patobiochemie-1 1
PATOBIOCHEMIE
Mgr. Marie Brázdová, Ph.D.
brazdovam@vfu.cz
Biofyzikální ústav, Akademie
věd České republiky, v.v.i.
Královopolská 135
612 65 Brno
Trendlink. [online]. [cit. 2014-08-18]. Dostupné z: http://www.trendlink.com/aktien/Biochemie
Biofyzikální ústav AV ČR. [online]. [cit. 2014-08-18]. Dostupné z:
http://www.ibp.cz/cs/o-instituci/zakladni-informace/
Ústav molekulární biologie a farmaceutické biotechnologie
Patobiochemie
patobiochemie-1
Přednášející:
Mgr. Marie BRÁZDOVÁ, Ph.D.
Mgr. J. Jelínek, Mgr. I. Kučerová, Mgr. Veselý, Mgr. Čech
Po: 45-135 7:15-8:45
Cvičící:
Mgr. Marie BRÁZDOVÁ, Ph.D.
Mgr. J. Jelínek, Mgr. I. Kučerová, Mgr. A. Polášková, Mgr. R.
Helma, Mgr. M. Petr, Mgr. Adámik
(laboratoř 45-324, centrální laboratoře)
Patobiochemie se zabývá poruchami biochemických dějů v organismu,
biochemickými změnami v průběhu chorobných stavů a snaží se o jejich
vysvětlení na molekulární úrovni.
2
SYLABUS PRAKTICKÝCH CVIČENÍ:
(po 14:45-17:00; ut 7-9:15, 9:15-11:30, 11:30-13:45)
1. Cvičení: Analýza onkogenů pomoci imunodetekce na
membráně. (14.2.;21.2.MB) (Laboratoře 324, šatna
3.patro)
2. Cvičení: Základní biochemická vyšetření. Seznámení s
biochemickým analyzátorem Dimension. (28.2.;7.3.JJ,
centrální laboratoře, šatna suterén)
3. Cvičení: Imunochemické metody. Chemiluminiscenční
metody. Využití imunoanalyzátoru Immulite.
(14.3.;21.3.JJ, centrální laboratoře, šatna suterén)
4. Cvičení: Hematologické metody. Využití automatických
hematologických analyzátorů v klinické praxi. Koagulační
metody (28.3., 4.4., seminář, učebna )
5. Cvičení: Zápočtový test (11.4.;18.4.MB, učebna)
patobiochemie-1 3
Sylabus Patobiochemie 2016/2017 (přednášky 45-135 posluchárna, po 7:15-8:45)
• 1. Úvod do předmětu, význam studia patobiochemie. Rozsah a požadavky k úspěšnému ukončení
předmětu zkouškou, doporučená literatura. Principy regulací metabolismu. Receptory. Biochemické
komunikace. (13.2.MB)
• 2. Příčiny a druhy poruch. Dědičné metabolické poruchy. Enzymy, regulace metabolismu. Příčiny zvýšené
aktivity buněčných enzymů v plasmě. Klinicky významné enzymy. (20.2.MB)
• 3. Sacharidy, metabolismus glukosy a jeho poruchy. Regulace glykemie, poruchy. Patobiochemie diabetu
mellitu, druhy DM. Poruchy metabolismu glykogenu, glykogenosy. (27.2.MB)
• 4. Metabolismus aminokyselin a jeho poruchy. Druhy nemocí, terapie. (6.3.MB)
• 5. Poruchy metabolismu lipidů. Cholesterol, lipoproteiny. Lipidosy, dyslipoproteinemie. (13.3.MB)
• 6. Patobiochemie arteriosklerózy. Ischemická porucha srdeční - srdeční markery. (20.3.JJ)
• 7. Krev, proteiny krevní plasmy. Srážení krve, koagulopatie. Dysproteinemie. Porfyriny. Biosyntéza,
poruchy metabolismu. Porfyrie, hemoglobinopatie. (27.3.Kučerová)
• 8. Nukleové kyseliny poruchy metabolismu purinů a pirimidinů. Hyperurikemie, orotacidurie, terapie.
(3.4.MB)
• 9. Xenobiotika a jejich účinky na organismus. Detoxikace, mechanismus. Biologické oxidace. Účinky
volných radikálů na organismy. Lipoperoxidace,antioxidanty. (10.4.MB)
• 10. Tumor, tumorové markery. Základní charakteristika nádorové buňky. Strategie laboratorních vyšetření.
Požadavky na ideální nádorový marker. Používané tumorové markery. (24.4.MB)
• 11. Vztah patobiochemie a klinické biochemie. Klinicko-biochemická analytika a její specifické rysy.
Terminologie klinické biochemie. Analyzovaný materiál. Odběr materiálu. Mechanizace a automatizace
v klinické biochemii. Analyzátory, jejich rozdělení z různých hledisek. Diagnostické soupravy. Organizace
práce v klinicko-biochemické laboratoři, laboratorní a nemocniční informační systémy. (15.5.CL)
• 12. Analýza moče a močového sedimentu. Imunochemické metody. (22.5.CL)
patobiochemie-1 4
Studijní literatura:
moodle- patobiochemie 2017, patobiochemie2015, patobiochemie
• G.F.Hoffmann et al. Dědičné metabolické poruchy. Grada,, 2006.
• J.Koolman, K.H.Rohm. Barevný atlas biochemie. Grada, 2012.
• Ledvina a kol. Biochemie pro studující medicíny - I. a II.díl. Karolinum, 2005.
• Murray et al. Harpeŕ´s Illustrated Biochemistry. 29th Edition. Lange, 2012.
• KARLSON, P.; GEROK, W.; GROSS, W. Pathobiochemie. Academia, Praha, 1987.
• Laboratorní diagnostika. Edited by Tomáš Zima. 1. vyd. Praha: Galén, 2003.
ISBN 80-7262-201-3.
• Clinical biochemistry :metabolic and clinical aspects. Edited by S. K. Bangert William
J. Marshall. New York: Churchill Livingstone, 1995. ISBN 0-443-04341-8.
MASOPUST, Jaroslav. Klinická biochemie. Požadování a hodnocení biochemických
vyšetření. 1. vyd. Praha: Karolinum, 1998. část I. a část II. ISBN 80-7184-649-3.
• Clinical guide to laboratory tests. Edited by Norbert W. Tietz. 3rd ed.
Philadelphia: W.B. Saunders Company, 1995. ISBN 0-7216-5035-X.
• RACEK, Jaroslav. Klinická biochemie. Praha: Galén, 2006. ISBN 80-7262-324-9.
patobiochemie-1 5
patobiochemie-1 6
Požadavky ke zkoušce z patobiochemie
Zkouška se skládá z části písemné a části ústní
Test: min 60% (E), ….90-95% (A)
Ke zkoušce se můžou přihlásit pouze ti studenti, kterým byl
udělen zápočet z praktického cvičení.
Praktická cvičení: účast 100%, test před úlohou, protokoly,
zápočtový test 80%
PRINCIPY REGULACE METABOLISMU:
TEORETICKÉ ZÁKLADY
ZPĚTNÁ VAZBA
ENZYMY -BIOKATALYZÁTORY
HORMONY (Obecné mechanismy účinku hormonů a neurotransmiterů)
RECEPTORY (Typy membránových receptorů a intracelulární receptory)
ENZYMY
METABOLICKÉ REGULACE
patobiochemie-1
Principy regulací metabolismu.
Hormony. Biochemické komunikace.
Aktivita metabolických drah musí být neustále monitorována a upravována, aby syntéza a
degradace metabolitů uspokojila převládající fyziologické požadavky. Přepínání mezi různými
katabolickými a anabolickými reakcemi je nezbytné jednak podle aktuálních metabolických
potřeb každé buňky, jednak podle potřeb celého organismu.
Pro zachování existence živých objektů je proto nutné propojení jednotlivých částí organismu a
zajištění vzájemné regulace.
7
Regulace metabolismu probíhá na různých úrovních,
ale vždy na molekulárním podkladě.
Cílem je přizpůsobit se neustále se měnícím vnějším i vnitřním podmínkám.
Vzájemnou komunikaci mezi buňkami zajišťují signální molekuly, které jsou
zachyceny cílovými buňkami pomocí specifických receptorových proteinů
(receptorů). Extracelulární signál je pak převáděn na intracelulární signály, které řídí
chování buňky. Signál je mezi buňkami přenášen na různou vzdálenost, s různou
rychlostí a selektivitou. patobiochemie-1
Pro život mnohobuněčného
organismu je nezbytná spolupráce
mezi blízkými a vzdálenými
buňkami, neboť buňky musí
vzájemně sladit své chování. Jde
nejen o vzájemnou regulaci
(neurohumorální
regulace), ale i o společné
využívání produktů různých
metabolických pochodů, probíhajících
v různých buňkách v různé míře.
8
Základním regulačním mechanismem –
zpětná vazba
patobiochemie-1 9
Regulace metabolismu probíhá na různých
úrovních, ale vždy na molekulárním podkladě.
Centrálním nástrojem regulace metabolismu je regulace
enzymových reakcí
regulace v určitém buněčném
kompartmentu
regulace v rámci
kompletní buňky
(proteom, specifické
receptory, izoenzymy,
transportéry, energetický
stav buňky)
regulace vyplývající
z komunikace mezi
buňkami
úrovně regulace se překrývají.
10
patobiochemie-1
Enzymy
Regulace buněčných dějů v rámci samotné buňky souvisí s regulací přicházející z
okolí - regulační děje navazující na vnější signál probíhají obdobným mechanismem,
jako regulace zprostředkované samotnou buňkou. Všechny regulační kaskády vždy
vedou
Takový enzym je označován jako klíčový nebo regulační enzym a obvykle se v
buňce vyskytuje v nízké koncentraci (regulace je obecně založena na).
Rychlost celé metabolické dráhy (sledu následných změně koncentrace aktivního
enzymu reakcí) je tak dána reakcí, která je za daných podmínek nejpomalejší.
Všechny kroky metabolických drah regulovány nebývají, regulace nejčastěji zahrnuje
pouze klíčové reakce metabolismu.
Regulován bývá enzym, který katalyzuje první rozhodující reakci metabolické dráhy,
vycházející z obecné hotovosti intermediárního substrátu. Nejčastěji jde o silně
exergonické, tj. prakticky nevratné, reakce.
