1 Cvičení č. 1: Imunochemická detekce proteinu p53 na nitrocelulosové membráně (dot blot) Úvod Protein p53 je kódován genem TP53 a hraje roli především jako nádorový supresor (antionkogen). Díky své funkci transkripčního faktoru reguluje expresi mnoha cílových genů, zodpovědných za růst buněk a apoptózu, tím že se sekvenčně specificky váže na DNA. V normálním stavu buňky se vyskytuje v malé špatně detekovatelné míře. Více než 50% tumorů je asociováno s mutací v genu TP53. Vzniká mutantní protein, onkogen, který je naopak v buňce akumulován a dobře pomocí protilátek detekován. Dot blot je zjednodušenou alternativou k western blotu a slouží pro detekci a identifikaci proteinů. Na rozdíl od western blotu nedochází k elektroforetické separaci, nelze tedy určit velikost cílového proteinu, můžeme však přítomnost daného proteinu potvrdit – v našem případě p53. Kapka vzorku je nanesena přímo na nitrocelulosovou membránu, kde je následně protein zájmu imunochemicky detekován. Princip metody Principem imunochemické detekce je využití reakce antigen-protilátka. Antigeny jsou látky, které organismus rozpoznává jako cizorodé. Jejich přítomnost stimuluje tvorbu protilátek. Každý antigen obsahuje antigenní determinanty (epitopy) tvořené 5-8 aminokyselinami. Schopnost protilátek rozlišovat i malé rozdíly epitopů je základem specifity imunitních reakcí. Protilátky patří mezi imunoglobuliny a jsou produkovány jako součást imunitní odpovědi. Rozlišujeme několik tříd - IgG, IgM, IgA, IgE a IgD. Protilátky jsou charakterizovány afinitou – síla vazby protilátky s jednou vazebnou determinantou antigenu, aviditou – síla vazby mezi protilátkou a celou molekulou antigenu (většina antigenů je multivalentních, tzn. má více vazebných determinant pro různé protilátky) a specifitou – protilátky jeví minimální interferenci s látkami, pro které není protilátka určena. Protilátky mohou být polyklonální či monoklonální. Polyklonální protilátky se připravují imunizací zvířat, kdy se zvířeti aplikuje příslušný antigen. V době imunizace (2-6 měsíců) se v krevním séru tvoří protilátky proti různým antigenním determinantám antigenu. Polyklonální protilátka může obecně reagovat s několika antigenními determinantami. Výhodou je vyšší citlivost a avidita. Nevýhodou je individuální imunitní odpověď a tedy i nereprodukovatelnost. Monoklonální protilátky nejsou produkovány organismem, ale buněčnou kulturou. Myš je imunizována antigenem, následně se ze sleziny získají lymfocyty produkující protilátky. Jejich hybridizací s myelomovými buňkami dojde k fúzi obou typů buněk. Klonováním lze vybrat buňky, které produkují protilátky proti konkrétní antigenní determinantě antigenu. Takto syntetizovaná protilátka obsahuje jediný typ vazebného místa, a tedy rozeznává jedinou antigenní determinantu. Monoklonální protilátky se vyznačují vyšší čistotou a specifitou, jsou reprodukovatelné, mají však nižší afinitu. Povrch nitrocelulózové membrány váže proteiny, proto je třeba po nanesení vzorku membránu zablokovat. Membrána se ponoří do roztoku levného proteinu, např. BSA či odtučněného sušeného mléka v PBS s přídavkem detergentu pro snížení šumu pozadí. Proteiny BSA či mléčný 2 kasein se naváží na všechna místa, kam se dosud nenavázaly proteiny z našeho vzorku. Po přidání protilátky tedy nemůže dojít k její nespecifické vazbě na povrch membrány, nýbrž musí specificky hledat svůj epitop na antigenech vzorku. Pro detekci cílového proteinu je nutné použití