Design léčiv založený na molekulových fragmentech O OH O NH2 NH2 N Design léčiv založený na molekulových fragmentech ● Nový směr zaváděný v posledních 13 letech v předních farmaceutických společnostech nebo specializovaných high-tech. Firmách ● Využívá nejnovějších vědeckých poznatků a technologií z oblastí genetiky, molekulární biologie, proteinové krystalografie a/nebo NMR spektroskopie, bio-informatiky a počítačové chemie (modelování, docking) Tradiční design léčiv ● Trtadiční recepty a náhodné objevy ● Kombinatorní chemie, přírodní sloučeniny ● Screening (ultra high-throuput screening, HTS), "hit" → "lead compound" ● Knihovny sloučenin - řádově milion sloučenin ve farmceutických společnostech Typické vlastnosti orálních léčiv ● Typická molekulová hmotnost 350-450 ● Afinita k proteinu, inhibice IC50 50 nM ● Pravidlo 5-ti ● Definovaný počet rotačních vazeb ● Optimalizace léčiva je provázena obyčejně zvyšováním mol. hmotnosti Pravidlo 5 ● Ch.A.Lipinski, 1997. Orální léčiva. ● Ne více než 5 vodíkových donorů (OH, NH) ● Ne více než 10 (2x5) HB akceptorů (N a O atomy) ● Molekulová hmotnost pod 500 ● ClogP pod 5 High-Throughput Screening, HTS Je potřebný screening až milionu sloučenin aby se pozorovala nějaká aktivita vůči proteinu vázaného na nějakou nemoc Limity HTS ● Automaty. Složitá a nákladná metoda ● Málo produktivní - vysoká "úmrtnost" hitů ● Knihovna sloučenin - zlomek chemického prostoru (drug-like space). 30 nevodíkových atomů - 1060 sloučenin ● Nepřinesla snížení nákladů NCE/(milion $) ● Na 5000 sloučenin, pouze 5 - klinické pokusy ● Z těch pouze 5-20% jde na trh. ● Náklady $800 mil. Cíle – objekty (targets) Cíle – objekty (targets) ● Často slabé binární komplexy vedou k stabilním nultiproteinovým komplexům. ● Mnoho objektů je možné nalézt mezi multiproteinovými komplexy buňkové signalizace a regulace Genomika ● „Human genome project“ mapuje geny lidské DNA. ● Ve všeobecnosti věříme, že toto poznání bude poskytovat daleko více potenciálních proteinových cílů. ● Strukturní genomika – funkce genu, určená ze struktury Genomika Identifikace cílů ● Funkční genomika - identifikace potenciálních terapeutických proteinových cílů - obrovské množství cílů ● Strukturní genomika - hledá vztahy mezi sekvencí a strukturou a vztah mezi strukturou a biologickou funkcí ● Konstantní růst PDB. Strukturní biologie a objevy léčiv Metoda fragmentů Definice fragmentu ● Men.islou.enina (Pravidlo 3. Men. ne. 300 Da. Typicky 150-250. ClogP 3, ne vice ne. 3 HB donory a akceptory. ● St.edni urove. afinity (100ĘM-1mM)ƒ ● HTS. Men.i knihovna slou.enin, men.i afinita. (Graffinity knihovna - 20 000 fragment., 40nmol/slou.enina). ● Biofyzikalni screening: NMR, X-ray, MS ● Ligand-protein vazebna mista Výhody metody fragmentů ● Menší knihovna pokryje větší část chemického prostoru. ● 100 fragmentů (při třech fragmentech na sloučeninu) pokryje 1 milion kombinací ● Fragment je možné identifikovat pomocí proteinové krystalografie i když biologický screening nedává hit k vůli nedostatečné funkčnosti ● Fragmenty je možné hledat "in silico" např. pomocí programu GOLD (virtual screening) v aktivním místě Screening ● Screening fragmentů proti proteinovým objektům (targets) ● Používají se následující techniky: ● rtg. krystalografie (proteinová krystalografie) ● NMR spektroskopie (Water LOGSY) ● Isotermální titrační kalorimetrie ● Surface plasmon resonance ● Nekovalentní hmotnostní spektroskopie (MS) Screening NMR Screening ● NMR je nejproduktivnější metoda ● SAR pomocí NMR, (SAR = structure activity relationship) ● Interpretace