11
patobiochemie-1
Regulace enzymové aktivity
• regulace množství enzymu (syntéza a degradace)
• regulace aktivity enzymu (modifikace enzymu
proteolýzou, kovalentní modifikací, allosterická regulace,
interakce s regulačními proteiny)
• dostupnost a koncentrace substrátu (regulace transportu)
12TEST
patobiochemie-1
Významné regulační mechanismy
1) dostupnost substrátů - zvyšuje se s jejich zvýšeným příjmem nebo syntézou a také s
transportem
na místo, kde mohou být metabolizovány, snižuje se s jejich odběrem dalšími metabolickými
Drahami
2) využívání produktů - pokud je produkt reakce ihned využíván následnou reakcí jako substrát
(metabolické dráhy), nedochází k hromadění tohoto produktu a reakce dále probíhá ve směru jeho
další tvorby; začne-li se nevyužitý produkt hromadit, často pak slouží jako inhibitor reakce, nebo
sledu reakcí, vedoucích k jeho vzniku
3) dostupnost potřebných koenzymů - většina enzymů potřebuje pro svou katalytickou funkci
vhodný koenzym, který se během přeměny substrátu také mění: při jeho regeneraci následnou
drahou je rychlost reakce dána rychlostí této následně probíhající zpětné přeměny koenzymu
4) aktivita potřebných enzymů - závisí jednak na koncentraci daného enzymu v buňce, jednak na
tom, jak velká část z přítomných molekul enzymu je aktivní; z regulačního hlediska je nejvýhodnější
měnit aktivitu enzymů katalyzujících nejpomalejší reakci dané metabolické dráhy
13
patobiochemie-1 14
Aktivita enzymů – inhibitory,
aktivátory
patobiochemie-1
Cílem je přizpůsobit se neustále se měnícím vnějším i vnitřním
podmínkám. Vzájemnou komunikaci mezi buňkami zajišťují signální
molekuly, které jsou zachyceny cílovými buňkami pomocí specifických
receptorových proteinů (receptorů).
Extracelulární signál je pak převáděn na intracelulární signály, které
řídí chování buňky. Signál je mezi buňkami přenášen na různou
vzdálenost, s různou rychlostí a selektivitou.
Pro život mnohobuněčného organismu je nezbytná spolupráce mezi
blízkými a vzdálenými buňkami, neboť buňky musí vzájemně sladit své
chování. Jde nejen o vzájemnou regulaci (neurohumorální
regulace), ale i o společné využívání produktů různých
metabolických pochodů, probíhajících v různých buňkách v různé míře.
Regulace na úrovni makroorganismu
15
patobiochemie-1
Mezibuněčná komunikace
- koordinace růstu, diferenciace, metabolismu buněk tkání a jiných mnohobuněčných struktur
- buňky - komunikace přímým kontaktem buňka-buňka - specialisované spoje v plasmatické
membráně - výměna malých molekul - např. koordinace metabolických odpovědí; určení tvaru
buněk
- interakce buňka-buňka = počátek vývoje a diferenciace tkání, vazba specifického proteinu
jedné buňky na receptor buňky druhé
- extracelulární signální molekuly - syntetizovány “signalizujícími” buňkami, vyvolají
odpoveď
jen v “cílových” bunkách, majících receptory
- signální transdukce - proces “přeměny” extracelulárního signálu na buněčnou odpověď
Komunikace extracelulárními signály: 6 kroků
1) syntéza signální molekuly “signalizující” buňkou
2) uvolnění signální molekuly “signalizující” buňkou
3) transport “signálu” k cílové buňce
4) detekce “signálu” specifickým receptorovým proteinem
5) změna buněčného metabolismu, funkce nebo vývoje vyvolaná komplexem
signál-receptor
6) odstranění signálu, obvykle “ukončí” buněčnou odpoveď
16
patobiochemie-1
Komunikace mezi buňkami
Signální transdukce je proces, při němž signální molekuly (působky) přenášejí
specifické informace přes membrány z vnějšku cílové buňky do jejího nitra, kde
vyvolávají příslušnou biologickou odpověď.
Ve vyšších organismech se uplatňují hlavní signální systémy, pomocí kterých je
regulována a integrována činnost buněk.
Kromě nich se v metabolismu uplatňují další, do těchto systémů nezařazené signální
molekuly.
17
patobiochemie-1
Účinky signálních molekul
Název účinku Charakter účinku
endokrinní Působek je přenášen krví na cílovou buňku, která je většinou
vzdálena od místa vzniku. Typicky hormony
parakrinní Působek je secernován do bezprostředního okolí buňky
(lokální mediátory). Působkem jsou ovlivněny jen buňky v nejbližším
okolí.
autokrinní Buňka sekretuje působek a je současně cílem. Rysy jsou
obdobné parakrinnímu působení.
Endokrinní – působek je přenášen krví na cílovou buňku, která je většinou vzdálena od místa vzniku. Typicky jsou to
hormony. Koncentrace působku v krvi je velmi nízká (10−12–10−9 mol/l) –cílová buňka má proto velkou afinitu k
působku-- vazba hormonu k receptoru je velmi silná, hormon nesnadno disociuje. Dalším rysem je, že trvá určitou
dobu, než se koncentrace hormonu v krvi zvýší a hladina hormonu v krvi zůstává po určitou dobu (několik minut až hodin)
zvýšena.
Parakrinní – působek je secernován do bezprostředního okolí buňky (lokální mediátory). Působkem jsou ovlivněny jen
buňky v nejbližším okolí. Koncentrace působku v okolí buněk je vyšší (10−9–10−6 mol/l). Afinita receptorů k působku je
nižší -- po poklesu koncentrace v okolí buňky se působek od receptoru oddělí. Parakrinní signalizace je určena pro rychlou a
lokalizovanou komunikaci mezi buňkami.
Autokrinní – buňka sekretuje působek a je současně cílem. Rysy jsou obdobné parakrinnímu působení.
Juxtakrinní – signalizace mezi buňkami nebo buňkou a extracelulární matrix vyžaduje těsný kontakt.
18
TEST
patobiochemie-1
endokrinní parakrinní
autokrinní
19
TEST
signální systémy
Juxtakrinní – signalizace mezi buňkami nebo
buňkou a extracelulární matrix vyžaduje těsný kontakt
patobiochemie-1
Obecné mechanismy účinku hormonů a neurotransmiterů.
Typy signálních molekul v neurohumorálních regulacích:
Působek Zdroj
HORMONY vylučované endokrinními žlázami, rozptýlenými
žlázovými buňkami, ikosanoidy mnoha jinými typy
buněk
NEUROHORMONY vylučované neurony do krevního oběhu
NEUROTRANSMITERY vylučované na synaptických zakončeních
CYTOKINY, RŮSTOVÉ
FAKTORY, IKOSANOIDY
Vylučovány mnoha typy buněk, zpravidla ne z
endokrinních žláz
20
patobiochemie-1
Společným rysem všech látek s modulačními účinky na buňky je jejich působení
prostřednictvím receptorů.
Receptory jsou allosterické proteiny, které mění svou konformaci po navázání ligandu.
Ligandem jsou signální molekuly.
Agonisté jsou ligandy, které po navázání na receptor vyvolají transdukci signálu,
antagonisté po navázání na receptor brání transdukci signálu.
21
RECEPTORY
patobiochemie-1
Receptory jsou lokalizované buď na vnějším povrchu
cytoplazmatické membrány, nebo intracelulárně
(cytosol, jádro).
Ve své struktuře mají dvě hlavní komponenty:
(1) doménu vázající ligand, která zajišťuje specifitu vazby s
příslušným ligandem; (2) efektorovou doménu, která zahajuje vznik
biologické odpovědi po vazbě ligandu.
Aktivovaný receptor může vstoupit do reakce s dalšími buněčnými komponentami
a realizovat tak proces signální transdukce.
Tkáně, jejichž buňky nemají žádné molekuly specifického receptoru, nemohou
reagovat na příslušný hormon.
Charakteristickým rysem přenosu signálu prostřednictvím receptorů je jeho
amplifikace (zesílení), kdy jedna jediná molekula hormonu je
schopna vyvolat buněčnou odezvu s 104–105krát vyšší intenzitou.
22
Princip hierarchie v některých hormonálních
regulacích a zesílení toku informací pomocí signálních
molekul
Neurony mozkové kůry NEUROTRANSMITERY nejvýše nanogramy
Neurony jader hypotalamu KORTIKOLIBERIN mikrogramy
Buňky adenohypofýzy KORTIKOTROPIN stovky mikrogramů
(adrenokortikotropní hormon, ACTH)
Buňky kůry nadledvin KORTISOL desítky miligramů
CÍLOVÉ BUŇKY PERIFERNÍCH TKÁNÍ
Denní produkce:
Např.
Kortizol zvyšuje celkovou pohotovost organismu při zátěžových situacích (stresech, infekčních chorobách, velké tělesné
námaze, dlouhodobém hladovění). Jeho účinek na metabolismus by se dal jednoduše popsat jako katabolický,
antianabolický a diabetogenní.
patobiochemie-1 23
24
Hormony vs. Neurotransmitery
Působí prostřednictvím
receptorů
Často shodné struktury
(noradrenalin jako
neurotransmiter i hormon)
Vznik v endokrinní buňce
Transport krví
Působení na cílové tkáně
Vznik v nervové buňce
Působení z buňky na buňku
na synapsích
patobiochemie-1
25
Transdukce signálu
Jak buňka převezme informaci nesenou chemickým
signálem?
Reakce signální molekuly s receptorem
Membránové receptory
Hormony i neurotransmitery
Proteiny a menší signální
molekuly (peptidy, aminokyseliny,
biogenní aminy, ikosanoidy)
Intracelulární receptory
Pouze hormony
Nepolární signální molekuly
(steroidy, jodtyroniny, retinoáty)
patobiochemie-1
TEST
patobiochemie-1
Amplifikace
Membránové a intracelulární receptory
Interakce komplexu hormon- receptor
s hormonsenzitivním elementem DNA
Nepolární signální molekula
navázaná na transportní protein plazmy
Intracelulární receptor
Biologická odpověď
(účinek pomalejší)
Polární signální molekula
Biologická odpověď
(rychlý účinek, může
být následován i
účinkem pozdnějším)
Transdukce signálu
Membránový receptor
Přenos signální molekuly
1
100
10 000
26
patobiochemie-1 27
Princip signalizace
tvorba signálu
registrace signálu receptorem
na vnějším povrchu buňky
nebo v cytoplazmě/jádře
přenos signálu z receptoru k
efektorům uvnitř buňky
TRANSDUKCE SIGNÁLU
efektorem může být
transkripční faktor, enzym,
složka cytoskeletu, atd...
schopnost buňky reagovat na
podněty je geneticky určena spektrem
receptorů, které je
schopna vytvořit
Biochemie-12-1-prenost_signalu 28
patobiochemie-1
Typy receptorů
29TEST
Chemická povaha signálů
proteiny
krátké peptidy
aminokyseliny
nukleotidy
steroidy
retinoidy
mastné kyseliny a jejich deriváty
plyny
Biochemie-12-1-prenost_signalu 30
O vstupu signální molekuly do
buňky rozhoduje její rozpustnost
Biochemie-12-1-prenost_signalu 31
patobiochemie-1 32TEST
patobiochemie-1 33
patobiochemie-1 34
Signalizace zprostředkovaná
nitrobuněčnými receptory - ligandy
Biochemie-12-1-prenost_signalu 35
Signalizace zprostředkovaná
nitrobuněčnými receptory
Mechanismus účinku:
Malá velikost/lipofilní
povaha hormonů - difúze
membránou -pevná vazba
na nitrobuněčné
receptory - konformační
změna receptorů - zvýšená
afinita ke specifickým
sekvencím DNA regulace
transkripce
cílových genů
Biochemie-12-1-prenost_signalu 36
Struktura nitrobuněčných receptorů
C-konec: doména pro vazbu hormonu
N-konec: doména pro řízení transkripce
Střed molekuly: doména pro vazbu DNA
Biochemie-12-1-prenost_signalu 37
Biochemie-12-1-prenost_signalu 38
Intracelulární receptory
pro steroidní hormony, kalcitriol, jodované tyroniny a retinoáty
Receptory se nachází se v cytoplazmě nebo v jádře
Hormon-receptorové komplexy se vážou na specifická místa
DNA a slouží jako transkripční faktory
Komplex hormon-receptor se na DNA váže v místě HRE
(hormon response element)
Superrodina steroidních a thyroidních receptorů – rodina
strukturně podobných proteinů.