specifické primární protilátky proti tomuto proteinu a sekundární protilátky konjugované s reportérovým enzymem. V našem případě je primární protilátkou DO1 (aa 20-25), která specificky rozpoznává N-konec přirozené i mutantní formy proteinu p53, oblast mezi 20-25 aminokyselinou. Jedná se o myší monoklonální protilátku třídy IgG. Sekundární protilátka je produkována imunizací pomocí antigenů z daného organizmu. Imunizace probíhá v jiném druhu hostitelského organismu, než u primární protilátky. V našem případě byla protilátka DO1 produkována myší, proto sekundární polyklonální protilátka (anti-mouse IgG) byla produkována kozou, které byla injikována primární protilátka. Sekundární protilátka se tedy váže na primární protilátku a je konjugována s reportérovým enzymem umožňujícím detekci, v našem případě alkalickou fosfatázou a /nebo křenovou peroxidázou. Obr. 1: Princip imunochemické detekce proteinu A) Pro kolorimetrickou detekci molekul značených alkalickou fosfatázou se běžně používá 5-bromo- 4-chloro-3-indolylfosfát (BCIP) a nitro blue tetrazolium (NBT). Jsou-li tyto látky inkubovány s alkalickou fosfatázou, dochází k tvorbě nerozpustného diformazanu NBT, který se projeví fialovým zbarvením. Obr. 2: Reakce BCIP/NBT 3 B) Chemiluminiscence za použití protilátky značené křenová peroxidázou Obr. 2: Reakce ECL- POD (peroxidáza, HRP) Pracovní postup s primární a sekundární protilátkou 1. Pracujte ve dvojici, na kousek nitrocelulózové membrány naneste pipetou 1µl vašeho vzorku proteinu o různé koncentraci (1x, 100x a 1000x zředěný). Ředění vzorku 10x a 100x připravte v PBS. Membrány je třeba dotýkat se co nejméně. Membránu popište obyčejnou tužkou. 2. Membránu vložte do 2 ml plastové zkumavky (ependorfky) a přelijte 1-2 ml 5% PBS mléka. Inkubujte na termobločku 30 min. 3. Do mléka přidejte 1 µl primární protilátky a inkubujte na třepačce alespoň 30 min. 4. Mléko s protilátkou slijte do falkonky a přelijte membránu promývacím pufrem 1x PBST. Po 5ti min pufr vylijte a promytí po 5-ti min ještě 2x zopakujte. 5. Membránu přelijte 5-ti ml mléka a přidejte 2 µl sekundární protilátky anti-mouse IgG konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Inkubujte 30 min. 6. Zopakujte promývací krok 4. 7. Kolorimetrická detekce pro 1 ml substrátového pufru přidejte 3,3 µl BCIP a 33,0 µl NBT. Membránu v roztoku inkubujte asi 10 min, dokud nepozorujete fialové zbarvení. 8. Vylijte roztok BCIP/NBT. Reakci zastavíte opláchnutím membrány v destilované vodě. 5. Membránu přelijte 5-ti ml mléka a přidejte 2 µl sekundární protilátky anti-mouse IgG konjugovanou s křenovou peroxidázou. Inkubujte 30 min. 6. Zopakujte promývací krok 4. 7. Pro detekci chemiluminiscence umístěte membránky na eurofolii, pokryjte směsí roztoku 1+2 (100ul 1 + 100ul 2), detekujeme chemiluminiscenci . Použité chemikálie 5% PBS mléko – 5% sušeného mléka v 1% PBS BCIP – vodný roztok 50 mg/ml NBT – vodný roztok 10mg/ml Substrátový pufr – 0,1 M Tris, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 , pH 9,5 Vyhodnocení 4 Otázky: Co je to SDS-PAGE, western blot, dotblot, epitop, avidita, afinita, funkce mléka…….. Příklad: Protein p53 (1-393 aa) se vyskytuje v buňce v několika variantách: p53A (1-363 aa), p53B (45-345 aa), která z protilátek rozpozná všechny varianty: Seznam protilátek DO1 (20-25 aa), DO11 (120-135 aa), Pab421 (363-393 aa). Protokol: Název metody Princip stanovení Nákres obrázku Odpovědi na otázky Reakce katalyzované enzymy