Imunohistochemické metody
-stanovení Ag či Ab
Reakce:
Ag + Ab → IK- imunokomplex
- jeden z reaktantů nese značku:
-radioaktivní (RIA)
-fluorescenční (FIA)
-enzymatickou (EIA)
-a další
13_B 1
ELISA (angl. zkratka enzyme-linked immuno
sorbent assay), známá také jako EIA (angl.
zkratka enzyme immunoassay)
je analytická metoda využívaná ke kvantitativnímu stanovení různých
antigenů/Ab.
Tato metoda má řadu variant.
Všechny jsou založeny na vysoce specifické interakci antigenu a protilátky,
přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navázán enzym (nejčastěji
peroxidáza nebo alkalická fosfatáza).
Enzym katalyzuje chemickou přeměnu substrátu, který je přidán do reakční
směsi, na produkt, který je barevný. Stanovuje se pak spektrofotometricky (viz
chromogenní substrát), nebo na základě fluorescence (fluorimetrické stanovení).
Koncentrace produktu je úměrná koncentraci antigenu nebo protilátky ve
vzorku.
Dalším společným znakem metod ELISA je zakotvení (adsorpce nebo kovalentní
navázání) antigenu nebo protilátky na nerozpustný nosič (často povrch reakční
nádobky nebo mikrotitrační destičky), což usnadňuje separaci imunochemicky
navázaných molekul.
TEST13_B 2
Sendvičová ELISA
A: Standardní sendvičová ELISA na zjištění koncentrace
antigenu:
1.navázání protilátky na dno zkumavky
2.přidání vzorku a inkubace – dochází ke vzniku vazby
antigen-protilátka
3.odmytí nenavázaného antigenu
4.přidání druhé protilátky, vázající stejný antigen, na které
je kovalentně připojen enzym
5.inkubace a odmytí nadbytečné protilátky s enzymem
6.přidání substrátu a průběh enzymem katalyzované reakce
7.zastavení reakce a měření
Jako sendvičová se nazývá proto, že antigen je jako sendvič
mezi dvěma protilátkami.
TEST
13_B 3
B: Obdobně lze reakci provést na detekci protilátek ve vzorku. To
probíhá obdobně, jen je v 1. kroku navázán na zkumavku antigen a druhá
protilátka je proti hledané protilátce. Tato metoda se označuje jako
cature ELISA.
capture ELISA
13_B 4
EIA, IMUNOENZYMOVÉ
METODY
 Podstata: tyto metody pracují také s antigenem a
protilátkou, které však stanovují na základě
označení jednoho z reaktantů enzymem.
 Výhody: ekonomičtější (levnější než RIA), časově
méně náročná, citlivost (např. Ag s Mr 10 000 lze
určovat už při koncentraci 10pg/ml, 10-12 mol/l),
vysoká specifita). Jsou vhodné pro automatizaci a
vyhodnocení přes počítač, bezpečnější, delší doba
expirace, lepší kontrolovatelnost reakce
13_B 5
Dělení EIA:
podle toho, zda aktivita enzymu v konjugátu
zůstane nezměněná nebo jestli se změní,
oddělování složek
homogenní EIA: katalytická aktivita
v konjugátu (AgE,HE) ve vazbě (po vazbě)
s Ab se mění
heterogenní EIA: katalytická aktivita
v konjugátu s Ab se nemění
13_B 6
Homogenní EIA ( – enzyme
immunoassay technique):
 při této metodě se nemusí oddělovat volný
reaktant od reaktantu vázaného v
v imunokomplexu – metoda má 1 krok → je
homogenní
 enzymová aktivita konjugátu se po vazbě na Ab
může snížit nebo zvýšit
 Princip: enzymová aktivita volného konjugátu
enzymu je jiná než aktivita komplexu konjugátprotilátka
(v případě AgE,HE).
13_B 7
 Necháme-li zreagovat směs známého zn
množství enzymem značeného haptenu
(AgE,HE) a neznámého množství
neoznačeného haptenu (Ag,H) s limitovaným
množstvím Ab, aktivita enzymu je přímo
úměrná množství konjugátu navázaného na
protilátku.