Aktivace transkripce je pomalejší proces, odezva má prodlevu
Biochemie-12-1-prenost_signalu 39
Příklad kortisolu (glukokortikoidy GK, jejich receptory GR):
hydrofobní molekula hormonu proniká do buňky
inaktivní receptor
pro glukokortikoidy (GR)
existuje v cytoplazmě jako komplex s
dimerem proteinu
hsp 90 (chaperon) a dalšími proteiny
aktivní monomerní komplex receptor-kortisol,
oddělil se hsp 90 s ostatnímí proteiny
aktivní komplex dimerizuje a je
nukleopóry translokován do jádra
GR
kortisol
CBG
kortisol v extracelulárním prostoru přenášen CBG (corticosteroid-binding globulin)
Biochemie-12-1-prenost_signalu 40
Dimerní komplex kortisol-receptor se v jádře navazuje na dsDNA v místě
specifické sekvence GRE (glucocorticoid response element), tj. na HRE
(hormone response element) specifické pro glukokortikoidy.
DNA vazebná doména
GR
receptor
DNA
GRE
vazebná doména pro kortisol
(hydrofobní kapsa)
Biochemie-12-1-prenost_signalu 41
GR dimer – intracelulární receptor pro glukokortikoidy (dimer)
GRE – glucocorticoid response element
GREB protein – GRE binding protein (specifický transkripční faktor)
TF IID Pol II
CTD
> 1 000 bp
mediátorové proteiny
enhancer
koaktivátorGREB protein
GRE
dimerní komplex kortisol-GR
promotor
bazální
transkripční
aparát
Aktivní komplex kortisol-receptor se váže na DNA v místě specifické sekvence
GRE (glucocorticoid response element, jedné z mnoha HRE – hormone response
elements). Samotný komplex hormon-receptor však vazby na DNA a ovlivnění
transkripce není schopen. Připojuje se koaktivátor a specifické GREB-proteiny
(glucocorticoid response element-binding proteins). Tento komplex se
prostřednictvím mediátorových proteinů navazuje na bazální transkripční aparát
na promotoru a iniciuje transkripci.
Iniciace transkripce kortisolem
II. Signalizace zprostředkovaná povrchovými
membránovými receptory
1. Hydrofilní mimobuněčný signál
(ligand, „primary messenger“):
růstový faktor, cytokin, hormon, atd.
2. Povrchový receptor:
převod mimobuněčného ligandu do podoby
nitrobuněčného signálu
3. Sekundární přenašeč („secondary
messenger“):
nízkomolekulární struktury (cAMP, Ca 2+ ,
diacylglycerol, zbytek kyseliny fosforečné, atd.)
produkt enzymově katalyzované reakce
přenos signálu od povrchových receptorů k
efektorům
4. Cílová molekula (efektor):
enzym
složka replikačního aparátu
složka aparátu pro genovou expresi
složka cytoskeletu Biochemie-12-1-prenost_signalu 42
TEST
Hlavní třídy
povrchových
membránových
receptorů
a) spojené s
iontových
kanálem
b) vázané s G-
proteiny
c) vázané na
enzym
Biochemie-12-1-prenost_signalu 43
TEST
Hlavní typy membránových/povrchových receptorů
patobiochemie-1
I. Receptory - iontové kanály (ROC, ligand-gated channels)
jsou pouze receptory pro některé neurotransmitery
(iontové kanály ovládané neurotransmitery)
II. Receptory interagující s G-proteiny (heterotrimerními)
III. Receptory vázané na enzym
IIIa. Receptory kooperující s nereceptorovými tyrosinkinázami
(např. JAK) – receptory pro somatotropin (GrH), prolaktin,
erytropoetin,
interferony, interleukiny a jiné cytokiny.
IIIb. Receptory s vlastní katalytickou aktivitou
a) guanylátcyklázovou
b) proteinkinázovou
44
patobiochemie-1
I. Receptory - iontové kanály (acetylcholin) jsou pouze receptory pro
některé neurotransmitery (iontové kanály ovládané neurotransmitery)
II. Receptory interagující s G-proteiny (epinefrin, glukagon,
serotonin)
45TEST
patobiochemie-1 46
TEST
47
Komunikace mezi:
• nervovou buňkou a nervovou buňkou
• nervovou buňkou a svalem
• nervovou buňkou a tkání
se uskutečňuje na synaptických spojích (synapsích)
pomocí neurotransmiterů
Neurotransmitery (mediátory)
patobiochemie-1
48
Příklady neurotransmiterů
Působení v: Název typ Chemický typ
CNS glutamát excitační aminokyselina
acetylcholin Derivát AK
dopamin Derivát AK
serotonin Derivát AK
histamin Derivát AK
aspartát aminokyselina
noradrenalin Derivát AK
GABA inhibiční Derivát AK
glycin aminokyselina
Periferní NS acetylcholin excitační Derivát AK
noradrenalin Derivát AK
patobiochemie-1
patobiochemie-1 49
v centrálním nervovém systému
inhibiční GABA (minim. 50 % všech synapsí)
glycin (převažuje v míše)
excitační glutamát (více než 10 %)
acetylcholin (kolem 10 %)
dopamin (kolem 1 %,ve striatu 15 %)
serotonin
histamin
aspartát
noradrenalin
(méně než 1 %, v hypotalamu 5 %)
adenosin
neuromodulační endorfiny a enkefaliny,
endozepiny, delta-spánek navozující peptid
ad.
Neurotransmitery
Známo více než 30 různých neurotransmiterů (aminokyseliny, biogenní
aminy vzniklé jejich přeměnou, nebo nepříliš velké peptidy).
Příklady:
v periferní části systému
– eferentní neurony
excitační acetylcholin
noradrenalin
– aferentní primární senzorické
excitační glutamát
(Aβ vlákna, hmatová)
substance P (peptid)
(C a A vlákna, nociceptivní)
50
Nervový systém – přenos signálu
pomocí neurotransmiterů
Integrace a přenos nervových podnětů prostřednictvím neuronů
Dráždění nervové buňky - elektricky, chemicky,
mechanicky
nervový podnět (akční potenciál)
vedení signálu do nervového zakončení
uvolnění synaptického neurotransmiteru
patobiochemie-1
51
Synapse – obecné schéma
Neurotransmitery - chemické signály, umožňují převod
nervového vzruchu mezi neurony nebo mezi neuronem a cílovou buňkou
.
synaptická štěrbina
postsynaptická
membrána
receptor
synaptické váčky
(synaptosomy)
napěťově řízený Ca2+ kanál
depolarizační vlna
Ca2+
Neurotransmitery se vážou na membránové receptory:
Dva typy receptorů:
• Neurotransmiter se váže k iontovému kanálu (ionotropní receptor) 
elektrický signál (neuron –neuron, neuron – kosterní sval)
• Neurotransmiter se váže k membránovému receptoru, který generuje
druhého posla (metabotropní receptor) chemický signál (např.hladký sval)
patobiochemie-1
patobiochemie-1 52
Rhabdomyocyty Parasympatikem Sympatikem
(kosterní svaly) inervované buňky cílových tkání
Postgangliové neurony
sympatické dráhy jsou
téměř vždy adrenergní
Adrenergní
receptory
N
NN
N
N
N
M1
Acetylcholinové (cholinergní) receptory
v periferních eferentních neuronech
N-nikotinový
M-muskarinový
53
•Po navázání acetylcholinu se receptor stává iontovým
kanálem pro Na+
•Na+ proudí dovnitř buňky
•buněčná membrána se depolarizuje – potenciál se stává
kladnějším
•otevírají se potenciálově závislé iontové kanály pro Na+
•Na+ proudí těmito kanály do buňky
•potenciál se přechodně mění ke kladným hodnotám
(depolarizace)
•současně stoupá vodivost pro K+ v opačném směru (repolarizace)
Sekvence dějů
patobiochemie-1
patobiochemie-1 54
Membránové receptory neurotransmiterů
Ionotropní receptory - ligandem řízené iontové kanály (ROC), např.
excitační acetylcholinový nikotinový - kanál pro Na+/K+,
glutamátový (CNS, některé aferentní sensorické neurony)
- kanál pro Na+/K+/Ca2+,
inhibiční receptor GABAA (CNS) - kanál pro ClMetabotropní
receptory aktivující G-proteiny, např.
protein Gs adrenergní 1 a 2, receptor GABAB, dopaminový D1,
protein Gi adrenergní 2, dopaminový D3,
acetylcholinový muskarinový M2 (otvírá též K+ kanál),
protein Gq acetylcholinový muskarinový M1, adrenergní 1.
patobiochemie-1
I. Receptory typu iontových kanálů
Receptory typu iontových kanálů se vyskytují na synapsích, jejich ligandy jsou neurotransmitery.
Signalizace pomocí těchto receptorů je velmi rychlá (řádově milisekundy), uplatňují se na spojeních
nerv-nerv nebo nerv-sval.
Neurotransmitery jsou v klidovém stavu uchovávány ve vezikulách na zakončení axonu a po stimulaci se
exocytózou uvolňují. Jejich difuze k receptorům probíhá rychle, protože se jedná o malé molekuly a
pohybují se na krátkou vzdálenost. Afinita neurotransmiterů k receptorům je relativně nízká, což
umožňuje rychlou disociaci, jakmile jejich koncentrace v synaptické štěrbině poklesne. Toto rychlé
ukončení signálu je typické pro systémy vyžadující rychlou odpověď v cílové buňce.