je někdy subjektivní ● Není dostatečně automatická ● Abbott laboratories, Novartis, Vertex Pharmaceuticals, Hoffmann-La Roche, Triad Therapeutics NMR screening koktejl tří fragmentů 0.5 mM + enzyme 20 mM Pouze fragment 1 + enzyme (diference) X-ray screening ● Nejlepší na studium interakcí protein-ligand ● Vysoký stupeň automatizace ● Vizualizace interakcí fragmentu s objektem, možnost počítačového do-modelování ● Vyloučí se nespecifická afinita. V krystale se vazba uskutečňuje na každou molekulu ● Potřeba synchrotronu ● Astex Therapeutics (Technology), Abbott Laboratories, Structural GenomiX (SD CA) Astex facilities Strukturní screening fragmentů Strukturní screening fragmentů ● 100R1x100R2x100R3 = 1,000,000 cmpds ● Vyšší pravděpodobnost úspěchu ● Nalezení nových struktur (mM) ● Kvalitní data o zkoumané struktuře (validate/prioritise the hits) ● Rychlá optimalizace struktury ● Velký prostor k optimalizaci X-ray screening X-ray screening X-ray screening ● 4-10 sloučenin na koktejl Koncentrace 25- 50mM na sloučeninu Krystal se pomoří do koktejlu Krystal si vybere sám aktivní sloučeninu Identifikace v elektronové hustotě Definice X-ray procesu ● Potřeba 10-100 mg purifikovaného proteinu. Počet proteinových krystalů 100. ● Každý krystal se nasákne (soaking) koktejlem z 5-10 fragmentů. ● Krystal se namontuje, rychle zmrazí (flash cooling, cryo-crystallography) Definice X-ray procesu (pokračování) ● provede se automatické, vysokorychlostní difrakční měření a zpracování dat na synchrotronu (v Argonne National Lab. je možné provést X-ray screen 1000 sloučenin v průběhu 24-48 hodin) ● Rozumné rychlosti je možné dosáhnout i pomocí nových generátorů s optickou fokusací (54 krystalů/80h na Rigaku FR-E Superbright). ● Navázání fragmentu se projeví změnou difrakčního obrazce. Diferenční mapa ukáže navázaný ligand Krystalizační protokol (PixSys) Astex facilities – X-ray analysis Spojování a optimalizace fragmentů ● Dva různé fragmenty v dvou různých polohách aktivního místa. Spojovací molekula (spacer) ● Self-assembly - samospojování v aktivním místě (templátová metoda). Protein katalyzuje syntézu vlastního inhibitoru, případně si sám vyselektuje fragmenty, které se dají spojit. ● Mapování vazebných míst receptoru pomocí specializovaných malých fragmentů pro SAR (analogie prób v GOLD). ● Spojením fragmentů se získá na entropii. ● Potence se zvýší o 3-5 řádů. Fragment→lead. Spojování a optimalizace fragmentů Spojování a optimalizace fragmentů Optimalizace ● Znalost způsobu, jak se fragment váže na proteinový cíl umožňuje fragment zvětšovat. ● Používají se počítačové metody ● Docking ● „Experimentální“ metody Isostar, Superstar, Gold suite Gold - docking ● Protein-ligand docking ● GlaxoSmithKline, U.Sheffield, CCDC ● Úplná flexibilita ligandu, parciální proteinu ● Energetické funkce založené na IsoStar ● Diskriminace mezi aktivními a neaktivními sloučeninami ● Goldmine – decriptors (obsazený objem…) Gold - docking Gold - docking Výhody a nevýhody ● Malý fragment má větší šanci, že se lépe zabuduje do vazebného místa cílového proteinu, než hotová molekula. ● Fragmenty mají vyšší vazebnou energii na jednotku hmotnosti. ● Screening malých fragmentů vede k většímu počtu "hitů". Počet fragmentů je na úrovni 100 - 1000 (v porovnání s milionem u HTS). Výhody a nevýhody ● "Leads" z fragmentů mají nižší úmrtnost. 70% hitů z HTS selže, 80% FSDD hitů je úspěšných. ● Umožňuje objevit "lead", kde HTS selhal ● Je možné získat lead mimo oblast standardní databáze a tím získat sloučeninu, která je patentovatelná.