Cvičení č. 1: Imunochemická detekce proteinu p53 na nitrocelulosové membráně (dot blot) Úvod Protein p53 je kódován genem TP53 a hraje roli především jako nádorový supresor. Díky své funkci transkripčního faktoru reguluje expresi mnoha cílových genů, zodpovědných za růst buněk a apoptózu. Účastní se rovněž opravných mechanismů DNA. Více než 50% tumorů je asociováno s mutací v genu TP53. Dot blot je zjednodušenou alternativou k western blotu a slouží pro detekci a identifikaci proteinů. Na rozdíl od western blotu nedochází k elektroforetické separaci, nelze tedy určit velikost cílového proteinu, můžeme však přítomnost daného proteinu potvrdit – v našem případě p53. Kapka vzorku je nanesena přímo na nitrocelulosovou membránu, kde je následně protein zájmu imunochemicky detekován. Princip metody Principem imunochemické detekce je využití reakce antigen-protilátka. Antigeny jsou látky, které organismus rozpoznává jako cizorodé. Jejich přítomnost stimuluje tvorbu protilátek. Každý antigen obsahuje antigenní determinanty (epitopy) tvořené 5-8 aminokyselinami. Schopnost protilátek rozlišovat i malé rozdíly epitopů je základem specifity imunitních reakcí. Protilátky patří mezi imunoglobuliny a jsou produkovány jako součást imunitní odpovědi. Rozlišujeme několik tříd - IgG, IgM, IgA, IgE a IgD. Protilátky jsou charakterizovány afinitou – síla vazby protilátky s jednou vazebnou determinantou antigenu, aviditou – síla vazby mezi protilátkou a celou molekulou antigenu (většina antigenů je multivalentních, tzn. má více vazebných determinant pro různé protilátky) a specifitou – protilátky jeví minimální interferenci s látkami, pro které není protilátka určena. Protilátky mohou být polyklonální či monoklonální. Polyklonální protilátky se připravují imunizací zvířat, kdy se zvířeti aplikuje příslušný antigen. V době imunizace (2-6 měsíců) se v krevním séru tvoří protilátky proti různým antigenním determinantám antigenu. Polyklonální protilátka může obecně reagovat s několika antigenními determinantami. Výhodou je vyšší citlivost a avidita. Nevýhodou je individuální imunitní odpověď a tedy i nereprodukovatelnost. Monoklonální protilátky nejsou produkovány organismem, ale buněčnou kulturou. Myš je imunizována antigenem, následně se ze sleziny získají lymfocyty produkující protilátky. Jejich hybridizací s myelomovými buňkami dojde k fúzi obou typů buněk. Klonováním lze vybrat buňky, které produkují protilátky proti konkrétní antigenní determinantě antigenu. Takto syntetizovaná protilátka obsahuje jediný typ vazebného místa, a tedy rozeznává jedinou antigenní determinantu. Monoklonální protilátky se vyznačují vyšší čistotou a specifitou, jsou reprodukovatelné, mají však nižší afinitu. Povrch nitrocelulózové membrány váže proteiny, proto je třeba po nanesení vzorku membránu zablokovat. Membrána se ponoří do roztoku levného proteinu, např. BSA či odtučněného sušeného mléka v PBS s přídavkem detergentu pro snížení šumu pozadí. Proteiny BSA či mléčný kasein se naváží na všechna místa, kam se dosud nenavázaly proteiny z našeho vzorku. Po přidání protilátky tedy nemůže dojít k její nespecifické vazbě na povrch membrány, nýbrž musí specificky hledat svůj epitop na antigenech vzorku. Pro detekci cílového proteinu je nutné použití specifické primární protilátky proti tomuto proteinu a sekundární protilátky konjugované s reportérovým enzymem. V našem případě je primární protilátkou DO1, která specificky rozpoznává N-konec přirozené i mutantní formy proteinu p53. Jedná se o myší monoklonální protilátku třídy IgG. Sekundární protilátka je produkována imunizací pomocí dané primární protilátky. Imunizace probíhá v jiném druhu hostitelského organismu, než u primární protilátky. V našem případě byla protilátka DO1 produkována myší, proto sekundární polyklonální protilátka (anti-mouse IgG) byla produkována kozou, které byla injikována primární protilátka. Sekundární protilátka se tedy váže na primární protilátku a je konjugována s reportérovým enzymem umožňujícím detekci, v našem případě alkalickou fosfatázou. http://www.bio-rad.com/webroot/web/images/lsr/products/electrophoresis/product_overlay_content/glob al/lsr_colorimetric_chem.jpg Obr. 1: Princip imunochemické detekce proteinu Pro kolorimetrickou detekci molekul značených alkalickou fosfatázou se běžně používá 5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfát (BCIP) a nitro blue tetrazolium (NBT). Jsou-li tyto látky inkubovány s alkalickou fosfatázou, dochází k tvorbě nerozpustného diformazanu NBT, který se projeví fialovým zbarvením. http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/articles/biofiles/colorimetric-alkaline/figur e-1-v3a4.gif Obr. 2: Reakce BCIP/NBT Pracovní postup 1. Pracujte ve dvojici, na kousek nitrocelulózové membrány naneste pipetou 10µl vašeho vzorku proteinu o různé koncentraci. Připravte ředění 10x a 100x v PBS. Membrány je třeba dotýkat se co nejméně. Membránu popište obyčejnou tužkou. 2. Membránu vložte do Petriho misky a přelijte 5 ml 5% PBS mléka. Inkubujte na třepačce 15 min. 3. Do mléka přidejte 1 µl primární protilátky DO1 a inkubujte na třepačce alespoň 30 min. 4. Mléko s protilátkou slijte do falkonky a přelijte membránu promývacím pufrem 1x PBST. Po 5-ti min pufr vylijte a promytí po 5-ti min ještě 2x zopakujte. 5. Membránu přelijte 5-ti ml mléka a přidejte 2 µl sekundární protilátky anti-mouse IgG konjugovanou s alkalickou fosfatázou Inkubujte 30 min. 6. Zopakujte promývací krok 4. 7. K 10 ml substrátového pufru přidejte 33 µl BCIP a 330 µl NBT. Membránu v roztoku inkubujte asi 10 min, dokud nepozorujete fialové zbarvení (pracujte ve čtveřici). 8. Vylijte roztok BCIP/NBT. Reakci zastavíte opláchnutím membrány v destilované vodě. Použité chemikálie 5% PBS mléko – 5% sušeného mléka v 1% PBS BCIP – vodný roztok 50 mg/ml NBT – vodný roztok 10mg/ml Substrátový pufr – 0,1 M Tris, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl[2] , pH 9,5 Vyhodnocení