Po navázání neurotransmiteru na receptor dojde k jeho konformační změně, která umožní pronikání
iontů kanálkem ve struktuře proteinu. Tok iontů přes kanál mění membránový potenciál. Při influxu
kationtů se membrána depolarizuje a dochází k excitaci, při influxu aniontů se membrána
hyperpolarizuje, dochází k inhibici přenosu nervového vzruchu.
55
patobiochemie-1
Receptory hlavních neurotransmiterů
Acetylcholinové receptory
Vyskytuje se na nervosvalovém spojení kosterního svalu a v dendritech téměř všech periferních
eferentních neuronů. Skládá se z pěti podjednotek (2a,b,g a ε) penetrujících membránou.
Acetylcholin je syntetizován v presynaptické oblasti neuronu z acetyl-CoA a cholinu a před uvolněním
je skladován ve vezikulách uložených v blízkosti aktivní zóny presynaptické membrány. Membrána
má rovněž napěťově řízené Ca2+-kanály, které se otevírají, jakmile se na membránu rozšíří akční
potenciál. Zvýšená hladina Ca2+ v zakončení neuronu aktivuje Ca+-dependentní proteinkinasu, která fosforyluje synapsin
a jiné proteiny, čímž vyvolá fúzi vezikul s plazmatickou presynaptickou
membránou a uvolnění acetylcholinu do synaptické štěrbiny. Acetylcholin se váže ke dvěma podjednotkám a, jeho
vazba vyvolá změnu konformace a krátkodobý influx sodných iontů do buňky a draselných ven z buňky.
To způsobí depolarizaci postsynaptické membrány a je-li dosaženo prahové hodnoty, otevírají se
potenciálové závislé kanály pro Na+ a vzniká akční potenciál.
Jakmile sekrece acetylcholinu ustane, jeho koncentrace ve štěrbině poklesne a přestane se vázat na
receptory. Acetylcholin je rozložen účinkem acetylcholinesterasy, která je vázána na povrchu
postsynaptické membrány.
56
57
Cholinergní synapse (mediátor je acetylcholin)
V nervosvalové ploténce jeden nervový vzruch uvolní přibl. 300 váčků, v jednom je
asi 40 000 molekul acetylcholinu; koncentrace acetylcholinu v synaptické štěrbině
vzrůstá až 10 000x. Mediátor je rychle hydrolyzován acetylcholinesterázou.
acetylcholinové receptory
postsynaptické membrány
ACETYLCHOLIN
membránová
acetylcholinesteráza
cholin
acetát
depolarizační vlna
Ca2+
Na+
zpětné
vychytávání
patobiochemie-1
58
Nikotinové cholinergní receptory
jsou acetylcholinem řízené kanály pro Na+/K+ :
v periferní části nervového systému se nacházejí
– v dendritech téměř všech periferních eferentních neuronů
(včetně adrenergních), a
– v sarkolemmě buněk kosterních svalů, v nervosvalové ploténce.
nikotinové a muskarinové.
Acetylcholinové receptory
Muskarinové cholinergní receptory
M1-M5
Metabotropní, působí přes G-proteiny (viz dále)
patobiochemie-1
patobiochemie-1 59
Receptor Nikotinový Muskarinové
M1, M3 M2
Mechanismus
účinku
Iontový kanál Gq Gi
Druhý posel DG + IP3 cAMP
Výskyt
• neurony autonomních
ganglií,
• nervosvalová ploténka,
• chromafinní buňky dřeně
nadledvin
• mozek,
• hladký
sval,
• žlazové
buňky
• myokard,
• mozek
Blok receptoru tubokurarin atropin
Acetylcholinové receptory
Receptory hlavních neurotransmiterů
60
Na+
Acetylcholinový receptor nikotinového typu –
ionotropní receptor
Výskyt: např. neuromotorická ploténka v buňkách kosterního
svalu, zakončení pregangliových neuronů.
vazba
acetylcholinu
CH3C
O
O CH2 CH2 N
CH3
CH3
CH3
+
acetylcholin
patobiochemie-1
TEST
61
• navázání ligandu na receptor otevře kanál pro Na+ ionty
• Na+ proudí kanálem po koncentračním spádu
Acetylcholinový receptor nikotinového typu
vně
uvnitř
Acetylcholin
Na+
Na+
Na+
Na+
Acetylcholin
patobiochemie-1
62
Degradace acetylcholinu
• krátce po navázání na receptor je acetylcholin odbourán
• enzym acetylcholinesterasa jej štěpí na cholin a kyselinu
octovou
CH3C
O
O CH2 CH2 N
CH3
CH3
CH3
+
acetylcholin
CH3
OH
O
+
OH
N
+
CH3
CH3
CH3
patobiochemie-1
TEST
Acetylcholinesterasa
• Hydrolýza acetylcholinu na acetát a cholin
• Je serinovou hydrolázou
patobiochemie-1 63
64
botulotoxin (Clostridium botulinum) inhibuje uvolnění
acetylcholinu
• prodlužují účinek acetylcholinu
irreversibilní (nevratné) inhibitory - organofosfáty insekticidy,
herbicidy, bojové chemické látky
organofosfáty (diisopropylfluorfosfát, soman, sarin)
reversibilní (vratné) inhibitory
používají se jako léčiva- např. při myastenia gravis
(autoimunitní onemocnění - protilátky)
karbamáty - (fyzostigmin, rivastigmin, neostigmin)
Inhibitory acetylcholinesterasy
N N
OO
NH
CH3
CH3
CH3
CH3
H
fyzostigmin
patobiochemie-1
Myastenia gravis
• T- a B-lymfocyty produkují protilátky proti acetylcholinovým
receptorům v kosterním svalu
• Protilátky se vážou na receptor (komplex receptor-protilátka)
• Následuje endocytóza a degradace v lysosomech
patobiochemie-1 65
Funkčnost receptorů reagovat s acetylcholinem je
sníženasvalová slabost
Podávání inhibitorů acetylcholinesterasy
Při chorobě myastenia gravis produkují T- a B-lymfocyty protilátky proti acetylcholinovým receptorům v
kosterním svalu. Protilátky se váží na receptor za vniku komplexů receptor-protilátka.
Komplexy jsou endocytózou odstraněny z membrány a degradovány v lyzosomech. V důsledku toho je
funkčnost receptorů reagovat s acetylcholinem snížena. Podávání inhibitorů acetylcholinesterasy napomáhá
zvýšit účinky acetylcholinu na buňky s omezeným počtem receptorů.
patobiochemie-1 66
Vratná fáze vazby
organofosfátu
Nevratná fáze vazby
organofosfátu
Vazba toxických
organofosfátů na
cholinesterasu probíhá
ve dvou fázích:
reversibilní ( lze ji
ovlivnit reaktivátory)
ireversibilní - vznik
kovalentní vazby mezi
organofosfátem a
enzymem
patobiochemie-1 67
N
+
N
+
O
N N
OH OH
Cl
-
Cl
Reaktivátory
acetylcholinesterasy
N
+
N
CH3
OH
Cl
-
pralidoxim
obidoxim
oximy s pyridinovým heterocyklem
Jak reaktivátory fungují
patobiochemie-1 68
Regenerace acetylcholinesterasy
patobiochemie-1 69
Působky reagující s acetylcholinovým
receptorem nikotinového typu
D-Tubokurarin - kompetitivní antagonista acetylcholinu, zabraňuje otevření
ionoforu (depolarizace nenastává)  paralýza kosterních svalů
pankuronium, vekuronium ad. – myorelaxancia při déle trvajících
operacích
Sukcinylcholin - agonista, váže se déle než acetylcholin a depolarizuje.
Přetrvávající depolarizace vede ke ztrátě elektrické dráždivosti membrány.
Krátkdobé myorelaxans.
Botulotoxin – proteinový komplex z Clostridium botulinum. Inhibuje uvolnění
acetylcholinu z nervového zakončení.
Nikotin - váže se na receptory v periferním, vegetativním nervovém systému,
který řídí vnitřní orgány. Zde vyvolává zvýšenou aktivitu trávícího traktu: vzestup
produkce slin a trávících šťáv a vzestup aktivity hladké svaloviny. Stoupá také
produkce potu a může dojít ke stažení zornice.
patobiochemie-1 70
(např. v nervosvalové ploténce - Na+/K+ionofor: asymetrický pentamer čtyř typů
homologních podjednotek penetrujících membránou.
změna konformace podjednotek,
kanál se během několika milisekund
mnohokrát krátce otevírá a uzavírá
vazebná místa pro lokální anestetika,
psychotropní fenothiaziny atd..
vazba dvou molekul
acetylcholinu na podjednotky 2
1 2
uzavřený kanál
synaptická
štěrbina
cytosol

2 2
– –
Na+
K+
mohutný vtok Na+
menší výtok K+
(depolarizace)
Acetylcholinový nikotinový receptor nikotinového typu
REKAPITULACE
patobiochemie-1 71
Inhibiční GABAA receptor
ligandem řízený chloridový ionofor (ROC)
otevírá se interakcí s -aminomáselnou kyselinou (GABA).
Vtok iontů Cl– vyvolá hyperpolarizaci postsynaptické membrány, čímž
znesnadní nebo znemožní vznik akčního potenciálu.
Cl–
–
–
–
–
–– –
1
2
2
2
1
heteropentamer složený ze tří typů
podjednotek
patobiochemie-1 72
Cl-
GABA
CYTOSOL
Barbituráty
Benzodiazepiny
(např. diazepam,
flunitrazepam)
Steroidy
(např. pregnanolon,
allopregnanolon)
Endozepin (diazepam-binding inhibitor,
DBI)
Agonista: muscimol
(z Amanita muscaria)
Další vazebná místa na GABA receptoru
patobiochemie-1 73
Více než jedenáct alosterických modulačních míst pro látky zesilující účin
endogenní GABA (zklidnění, omezení úzkosti a myorelaxaci):
anestetika, ethanol a četná léčiva jako např. benzodiazepiny meprobamat a
rovněž různé barbituráty.
Jiné ligandy naopak o benzodiazepinové vazebné místo kompetují nebo účinkují
i jako antagonisté GABA (inverzní agonisté),  vyvolávají neklid a úzkost (např.
endogenní peptidy zvané endozepiny).
Podobnou funkci jako GABA v mozku má v mozkovém kmenu a míše glycin.
Inhibiční účinek glycinergních synapsí blokuje alkaloid strychnin, známý křečový
jed.
Další vazebná místa na GABA receptoru
patobiochemie-1 74
Inhibiční gabaergní synapse
-Aminomáselná kyselina (GABA) je hlavním inhibičním
neurotransmiterem v CNS. Gabaergní synapse představují kolem 60 %
všech synapsí v mozku.