HEzn + H + Ab → HE-Ab + H-Ab
limit.množ. aktivita E je úměrná
množství konjugátu navázaného na Ab
13_B 8
Schéma homogenní EIA
-varianty reaktivity a nereaktivity
A)Enzymová aktivita konjugátu po vazbě
na Ab se inhibuje:
 substrát se může vázat
na katalytické místo
enzymu a lze tuto
aktivitu měřit
E + H + S → aktivita
13_B 9
protilátka se navázala na
konjugát E + H. Zabránila
tak přístupu substrátu ke
katalytickému místu
enzymu. E aktivitu nelze
měřit (inhibice).
EH + Ab = EH-Ab → bez aktivity
13_B 10
 Přidaný volný H vytěsní
z vazbových míst
protilátky konjugát EH
a tím se uvolní
katalytické místo pro
S a Enzymová aktivita
se obnoví
EH – Ab + H → EH + H – Ab → aktivita se obnoví
13_B 11
B) Enzymová aktivita konjugátu po vazbě
na Ab se aktivuje
 substrát se nemůže
navázat na katalytické
místo enzymu, neboť
vazbou H vznikly
v molekule enzymu také
konformační změny, které
znemožňují vazbu. E
aktivita je neměřitelná.
13_B 12
Vazbou haptenu na Ab
vznikly opět
konformační změny,
které umožňují přístup
substrátu ke
katalytickému místu. E
aktivita je měřitelná.
13_B 13
 Použitý enzym: lysozym, malátdehydrogenáza,
glukózo-6-fosfátdehydrogenáza.
 Použití: na kvantitativní stanovení především
nízkomolekulárních látek (haptenů), např.
určení koncentrace antibiotik, omamných látek,
hypnotik, sedativ, kardiotonik, cytostatik a
hormonů jako tyrozin, trijódtyronin, kortizol aj.
 Výhoda: jednoduchost, rychlost (trvá několik
minut) – heterogenní trvá několik hodin.
 Nevýhoda: nižší citlivost, složitá příprava
reagencí
Další vlastnoti homogenní EIA
13_B 14
Heterogenní EIA
 Zde se musí oddělit volný reaktant od značeného reaktantu
vázaného v komplexu s Ab. Technika je dvoustupňová –
heterogenní.
 Způsob oddělení:
1. precipitací imunokomplexů polyetylenglykolem
2. pomocí druhé – sekundární Ab
3. nejčastější: imobilizací jedné z dvojic reaktantů navázáním na
tuhý nosič (stěna zkumavky, jamka destičky). Oddělení volné a
vázané označené složky se uskutečňuje promytím. Jde o princip
imunoadsorbentové analýzy = ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT ASSAY = ELISA
 Požadované vlastnosti enzymů: malá Mr, vysoká stabilita a
enzymová aktivita, kovalentní vazba na Ab, hapteny, Ag,
produkt enzymové reakce musí být dostatečně barevný či jinak
detekovatelný, levný , dostupný.
 Používané enzymy: peroxidáza (křenová), alkalická fosfatáza,
β-D-galaktozidáza 13_B 15
Základní složky systému ELISA
 Imunosorbční povrch (pevná fáze): používá se upravený
polystyrén ve formě mikrotitračních destiček, kuliček,
hřebenů, pruhů. Důležitá je vhodná polymerizační teplota
a délka polymerizace. Při přehnaně vysokých sorbčních
vlastnostech by docházelo k navázání nežádoucích látek,
a tím ke snížení citlivosti a specifity reakce. Při nízkých
sorbčních vlastnostech by nezabezpečovalo dostatečně
souvislý a stabilní imunosorbční povrch (nestabilita a
nespolehlivost systému vede k snížení citlivosti a
reprodukovatelnosti). Používá se koncentrace 1 –
10mikrogramů/ml proteinu v karbonátovém pufru o urč.
pH
Imobilizace antigenu na pevný nosič
Antigen se váže pasivní adsorpcí, proces se nazývá coating-
koutování
Používají se destičky s plochým dnem kvůli fotometrickému
stanovení
13_B 16
 Vazba proteinů je ovlivněna: kapacitou adsorpce,
povahou proteinů, teplotou a pH vazebného roztoku,
dobou adsorpce a koncentrací vazebného proteinu
 Promývání-účelem je oddělit navázané a nenavázané
reagenty, promývá se 3x, nesmí vzniknout bubliny-brání
kontaktu promývacího roztoku s povrchem buněk
 Blokování- k eliminaci nespecifických vazeb mezi proteiny
a volnými vazebnými místy, blokovací roztoky obsahují:
hovězí sérový albumin nebo kasein, želatina, sušené mléko
atd
 Konjugát: specifická Ab (mono- nebo polyklonální) s
vhodným navázaným enzymem.Ten pak reaguje se
substrátem a vytváří v přítomnosti vhodného chromogenu
dostatečně intenzívní barevnou reakci.
