OH
O
P
OH
N
N
O
O
O
O
O
P
OH
O
OH
N
N
N
N
O
H
H H
N
O
O
OH
O
P
OH
N
N
N
N
O
H
H H
N
HO
O
CH3
Klonování
{New England Biolabs; www.neb.com}