GABA
mitochondriální
syntéza GABA
z glutamátu
depolarizační vlna
Ca2+
GABA/benzodiazepinové
receptory
vychytání GABA gliovými buňkami
odbourání na sukcinát a přeměna
zpět na glutamát a glutamin
částečné
zpětné vychytání
(transportéry GAT 1-4)
patobiochemie-1 75
Adrenergní synapse
Neurotransmiterem naprosté většiny postgangliových sympatických neuronů
je noradrenalin.Na některých nervech může působit i adrenalin.
depolarizační vlna
Ca2+
adrenergní receptory
membrán cílových buněk
dopamin--hydroxyláza
a synaptické váčky
(axonální transport)
NORADRENALIN
presynaptické
adrenergní
receptory
mitochondriální
monoaminoxidáza
extracelulární KOMT
(katechol-
O-methyltransferáza)
částečné zpětné
vychytání
Varikosity postgangliových sympatických axonů
jsou analogické synaptickým zakončením (šńůrka
perel).
Adrenergní receptory jsou metabotropní, spolupracují s G-proteiny a
produkují druhé posly (viz dále)
76
Typ Princip účinku Výskyt
M1 Gq ve vegetativních gangliích, CNS,
b.exokrinních žláz
M2 Gi v srdci, otevírá K+-kanály
M3 Gq v hladkém svalu
M4 Gi CNS
M5 Gq CNS
Muskarinové cholinergní receptory (jsou
metabotropní)
Alkaloid atropin je na muskarinových receptorech antagonistou, brání vazbě acetylcholinu.
patobiochemie-1
patobiochemie-1
Společné strukturní rysy RECEPTORU:
Všechny mají sedm -helikálních úseků,
které jsou hydrofobní, pronikají membránou
a spojují extra- a intracelulární kličky. H2N
-COOH
II. Receptory interagující s heterotrimerními G-proteiny
Vazebné místo pro
agonistu (přítomna i
vazebná místa pro
antagonisty)
Intracelulární domény vazebné
místo pro interakci
s G-proteinem jediného
určitého typu.
Několik minut
Neurotransmitery
Hormony
Agonista-ligand vyvola
transdukci signalu
Antagonista- zabrani
77
patobiochemie-1
Heterotrimerní G-proteiny
Proteiny vázající GDP nebo GTP
většinou volně navázané na cytoplazmatickou membránu – mohou se
pohybovat podél jejího vnitřního povrchu.
Podjednotky ,  a .
Identifikováno více než 20 druhů různých
G podjednotek.
Podjednotky
G a G jsou
hydrofobní a
nespecifické.
Podjednotky G jsou
největší, vážou GDP
nebo GTP a jsou
specifické pro každý
typ mechanismu
transdukce.
78
Receptor působící prostřednictvím
G-proteinů
patobiochemie-1 79
Cyklus aktivace heterotrimerních G-proteinů interakcí
s komplexem receptor-specifický ligand
patobiochemie-1
Komplex
receptor-specifický ligand
BIOLOGICKÝ ÚČINEK
ZMĚNA KONCENTRACE „DRUHÉHO POSLA“
Trimer G-GDP,
Komplex receptor-ligand
-trimer G-GDP
Dimer 
GTP
GDP
Aktivovaná
podjednotka G-GTP
Interakce
s cílovým proteinem
Pi
Neaktivní
podjednotka G-GDP
Dimer 
80
patobiochemie-1 81
1. Stimulace adenylátcyklázy (cAMP, Ca2+)
2. Inhibice adenylátcyklázy (cAMP, K+)
3. Stimulace fosfolipázy C (DG+IP3, Ca2+)
4. stimulace fosfodiesterázy štěpící cGMP
Efektor druhý posel
TEST
patobiochemie-1
Vybrané typy G-proteinů
Typ podjednotky G Příklady
aktivujícího receptoru
Účinek aktivovaného G
na cílový protein
(nitrobuněčný signál)
Gs (stimulační) glukagon
parathyrin
-adrenergní
stimulace
Adenylátcyklázy
(cAMP, Ca2+)
Gi (inhibiční) somatostatin
2-adrenergní
inhibice
adenylátcyklázy(cAMP, K+)
Gq (aktivující PI
kaskádu)
vazopresinový V1
endotelinové ETA,B
acetylcholinový M1
1-adrenergní
stimulace
fosfolipázy C
(DG+IP3, Ca2+)
Gt (inhibiční)
(transducin)
rodopsin stimulace fosfodiesterázy
štěpící cGMP
82
Receptory aktivující Gs a Gi
stimulují nebo inhibují adenylátcyklázu
patobiochemie-1
Adenylátcykláza - membránový enzym katalyzující reakci
ATP  cAMP + PPi ;
cAMP je druhým poslem.
AMP-cyklázareceptor receptor
GS

Gi

ligand ligand
ATP
H2O
cAMP
proteinkináza A
inaktivní (R2C2)
aktivní proteinkináza A
2 C + 2 R(cAMP)2
AMP
Fosfodiesteráza*
fosforylace proteinů
(Thr, Ser)
x
* Inhibice např. kofeinem,
heofylinem
METHYLXANTINY)
83
TEST
patobiochemie-1
Účinky cAMP v buňkách
C
C R
R
Proteinkinasa
A (neaktivní)
R
R
C
C
Protein
Protein
Protein-P
Protein-P
ADP
ADP
ATP
ATP
Proteinkinasa
A (aktivní)
cAMP
Fosforylace proteinů.
V cytoplasmě - nejčastěji metabolické enzymy (rychlá odpověď)
V jádře – fosforylace genově specifického transkripčního faktoru
CREB (cAMP response element-binding protein) (pomalejší odpověď)
AKAP
AKAP
84
patobiochemie-1
cAMP vykazuje v buňce řadu rozdílných účinků.
Jedním z nejvýznamnějších účinků je aktivace proteinkinasy A, která následně fosforyluje řadu
metabolických enzymů. Účinky kináz mohou být směřovány k fosforylaci právě určitých proteinů.
K tomu slouží specifické proteiny vážící se ke kinázám. V případě proteinkinasy A se jedná o tzv.
AKAPs (A kinase anchoring proteins), které slouží jako podpůrná struktura a lokalizují pozici
proteinkinasy A poblíž určitého substrátu, který má být fosforylován a zároveň je tak omezena
jejich samovolná aktivita.
Proteinkinasa A je heterotetramerní molekula, která se skládá ze dvou regulačních podjednotek a
dvou katalytických podjednotek. V inaktivním stavu jsou podjednotky k sobě vázány. cAMP se
váže na regulační podjednotky a vyvolává jejich oddělení od katalytických podjednotek, které se
tak stávají aktivní a katalyzují přenos fosfátu z ATP na serinové nebo threoninové zbytky cílových
proteinů. Katalytická podjednotka proteinkinasy A také vstupuje do jádra a fosforyluje genově
specifické transkripční faktory nazývané CREB (cyclic AMP response element-binding protein).
CREB se váže na cAMP-responsivní element v nefosforylovaném stavu a je slabým aktivátorem
transkripce. Po fosforylaci proteinkinasou A se na CREB váže koaktivátor CBP (CREB-binding
protein) a je vyvoláno zesílení transkripce.
Některé bakteriální toxiny modifikují účinek G-proteinů. Cholera je infekční střevní onemocnění
projevující se těžkými, život ohrožujícími průjmy. Průjem je vyvolán enterotoxinem, který
produkují bakterie Vibrio cholera. Choleratoxin je bílkovina, která svým účinkem inhibuje
GTPasovou aktivitu s podjednotky Gs proteinu. Modifikovaná s podjednotka je tak
„zmrazena“ v aktivním stavu a produkuje kontinuálně cAMP. Účinkem cAMP je aktivní kanál pro
Cl− v membráně střevní buňky a jeho účinkem jsou secernovány chloridové ionty a voda do lumen
střeva. Inhibiční G-protein je cílem působení pertusis toxinu produkovaného při černém kašli
bakterií Bordetella pertusis. Výsledkem je inaktivace Gi proteinu a nadprodukce cAMP.
Kromě aktivace proteinkinasy A a fosforylace proteinů se cAMP nebo cGMP mohou navazovat na
iontové kanály a ovlivňovat jejich propustnost. Tyto pochody se uplatňují zejména při aktivaci
čichových a visuálních vjemů.
85
patobiochemie-1
Lokalizace účinku cAMP do specifické části
buňky
Proteiny AKAPs (A kinase anchoring proteins)
Proteiny vážící se k proteinkinase A, směřují její účinek k určitému
substrátu z mnoha možných.
Podobné proteiny ovlivňují také specifické účinky fosfatáz,
fosfodiesteráz ad.
86
patobiochemie-1
Příklady hormonů působících
prostřednictví aktivace PKA
Hormon Místo účinku
CRH Adenohypofýza
TSH Thyroidní folikuly
LH Leydigovy b. varlete, žluté tělísko
FSH Folikulární b. ovaria, sertoliho b. varlete
ACTH Kůra nadledvin
ADH B. distálního tubulu ledvin
PGI2 Trombocyty
Adrenalin,
noradrenalin
 - receptory v mnoha buňkách
glukagon játra
87
patobiochemie-1 88
Funkce adrenergních receptorů jsou velmi různé a liší se podle konkrétního
typu adrenergního receptoru.
•Alfa-adrenoreceptory: obecně zvýšená glykogenolýza v játrech, zvýšená
glukoneogeneze, relaxace hladkého svalstva ve střevech;[2]
• α1 receptory – po přijetí signálu dochází v cílové buňce k IP3/DAG
signalizační kaskádě;[3]
• α2 receptory – po přijetí signálu dochází v cílové buňce k inhibici syntézy
cAMP;[3]
•beta-adrenoreceptory: obecně zvýšená svalová glykogenolýza a jaterní
glukoneogeneze a glykogenolýza, mobilizace zásobního tuku, zrychlení srdeční
frekvence a prohloubení stahu;[2]
• β1, β2, β3 adrenoreceptory – po přijetí signálu dochází v cílové buňce k
zvýšené produkci cAMP.[
Adrenergní receptor čili adrenoreceptor je označení pro skupinu
receptorů spřažených s G-proteinem. Na tyto receptory se vážou různé
katecholaminy, jako je zejména noradrenalin a adrenalin
patobiochemie-1 89
Receptor 1  2
1  2
G-protein Gq Gi Gs
Druhý
posel
DG + IP3 cAMP  cAMP 
Příklady
výskytu
• hladké
svalstvo GIT
(sfinktery) a cév
kůže
(kontrakce)
• adrenergní a
cholinergní nervové
zakončení (inhibice
uvolnění přenašeče)
• pankreas
(inhibice exokrinní
sekrece)
• trombocyty
(agregace)
• myokard
(zvýšení
síly a
frekvence
stahů)
• hladké svalstvo
dělohy, bronchů
(relaxace)
• hladké svalstvo
GIT (peristaltika)
• pankreas
(aktivace
exokrinní sekrece)
Adrenergní receptory
patobiochemie-1 90
-Adrenergní receptory
Typické projevy stimulace receptorů
1 – tachykardie, inotropní účinek na myokard,
2 – bronchodilatace, vazodilatace v oblasti bronchiálního kmene,
3 – termogeneze, mobilizace tukových rezerv.