 Zastavení reakce: v době, kdy se vztah mezi enzymem,
substrátem a produktem nachází v lineární fázi silnou
kyselinou či zásadou. Způsobí denaturaci enzymů.
Přidáním zastavovacího roztoku se mění absorbční
spektrum produktu
13_B 17
 Substrát: při použití konjugátu s peroxidázou
jako chromogen slouží (ortofenylén- diamin
hydrochlorid = OPD, kyselina aminosalicylová,
atd) které v přítomnosti peroxidu vodíku jako
substrátu – katalyzátoru vyvolají barevnou
reakci.
 Přístroje: ELISA – reader je spektrofotometr
upravený na odečítání absorbance v reakčních
jamkách. Filtry jsou nastavené s volitelnou
vlnovou délkou optimální pro určitý ELISA
systém (obvykle mezi 405 až 570 nm)
v závislosti na typu použitého konjugátu a
substrátovo - chromogenním roztoku.
13_B 18
Hodnocení a standardizace testů
 Nesledujeme absolutní hodnotu absorbance, ale její přírustek k
blanku
 Vzorky můžeme testovat kvalitativním i kvantitativním způsobem
 Kvalitativní: je třeba znát pozitivní, negativní kontroly a hraniční
hodnotu (cut off). Za pozitivní lze považovat hodnoty statisticky
odlišitelné od vzorku s nulovou koncentrací vyšetřovaného agens.
 V praxi se hraniční vzorek stanoví vyšetřením několika desítek
hraničních kontrol, 1. pak se uvažuje hodnota X +3sd (X je hodnota
negativní kontroly) (sd směrodatná odchylka), 2. neg. kontrola se násobí číslem2,1
 3. Hodnoty de vloží do grafu a vypočítají se intervaly podle
průměru hodnot
 Kvantitativní: využívají se kalibrační křivky vzorku. Vzorek je nutné
vyšetřovat ve dvou nebo více zředěních, aby bylo jisté, že se
koncentrace Ag ve vzorku nachází v oblasti kalibrační křivky.
13_B 19
 Typy ELISA:
 kompetitivní ELISA pro Ag nebo hapteny
 sendvičová ELISA pro Ag (kompetitivní a
nekompetitivní)
 nepřímá ELISA pro Ag
 sendvičová ELISA pro Ab = nepřímá pro Ab
 ELISA pro zachycení IgM
 Použití:
 při průkazu neinfekčních Ag – hormony -inzulin, α-
fetoprotein
 Stanovení autoprotilátek
 Průkaz virů, bakterií a parazitických nákaz
 Při diagnostice onemocnění vyvolaných obtížně
kultivovatelnými původci (viry hepatitidy, borrelie,
mykoplazmata atd.)
13_B 20
Kompetitivní ELISA pro Ag a nebo hapteny –
stanovení Ag
Na tuhou látku
se naváže Ab
specifická pro
Ag, který se má
stanovit
Pak se přidá známé
množství enzymem
značeného Ag (AgE) a
buď známé
(standardní) množství
nebo neznámé
(analyzované) množství
neoznačeného Ag (Ag)
V průběhu inkubace
soutěží značený
s neoznačeným
(standardním čí
zkoumaným) Ag. Po
promytí zůstávají jen
Ag vázané na Ab.
Pak se přidá roztok
substrátu, který
enzym přítomný
v imunokomplexec
h rozloží za vzniku
barevného
produktu
13_B 21
Legenda:
 Intenzita (absorbance) zbarvení roztoku
s produktem enzymové reakce se měří
spektrofotometricky. Z hodnot absorbancí
naměřených v jamkách se známým
(standardním) množstvím Ag se sestrojí
analytická čára (kalibrační křivka), pomocí které
se určí koncentrace analyzovaných roztoků Ag.