AMP-cykláza-receptor

noradrenalin / adrenalin
ATP
AMP
cAMP
fosfodiesterázy
Gs
H2O
aktivní proteinkináza Afosforylace
inaktivní
proteinkináza A
1  2
Gs
cAMP 
•
myokard
(zvýšení
síly a
frekvence
stahů)
• hladké svalstvo dělohy,
bronchů (relaxace)
• hladké svalstvo GIT
(peristaltika)
• pankreas
(aktivace exokrinní
sekrece)
patobiochemie-1 91
Adrenergní receptory 2 a 1
2-receptory
1-receptory
adenylátcykláza fosfolipáza C
PL C
pokles cAMP
Gi protein Gq protein
IP3 a diacylglycerol
vzestup [Ca2+]
aktivace PK C
Typické projevy adrenergní
2-stimulace: 1-stimulace:
sníženi exokrinní sekrece vazokonstrikce
bronchokonstrikce
snížená motilita GIT
1  2
Gq Gi
DG + IP3 cAMP 
patobiochemie-1
Oba produkty jsou sekundární „poslové“:
Inositol-1,4,5-trisfosfát otevírá kanál pro Ca2+ v membráně ER,
diacylglycerol aktivuje membránovou proteinkinázu C.
Receptory aktivující Gq protein stimulují fosfolipázu
C a spouštějí fosfatidylinositolovou kaskádu
Fosfolipáza C
Receptory tohoto typu se vážou s qisoformou
podjednotky. Výsledkem
navázání ligandu je
aktivace enzymu fosfolipasy C. Aktivovaná
forma tohoto enzymu hydrolyzuje
membránově vázaný
fosfatidylinositolbisfosfát (PIP2) za vzniku
dvou druhých poslů: diacylglycerolu (DG)
a1,4,5-inositoltrisfosfátu (IP3). IP3 má
vazebné místo na sarko- a endoplazmatickém
retikulu, kde stimuluje uvolnění Ca2+. Ionty
Ca2+ aktivují enzymy obsahující kalciumkalmodulinovou
podjednotku, včetně
proteinkinasy. Kalcium dependentní
kalmodulin kinasa II rovněž působí na CREB
v jádře. DG, který zůstává v membráně,
aktivuje proteinkinasu C, která rozšiřuje
odpověď fosforylací cílových
proteinů. 92
patobiochemie-1
Oba produkty jsou sekundární „poslové“:
Inositol-1,4,5-trisfosfát otevírá kanál pro Ca2+ v membráně ER,
diacylglycerol aktivuje membránovou proteinkinázu C.
Receptory aktivující Gq protein stimulují fosfolipázu
C a spouštějí fosfatidylinositolovou kaskádu
Fosfolipáza C
93
patobiochemie-1
fosfolipáza Creceptor
Gq

specifický ligand
PIP2 DG
aktivace
proteinkinázy C
fosforylace
vzrůst [Ca2+]
v cytoplazmě
Endoplazmatické retikulum
Ca2+
IP3-receptor v membráně ER
ligandem ovládaný iontový kanál pro Ca2+
IP3
Fosfatidylinositolová kaskáda
aktivní proteinkináza C
Ca2+
94
patobiochemie-1
Regulace metabolismu změnami
cytoplasmatické koncentrace Ca2+
•Bazální koncentrace Ca2+ v cytoplasmě  1.10-7 mol/l
•Zvýšení koncentrace na  1.10-6 rychle a účinně aktivuje různé
buněčné pochody
• zvýšení Ca2+ může nastat
buď influxem Ca2+ přes cytoplazmatickou
membránu (viz např. kontrakce hladkého svalu)
nebo uvolněním z intracelulárních zásob (ER,
mitochondrie) např. IP3 závislý kanál pro Ca2+ v
ER, nebo ryanodinové kanály v kosterním a
srdečním svalu
95
patobiochemie-1
Regulační bílkovina kalmodulin
Zvýšení hladiny Ca2+ aktivuje řadu na Ca2+-závislých proteinů,
které tvoří rodinu malých na kalciu závislých proteinů.
Nejvýznamější je kalmodulin. Je přítomen téměř ve všech
buňkách.
Vazba Ca2+ na kalmodulin (4 vazebná
místa) mění jeho konformaci a
aktivuje jeho interakci s dalšími
proteiny, např. kinasami, fosfatasami
ad.
Některé Ca-kalmodulin-dependentní
kinasy jsou vysoce specifické, jiné mají
širokou substrátovou specifitu. 96
patobiochemie-1
Příklady hormonů působících
prostřednictvím aktivace
fosfatidylinositolového systému a PKC
Hormon Místo účinku
TRH Adenohypofýza
GnRH Adenohypofýza
TSH Thyroidní folikuly
Angiotensin II/III Kůra nadledvin (zona
glomerulosa)
Adrenalin 1- receptory
97
patobiochemie-1
III. A) Receptory s guanylátcyklasovou aktivitou
Po navázání ligandu přeměňují GTP na cGMP
cGMP je druhým poslem
Aktivuje proteinkinasu G
Dva druhy receptorů:
•membránový
•cytoplazmatický
III. Receptory s enzymovou aktivitou
cGMP může být rovněž druhým poslem. Na rozdíl od
adenylátcyklasy, guanylátcyklasa není
aktivována G-proteiny.
Rozlišují se dva typy guanylátcyklasy: membránově
vázané enzymy, které
jsou aktivovány přímo extracelulárními ligandy a
rozpustné enzymy v cytoplazmě, které reagují na
malé difuzibilní molekuly. Oba typy quanylátcyklasy se
nacházejí v buňkách hladkého svalu cév.
98
patobiochemie-1
Membránové receptory s guanylátcyklasovou aktivitou
ANP
GTP cGMP + PPi
proteinkináza G
inaktivní
aktivní proteinkináza G (PKG)
fosforylace proteinů
Receptory pro ANP
Přítomny hlavně v hladkém
svalu cév a v ledvinách
ANP je secernováno myocyty
atria v reakci na zvýšení
objemu nebo tlaku krve
GMP
fosfodiesteráza
H2O Membránově vázaný enzym je receptorem pro natriuretické peptidy (ANP, BNP,
urodilatin). Receptor má extracelulární doménu pro vazbu ligandu, jednoduchý
transmembránový helix a intracelulární guanylátcyklasovou doménu.
Guanylátcyklasová aktivita je zahájena navázáním ANP na extracelulární
doménu. Podobně jako cAMP i cGMP působí prostřednictví aktivace
proteinkinasy.
Tato kinasa se dle konvence označuje proteinkinasa G. Receptory natriuretických
peptidů jsou přítomny v hladkém svalu cév, v ledvinách a dalších tkáních. ANP
je secernováno myocyty atria v reakci na zvýšení objemu nebo tlaku krve v pravé
síni a vyvolá relaxaci vaskulatury, čímž se sníží celkový periferní odpor a zlepší
lokální průtok krve. V ledvinách dilatuje aferentní a zužuje eferentní
glomerulární arteriolu a relaxuje mesangiální buňky. Tak zvyšuje tlak v
kapilárách glomerulů, zvyšuje glomerulární filtraci a zvyšuje tak exkreci sodíku
a vody. 99
patobiochemie-1
Cytoplazmatické receptory s guanylátcyklasovou
aktivitou
NH2 NH2
hem
NO
GTP cGMP
Receptor je dimerní a váže hem
NO se váže na hem, jeho vazba zvyšuje
katalytickou aktivitu guanylátcyklasy
NO je generováno účinkem
nitroxidsyntasy (NOS)
NO snadno prochází membránami ,
může být generováno i jinými buňkami
a do cílové buňky proniknout difuzí
Aktivace
proteinkinasy G
fosfodiesterasa
GMP
Rozpustná guanylátcyklasa
Rozpustná guanylátcyklasa se nachází v cytoplazmě mnoha buněk. Je to dimerní
molekula, obsahující hem. Váže NO, který vyvolává v její struktuře konformační
změny a zvyšuje její enzymovou aktivitu. NO je syntetizován nitroxidsynthasou
(NOS) z argininu. Vzniká v organismu také z některých exogenních sloučenin, tzv.
donorů NO, např. nitroglycerinu, nitroprusidu. cGMP je degradováno
několika typy rozpustných nebo membránově vázaných cGMP fosfodiesteras.
Inhibitory cGMP fosfodiesteras vedou též ke zvýšení cGMP a prodloužení relaxace
hladké svaloviny
100
patobiochemie-1
Proteinkinasa G
cGMP sensitivní proteinkinasa G
Rozšířena v mnoha tkáních
Fosforyluje různé proteiny (enzymy, transportní proteiny ad.)
Účinek PKG v hladkém svalu
Fosforylace proteinů:
• inaktivace proteinů podporujících uvolnění Ca2+ z ER   Ca2+
• aktivace MLC fosfatasy  potlačení interakce aktin-myosin
• snížení aktivity K+-kanálů, které podporují hyperpolarizaci  snížení
influxu Ca2+ do buňky
Relaxace hladkého svalu 101
patobiochemie-1
Význam NO/cGMP signalizace v hladkém
svalu cév
cGMP je klíčový druhý posel pro indukci relaxace hladkých
svalů cév
 vasodilatace a zvýšený průtok krve
NO je produkován v endotelových buňkách
nitroxidsyntasou z argininu (aktivace např. acetylcholinem)
a difunduje do přilehlých buněk hladkého svalu
L-Arg ·NO + L-citrullin
NO-synthasa
102
patobiochemie-1
R-O-NO2 nitrit ·NO
Léky typu organických nitrátů jsou zdrojem
exogenního NO
Glyceroltrinitrát
Isosorbidinitrát
Terapie anginy pectoris
Aktivace rozpustné
guanylátcyklasy
Vasodilatační účinek na arterie uvolní koronární
spasmus a normalizuje prokrvení
103
patobiochemie-1
Inhibice fosfodiesterasy potencuje účinek NO
cGMP GMP
fosfodiesterasa
H2O
Lék sildenafil (Viagra) působí jako selektivní inhibitor fosfodiesterasy 5
(PDE5), která je vysoce exprimována v hladkém svalstvu cév. Viagra
podporuje účinek NO·, uvolňující se během sexuální stimulace tím, že
inhibuje PDE5 a zvyšuje hladinu cGMP v corpora cavernosa.
Výsledkem je relaxace hladké cévní svaloviny a přívod krve do corpora
cavernosa.
Existuje více typů
fosfodiesteras, v
závislosti na typu
buněk.
104
patobiochemie-1
III. B) Receptory s tyrosinkinázovou aktivitou
Společné rysy
•Po navázání působku na receptor dochází ke konformační změně
• aktivuje se tyrosinkinázová aktivita receptoru
• dochází k autofosforylaci tyrosinů receptoru, případně dalších proteinů
(IRS)
• na fosforylovaný receptor a substráty fosforylované receptorem se váží
další proteiny, tzv.adaptorové molekuly
• adaptorové proteiny se vážou k fosfotyrosinovým zbytkům pomocí
SH2 domén (Src homology 2 domain).
• adaptorové proteiny reagují s dalšími molekulami a signál je dále
přenášen kaskádou fosforylačních/defosforylačních reakcí, výměnou
guaninových nukleotidů, změnami konformací atd.
105
patobiochemie-1
Rodina membránových receptorů s tyroxinkinasovou aktivitou je tvořena receptory pro růstové
faktory a inzulin. Růstové faktory stimulují mitosu, buněčnou diferenciaci, migraci buněk a apoptózu.
Inzulin stimuluje využití živin. Společným znakem receptorů je intracelulární tyrosinkinasová
doména.
Do podrodiny receptorů s tyrosinkinasovou aktivitou patří dále např. IGF-1 (insulin-like growth factor-1)
receptor; EGF (epidermal growth factor) receptor; PDGF (platelet-derived growth factor) receptor.
106
patobiochemie-1


-S-S-
-S-S-


-S-SDimerní
struktura
Vazebné místo pro insulin na - podjednotkách
Tyrosinkinázová aktivita na -podjednotkách
Insulinový receptor
Navázání insulinu na receptor  tyrosinkinázová aktivita
autofosforylace -podjednotek a fosforylace proteinů IRS 1-4
(insulin receptor substrates 1-4)


-S-S-
-S-S-


-S-S-
Insulin
-P-P P-P-
IRS1-4
IRS1-4 -P
vazba PI-3-kinázy na membránu
aktivace fosfoproteinfosfatázy-1
aktivace Ras – exprese genů
Po vazbě
insulinu na
receptor
dochází k
internalizaci
komplexu
hormon
receptor,
receptory jsou
částečně
recyklovány
107
patobiochemie-1
Inzulinový receptor
Inzulinový receptor je přítomen v membránách ve formě dimeru. Každý monomer se skládá z
extracelulární podjednotky a podjednotky , která je integrání membránovou bílkovinou.
Podjednotky a jsou spojeny disulfidovou vazbou a disulfidová vazba je i mezi oběma
monomery. Vazebná místa pro inzulin jsou na podjednotkách. Podjednotky obsahují
domény s vlastní tyrosinkinasovou aktivitou. Po navázání inzulinu se podjednotky vzájemně
fosforylují.
108
patobiochemie-1
Aktivovaný fosforylovaný receptor váže proteiny nazývané IRS (inzulin receptor substrate, označují
se též jako adapterové proteiny) a fosforyluje je na několika místech (fosforylace na cca 20
tyrosinových zbytcích).
Tím se na IRS aktivují vazebná místa pro různé proteiny, které jsou zapojeny
do zprostředkování různých účinků inzulinu. Proteiny se napojují na vazebná místa na IRS a tím se
aktivují. Většina proteinů se váže na tato místa pomocí specializovaných SH2 domén (src homology).
Na jedno z míst se váže protein Grb2 (growth factor receptor-bound protein), který je připojen
k membráně pomocí fosfolipidové kotvy. Prostřednictvím Grb2 je aktivován membránově vázaný
G-protein Ras. Ras na rozdíl od heterotrimerních G-proteinů je monomerem.
Podobně jako alfapodjednotka
heterotrimerního G-proteinu existuje v neaktivní GDP a aktivní GTP formě. Aktivací
prostřednictvím Grb2 se zvýší počet aktivních Ras-GTP molekul, které aktivují proteinkinasy a
vyvolají Ras a MAP (mitogen activated protein) signální kaskády. Výsledkem je fosforylace proteinů
v cytoplazmě a jádře, kde jsou tak regulovány transkripční faktory.
V jiném fosfotyrosinovém místě IRS se váže PI-3 kinasa, čímž je aktivována. Fosforyluje inositolové
fosfolipidy v membráně v pozici 3. Např. konvertuje fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát na fosfatidylinositol-
3,4,5-trisfosfát. Aktivované fosfolipidy pak působí jako druzí poslové a podílí se na aktivaci
dalších proteinů. Patří mezi ně proteinkinasy B a C, které zprostředkovávají řadu dalších účinků
inzulinu v buňce. Jedním z účinků je expozice transportérů GLUT ve svalech a adipocytech do membrány.
109
patobiochemie-1
Některé signální dráhy insulinu
http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=10602&pid=7
110
patobiochemie-1
Substráty insulinového receptoru IRS1-4 jsou adaptorové proteiny.
Jsou-li komplexem insulin-receptor fosforylovány, navazují se na další
proteiny a aktivují je tak.
Syntéza glykogenu
Fosforylace IRS aktivuje regulační
podjednotku PI-3 kinázy
Katalytická podjednotka PI-3 kinázy
fosforyluje PIP2 na PIP3
PIP3 aktivuje proteinkinázu B (AKT)
Aktivaci PKB (AKT) napomáhá PDK
Aktivovaná AKT difunduje do
cytoplazmy a foforyluje (inaktivuje)
glykogensynthasa kinázu
Syntéza glykogenu je aktivována
(aktivní je defosforylovaná forma
glykogensyntázy)
Translokace glukosových transportérů
Insulinový receptor fosforyluje CbI (IRS)
Komplex CbI-CAP se translokuje do
lipidového raftu v membráně
CbI reaguje s adaptorovým
proteinemCrk
Crk asociován s C3G
C3G aktivuje TC10 (G-protein)
Aktivuje translokaci transportérů do
plasmatické membrány
Příklady mechanismu účinku insulinového receptoru
111
patobiochemie-1
Receptor pro epidermální růstový faktor EGF
Po navázání ligandu dochází k dimerizaci receptorů
R R
R R
-P
-PPP-
SoS
Ras–GTP
Raf
fosforylační
Kaskáda MAP
fosforylace
Tím se aktivuje tyrosinkinasová aktivita v cytoplazmatické doméně.
Autofosforylace receptoru
Na fosforylovaná místa se váží adapterové proteiny Grb2 (SH-2 domény).
Prostřednictvím proteinu SOS je aktivován G-protein Ras aktivace MAPkinasové
kaskády (Ras/MAP-kaskáda)
Receptor s tyrosinkinasovou aktivitou
112
patobiochemie-1
Ras je monomerní G-protein (strukturní
analog -podjednotky)
SoS
Aktivace Ras - klíčový krok při přenosu signálu.
Inaktivní Ras-GDP přechází na aktivní Ras –GTP, který
aktivuje další člen dráhy.
Inaktivace Ras - následná hydrolýza GTP pomocí proteinů
aktivujících GTPasovou aktivitu G-proteinu
Monomerní G-protein - váže GTP a současně má GTPasovou aktivitu.
Aktivuje se vazbou GTP místo GDP
113
patobiochemie-1
Superrodina Ras proteinů
5 rodin: Ras, Rho, Arf, Rab, Ran
Zakotveny k lipidové membráně pomocí lipidových
kotev (myristoyl, farnesyl)
Monomerní G-proteiny, které hrají důležitou roli při
regulaci růstu, morfogeneze, buněčné motility,
cytokineze apod.
Mutace v genech Ras navozují patologickou
proliferaci a antiapoptózu. Mutace Ras se vyskytují
asi u 30 % všech lidských karcinomù.
114
patobiochemie-1
MAP-kinázová signální dráha (Mitogen activated protein kinase)
Map-kinasová kaskáda
Ras–GTP
MAP-kinase-kinase-kinase
MAP-kinase-kinase
MAP-kinase
Fosforylace
cytosolových nebo
membránových
proteinů
Fosforylace regulačních proteinů
v jádře, podpora proliferace (např.
aktivace transkripčních faktorů
ATP
ATP
ATP
ADP
P
ADP
ADP
ADP
ATP
P
P
MAPKKK, Raf
Především
reguluje buněčný růst
a diferenciaci.
MEK
ERK
Popsány 3 systémy, nejznámější ERK.
115
patobiochemie-1
Zkratka Název Funkce
PDGF Růstový faktor odvozený
z destiček
mitogen pro buňky pojivové tkáně
a nediferencovanou neuroglii
EGF Epidermální růstový
faktor
mitogen řady buněk
ektodermálního a mesodermálního
původu
FGF-2 Fibroblastový růstový
faktor 2
Mitogen pro řadu buněk jako
fibroblasty, endotelové buňky,
myoblasty; indukuje embryonální
mesoderm
IL-2 Interleukin 2 Mitogen pro T-lymfocyty
Mitogeny - růstové faktory podporující proliferaci
Příklady mitogenů:
116
patobiochemie-1
Receptory se serin/threonin kinázovou aktivitou
Ligandem je např. transformující růstový faktor- (TGF- )
Po navázání ligandu receptory dimerizují a aktivuje se
serin/threonin kinázová aktivita v příslušných doménách
Jedna aktivní podjednotka fosforyluje partnerskou podjednotku v
katalytickém místě
Fosforylovaná partnerská podjednotka fosforyluje
cytoplazmatické proteiny SMAD
Proteiny SMAD se fosforylací aktivují a vytváří dimery s dalšími
SMAD proteiny
Translokace do jádra, kde interagují s dalšími rgulačními proteiny
P
P
P
P
Migrace do
jádra
SMAD
SMAD
117
patobiochemie-1
IV. Receptory aktivující nereceptorové tyrosinkinázy
ligand
dimerizace
–PSTAT
STATSTAT
JAK-STAT receptory (Janus Kinase – Signal Transducer and Activator of Transcription)
Receptor nemá kinasovou aktivitu, ale je asociován s tyrosinkinasou JAK.
Po navázaní ligandu receptory dimerizují (homodimery nebo heterodimery)
Aktivované JAKs fosforylují tyrosinové zbytky na receptoru.
Na fosforylovaná místa se vážou adaptorové proteiny STAT (pomocí SH2
domény)
STAT jsou fosforylovány a dimerizují.