 Použití: na kvantitativní stanovení nízko- i
vysokomolekulárních látek (stanovení hormonů:
tyrozin, trijódtyrozin, prolakton, inzulin atd, léků:
teofylin, dioxin aj., a proteinů: IgE, AFP alfa
fetoprotein, CEA cefalosporin A)13_B 22
Sendvičová ELISA pro antigeny
Na tuhou fázi
se naváže
Ab.
Na ni se potom
navazuje známé
nebo neznámé
množství
antigenu.
Promytí.
Přidá se volná enzymem
značená Ab, která reaguje
s volnými hapteny antigenu
imobilizovaného vazbou do
komplexu s Ab. Inkubace,
promytí, přidání S.
Přidá se substrát
na detekci
enzymové
aktivity.
13_B 23
Legenda:
 Z naměřených hodnot standardních vzorků se
sestrojí analytická čára (kalibrační křivka), podle
které se vyhodnotí vzorky s neznámou
koncentrací zkoumaného Ag.
 Výhoda: nemusí být k dispozici značený čistý Ag.
Stačí jen standardní Ag třeba i ve složité směsi
jiných Ag (například lidské sérum). Musí v něm
však být přesně známý obsah analyzovaného Ag.
Ab se může označovat enzymem vždy tou
stejnou konjugační reakcí.
 Nutnost: obě Ab musí mít stejnou specifickost. Ag
musí mít nejméně 2 determinanty (reagují s ním
2 molekuly Ab). 13_B 24
Nepřímá ELISA pro antigeny,
(kompetitivní), určení % inhibice
Ag se naváže na
tuhou fázi a reakční
prostor se promyje.
Pokud jde o malý Ag,
naváže se předem na
větší nosič, např.
BSA.
Zkoumaný roztok, ve
kterém se
předpokládá
přítomnost Ag, se
míchá se specificky
značenou Ab a směs
se inkubuje
s imobilizovaným Ag.
Inkubace, promytí a
přidání substrátu,
čímž se vyvolá
barevná reakce.
13_B 25
Legenda:
 Rozdíl naměřené absorbance ve vzorku s volným Ag a
v kontrolní jamce (bez volného Ag) určuje množství Ag ve
zkoumaném vzorku. Je to kompetitivní ELISA, ve které o
vazbová místa Ab soutěží Ag ve zkoumaném vzorku (volný)
a Ag imobilizovaný. Čím víc Ag bude ve vzorku, tím méně
Ab se může navázat na imobilizovaný Ag a tím menší
barevná intenzita bude v reakčním roztoku. Nejvíce
zbarvený roztok bude v kontrolní jamce, kde reakční směs
neobsahovala volný Ag.
 Modifikace: místo označené Ab se použije neoznačená Ab
(např. králičí IgG) a imobilizované Ag se detekují pomocí
označeného Ig ve funkci sekundární Ab (např. prasečího
IgG proti králičímu IgG).
Ag + (sérum+Ag) +AbE + S →barevná reakce
virus + (IgG + Ag)+anti IgGE + S →barevná reakce
 Výhoda: možnost použití komerčně dostupné označené Ab.
13_B 26
Sendvičová ELISA pro protilátky
Neboli nepřímá ELISA na detekci Ab – slouží na důkaz neboli titraci Ab
specifických pro určitý Ag. Použití: na titraci Ab třídy IgG + IgM.
Antigen se
naváže na
tuhou fázi a
promyje.
Přidá se
zředěné
sérum, ve
kterém se
má určit
přítomnost
Ab.
Inkubace,
promytí –
přitom dochází
k navázání na
imobilizované
Ag
Přidá se
enzymem
značená
sekundární
Ab, promytí
Přidá se
enzymový
substrát a změří
se intenzita
barevné reakce.
13_B 27
ELISA na zachycení protilátek IgM
Na tuhou fázi se
naváží anti-IgM Ab
A tou se
z vyšetřované
ho séra
vychytá IgM.
Přidá se roztok antigenu, který
se naváže na ty imobilizované
Ig, které mají pro ně specifické
vazbové místo, promytí
13_B 28
Přidá se specificky značená Ab
proti Ag. Inkubace, promytí
Aplikací substrátu se vyvolá
barevná reakce. Její intezita je
úměrná množství antigenně
specifického IgM imobilizovaného
v druhém kroku metody.
V praxi použití: na důkaz Ab proti některým virovým Ag, např. proti viru
hepatitidy A.
13_B 29