Dimery STAT translokují do jádra, kde působí jako transkripční faktory
–P STAT
–PSTAT
118
patobiochemie-1
JAK-STAT receptory – rodina receptorů pro
*cytokiny (např.interferony, interleukiny)
Různorodé účinky cytokinů jsou způsobeny existencí velkého
množství STAT proteinů
Receptory pro různé cytokiny vážou různé STAT, které vytváří
heterodimery v různých kombinacích
Tak je umožněno, že různé cytokiny ovlivňují různé geny
Receptory kooperující s JAK-STAT mají také prolaktin,
erythropoetin ad.
*Cytokiny – malé signální proteiny, účastnící se významně imunitní odpovědi. Jsou produkovány
buňkami imunitního systému (makrofágy, T-lymfocyty atd.) a jsou schopné navodit například
rychlé dělení a diferenciaci určitých typů buněk, které se účastní boje proti patogenům a další rysy
imunitní obrany
119
patobiochemie-1
Regulace membránových receptorů
Regulace změnou počtu receptorů
(down regulace, up regulace)
Regulace vlastnosti
receptoru (desenzitizace)
Př.: desenzitizace - adrenergního receptoru
Po navázání ligandu na receptor se aktivuje BARK (-adrenergní receptor
kinasa)
V cytoplazmatické části receptorové molekuly dochází k fosforylaci
Na fosforylované místo se váže bílkovina arrestin, který inhibuje schopnost
aktivovat G-protein
120
patobiochemie-1 121
patobiochemie-1 122
Receptory nejvýznamnějších neurotransmiterů
Receptory kooperující s G-proteinyIontové kanály
(ROC) Gs (vzestup cAMP) Gi (pokles cAMP) Gq (vzestup IP3 /DG)
– adrenergní β1,β2,β3 adrenergní α2 adrenergní α1
Na+/Ca2+/K+
– glutamátové ionofory
glutamátové mGluR
skupiny II a III
glutamátové mGluR
skupiny I
dopaminové D1,5 dopaminové D3,4 dopaminové D2
– serotoninový 5-HT3 serotoninové 5-HT4,6 serotoninový 5-HT1 serotoninové 5-HT2
histaminový H2 histaminové H3,4 histaminový H1
– – tachykininový NK1
pro substanci P
Cl– – GABAA
– glycinový
GABAB (metabotropní) – –
–
Na+/K+ – acetylcholinový
nikotinový
acetylcholinové
muskarinové M2,4
acetylcholinové
muskarinové M1,3,5
–
–
–
–
patobiochemie-1 123
patobiochemie-1 124
Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE)
Imunodetekce konkrétního proteinu
Přenos proteinů z gelu na
membránu
= Western blot
Detekce proteinu protilátkami
(primární = rozeznává detekovaný protein
sekundární = rozeznává protilátky z určitého
organismu
Vizualizace pomocí barevné reakce,
fluorescence či chemiluminiscence
Sekundární protilátky konjugované
s enzymem či fluorescenční značkou
membrána s navázanými proteiny
Primární
protilátka
W. blot
patobiochemie-1 126
Cvičení č. 1: Imunochemická detekce proteinu p53 na
nitrocelulosové membráně (dot blot)
Dot blot je zjednodušenou alternativou k western blotu a slouží pro detekci a
identifikaci proteinů. Na rozdíl od western blotu nedochází k elektroforetické separaci,
nelze tedy určit velikost cílového proteinu, můžeme však přítomnost daného proteinu
potvrdit – v našem případě p53. Kapka vzorku je nanesena přímo na nitrocelulosovou
membránu, kde je následně protein zájmu imunochemicky detekován.
Principem imunochemické detekce je využití reakce antigen-protilátka. Antigeny jsou
látky, které organismus rozpoznává jako cizorodé. Jejich přítomnost stimuluje tvorbu
protilátek. Každý antigen obsahuje antigenní determinanty (epitopy) tvořené 5-8
aminokyselinami. Schopnost protilátek rozlišovat i malé rozdíly epitopů je základem
specifity imunitních reakcí.
Protilátky jsou charakterizovány afinitou – síla vazby protilátky s jednou vazebnou
determinantou antigenu, aviditou – síla vazby mezi protilátkou a celou molekulou
antigenu (většina antigenů je multivalentních, tzn. má více vazebných determinant pro
různé protilátky) a specifitou – protilátky jeví minimální interferenci s látkami, pro
které není protilátka určena. Protilátky mohou být polyklonální či monoklonální.
patobiochemie-1 127
A B C
Analýza neznámého vzorku
Vzorky
Wild type p53
Mutantní p53
Voda
patobiochemie-1 128
patobiochemie-1 129
patobiochemie-1 130
patobiochemie-1 131
Hormonální systém
Hormony
• látky s výraznými regulačními účinky, řídí, indukují, potlačují enzymy
• K cílovým orgánům krví a tkáňovým mokem, mízou
• Buňka musí mít receptor na příjem hormonu (působí jen na určité orgány a
tkáně), jeden signál může spustit více reakcí, různé buňky odpovídají různě,
na buňku působí více hormonů
Hormony jsou endogenní, telu vlastní látky produkované specializovanými
bunkami a jimi vylucované do okolí.
Parahormony, tkánové hormony – nejsou tvoreny specializovanými bunkami –
histamin, kininy,prostaglandiny
Neurohormonální regulace
• Systém hormonální regulace, spojen s
nervovým systémem, CNS ovlivňuje
(hypofýza), proto neurohormonální
regulace
• Adenohypofýza (přední lalok hypofýzy) +
hypotalamus – regulují, kontrolují činnost
hormonů
Hypotalamus pod vlivem vyšších mozkových center
produkuje hypotalamické faktory (stimulační = liberiny,
inhibiční = statiny), krví jdou do adenohypofýzy, ovlivňují
vylučování tropních hormonů z adenohypofýzy, ty ovlivňují
žlázy s vnitřní sekrecí
• Hormonální regulace relativně pomalá
regulace (sekundy až dny), nervová
regulace rychlá
Typy hormonů
Chemické typy endokrinních hormonů:
• Peptidy, bílkoviny (hypofýza, slinivka břišní, přištítná
tělíska, tkáňové hormony)
• Deriváty tyrosinu (dřeň nadledvin, štítná žláza)
• Steroidy (kůra nadledvin a pohlavní žlázy)
• Lokální mediátory, parakrinní hormony, tkáňové
hormony - histamin, serotonin, oxid dusný,
epidermální růstový faktor, sekretin, erythropoetin
patobiochemie-1 135
patobiochemie-1 136
patobiochemie-1 137
Štítná žláza(1,2) a příštítná tělíska(3)
1. Thyroxin (tetrajodthyronin) – růst a vývoj mladého organismu, nedostatkem
kretenismus. Povzbuzuje látkovou přeměnu živin, podporuje tvorbu oxidoreduktas.
2. Kalcitonin – 32 AMK snižuje hladinu vápníku v krvi, podporuje ukládání v kostech,
význam hlavně při růstu a v těhotenství
3. Parathormon – 84 AMK, vyplyvování Ca a P z kostí, zvyšuje hladinu Ca a P v krvi
Slinivka břišní - pankreas
Žláza s vnitřní (Langerhansenovy ostrůvky –
endokrinní fce) a vnější sekrecí (trávicí enzymy)
4. Inzulín – 21 AMK – regulátor metabolismu
sacharidů a bílkovin – podporuje vstřebávání
glukosy do buněk, oxidaci glukosy. Nedostatek
cukrovka – vysoká koncentrace cukru v krvi.
5. Glukagon – 29 AMK – antagonista inzulínu, opačné
účinky. Podporuje rozklad glykogenu v játrech a ve
svalech, zvýšení množství v krvi.
Kůra nadledvin
Mnoho hormonů - kortikoidy, steroidní povahy, různý
význam
6. Glukokortikoidy regulují katabolické děje, rozklad
bílkovin, tuků, využití energie. Například kortisol –
katabolický hormon, význam při zátěži a hladovění.
7. Mineralokortikoidy – hospodaření s vodou a
minerály. Například aldosteron.
Dřeň nadledvin
Více hormonů (např. noradrenalin), z tyrosinu
8. Adrenalin – podpora odbourávání glykogenu v játrech
a svalech, zvyšuje hladinu glukosy v krvi, zvyšuje krevní
tlak. Vyplavování při námaze a vzrušení.
NH2
+
OH
OH
CH3
OH
Pohlavní žlázy
Steroidní látky, varlata a vaječníky (v těhotenství placenta
– např. chorioganodotropin – těhotenské testy)
9. Testosteron – funkce pohlavních orgánů, vznik
sekundárních pohlavních znaků, tvorba spermií,
syntéza bílkovin
10. Estrogeny – průběh menstruace, vývoj pohlavních
orgánů, distribuce podkožního tuku – vaječníky,
placenta
11. Progesteron – těhotenství - vaječníky, placenta
Imunochemické
stanovení koncentrace
hCG v krvi nebo moči
se uplatňuje především
v diagnostice
těhotenství a sledování
jeho průběhu. Již
několik dní po
oplodnění dochází ke
zvýšení koncentrace
hCG v krvi matky
natolik, že toto zvýšení
lze stanovit. HCG je
nezbytný pro udržení
žlutého tělíska v
prvních 4 až 6 týdnech
těhotenství a tedy i pro
úspěšný průběh
těhotenství.
Abnormálně nízké
hodnoty koncentrace
hCG signalizují
zvýšenou
pravděpodobnost
spontánního potratu .
Naopak zvýšené
hodnoty koncentrace
hCG signalizují
vícečetné těhotenství.
Neurohypofýza – zadní lalok
podvěsku mozkového
12. Oxytocin - 9 AMK – kontrakce hladkého svalstva
dělohy při porodu a koitu, činnost mléčných žláz
13. Antidiuretický hormon, vasopresin – 9 AMK –
resorpce vody z moči, zvyšuje krevní tlak. Vyplavování
podporuje horko, útlum alkoholem a chladem
Adenohypofýza
Přední lalok, dirigent hormonů,
podléhá hypotalamu (
vylučuje hypotalamické
faktory – bílkoviny,
transportovány do
adenohypofýzy)
14. Tropní hormony – řídí
ostatní žlázy, např.
kortikotropin ( 39 AMK - H-S-Y-S-
M-E-H-F-R-W-G-K-P-V-G-K-P-V-G-K-K-R-R-P-V-K-V-Y-P-N-GA-E-D-E-S-A-E-A-F-P-L-E-F-OH
),
gonadotropiny (90 až 120
AMK)
15. Somatotropin (191 AMK) –
tvorba bílkovin, dříve růstový
hormon
patobiochemie-1 145
patobiochemie-1 146