ENZYMY – enzymová
katalýza.
2_1 ENZYMY
• Enzymy jsou katalyzátory biologických systémů umožňující
chemické přeměny. Umožňují také transformaci jedno druhu
energie na druhý.
• Pro enzymy je charakteristická katalytická síla a specifita.
• Katalytická síla enzymu je definována jako poměr rychlosti
reakce katalyzované enzymem a rychlosti reakce
nekatalyzované.
• Katalýza se uskutečňuje v místě molekuly enzymu nazvaném
aktivní místo.
• Látka jejíž přeměnu enzym katalyzuje se nazývá SUBSTRÁT.
• Téměř všechny známé enzymy jsou proteiny (RNA jsou
pravděpodobně nejranější katalyzátory - ribozymy).
UREASA z fazolu
• Ureasa EC 3.5.1.5; systematický název: urea
(močovina): amidohydrolasa;
• Enzym obsahuje Ni2+; katalyzuje hydrolýzu močoviny na
oxid uhličitý a amonné ionty.
• Při teplotě 20oC je rychlostní konstanta ureasou
katalyzované reakce 3 x 104.sec-1.
• Nekatalyzovaná reakce má rychlostní konstantu
3 x 10-10. sec-1.
• Poměr rychlostních konstant: 1014.
• Katalytická síla ureasy je 1014.
• Enzymy urychlují ustanovení rovnováhy chemické
reakce. Neovlivňují rovnovážnou konstantu.
• Např. karbonátanhydratasa může katalyzovat hydrataci
milionu molekul CO2 za sekundu.
• Enzymy jsou specifické ve smyslu katalyzované reakce
(specifita účinku) a ve smyslu výběru substrátu
(substrátová specifita).
• Enzymy snižují aktivační energii reakce. Tvoří komplex
se substrátem.
• Součástí enzymů jsou malé molekuly – kofaktory.
• Proteinová část enzymu – apoenzym.
• Katalyticky aktivní enzym – holoenzym.
• Apoenzym + kofaktor = holoenzym.
• Kofaktory rozumíme neproteinové částice, obvykle
nízké molekulové hmotnosti, které jsou nezbytné pro
aktivitu enzymů. Kofaktory, jako např. kovové ionty
různé ionty solí, které zvyšují aktivitu enzymů se
nazývají aktivátory. Organické molekuly, které se dají
od apoenzymu oddělit (např. hydrolýzou) se nazývají
koenzymy.
• Kofaktory kovalentně vázané na apoenzym se označují
jako prosthetická skupina.
• Kofaktory Enzymy
• Koenzymy
• Thiaminpyrofosfát (TPP) Pyruvátdehydrogenasa
• Flavinadenindinukleotid (FAD) Monoaminoxidasa
• Nikotinamidadenindinukleotid (NAD+) Laktátdehydrogenasa
• Pyridoxalfosfát Glykogenfosforylasa
• Koenzym A (CoA) Acetyl CoAkarboxylasa
• Biotin Paruvátkarboxylasa
• 5'- Deoxyadenosylkobalamin Methylmalonylmutasa
• Tetrahydrofolát Thymidylátsynthasa
• Kovy
• Zn2+ Karbonátanhydrasa
• Zn2+ Karboxypeptidasa
• Mg2+ Hexokinasa
• Ni2+ Ureasa
• Mo Nitrátreduktasa
• Se Glutathionperoxidasa
• Mn2+ Superoxiddismutasa
• K+ Propionyl CoA karboxylasa
Enzymové kofaktory:
• Enzymy druhově nespecifické – specifické na štěpenou vazbu.
• Mnohé katalyzující také reakce štěpení esterů což se využívá
ke sledování jejich aktivity.
• Trypsin štěpí peptidovou vazbu v místě, kde je na straně
karboxylu Lys nebo Arg nenásleduje-li Pro.
• Thrombin, enzym podílející se na procesu srážení krve štěpí
pouze vazbu Arg-Gly.
Proteolytické enzymy (proteasy, proteinasy):
Vazebné místo peptidu štěpené trypsinem:
N
H
C
C
N
H
C
C
O
R
H
O
H
R2
Lysin
nebo
Arginin
Místo hydrolytického
štěpení
Vazebné místo peptidu štěpené thrombinem:
Glycin
N
H
C
C
N
H
C
C
O
R
H
O
H
H
Místo hydrolytického
štěpení
Arginin
Názvosloví enzymů
• Triviální názvy – např. ureasa, trypsin, pepsin.
• Systematické – popis chemické reakce, kterou enzym
katalyzuje, koncovka –asa.
• Např. alkoholdehydrogenasa katalyzuje reakci (oxidaci
alkoholu na aldehyd):
• Ethanol + akceptor elektronů = acetaldehyd + redukovaný akceptor
• V tomto případě je akceptorem NAD+, který se redukuje na NADH + H+ (proton se
uvolňuje do prostředí).
• NAD+ je nikotinamidadenindinukleotid (oxidovaná forma)
• EC x. y. z. p. čtyřciferný kód
• Příklad: Alkoholdehydrogenasa, EC 1.1.1.1
• Systematický název: Alkohol:NAD+ oxidoreduktasa
• 1. oxidoreduktasy (oxidačně-redukční reakce)
• 1. 1 Působí na CH-OH skupinu donoru
• 1. 1. 1 Akceptor NAD+ nebo NADP+
• 1. 1. 1. 1(pořadí enzymu v podpodtřídě)
Systematická klasifikace enzymů
dle enzymové komise (EC):
Enzymové třídy
• Třídy enzymů
• Třída Katalyzovaná reakce Příklad
• 1. Oxidoreduktasy Oxidačně-redukční Alkoholdehydrogenasa
• 2. Transferasy Přenos skupin Proteinkinasy
• 3. Hydrolasy Štěpení vazeb za účasti vody Trypsin
• 4. Lyasy Adice na dvojnou vazbu
• nebo odštěpení skupin
• za tvorby dvojné vazby Fumarasa
• 5. Isomerasy Izomerace (geometrické
a strukturní změny
uvnitř molekuly) Glukosafosfátmutasa
• Podřídy: 5. 1 racemasy nebo epimerasy
• 5. 2 cis-trans-isomerasy
• 5. 3 intramolekulaární oxidoreduktasy
• 5. 4 intramolekulární transferasy (mutasy)
• 5. 5 intramolekulární lyasy
• 5. 6 ostatní isomerasy
• 6. Ligasy Spojení dvou substrátů Karbamoylfosfát•
za spotřeby ATP synthetasy
Energetika enzymových reakcí
• Změna volné(Gibbsovy) energie je termodynamická
funkce vedoucí k pochopení katalytického účinku
enzymů.
• 1. Reakce probíhá samovolně, když má D G negativní
znaménko.
• 2. Systém je v rovnováze, když je DG = 0.
• 3. Reakce neprobíhá samovolně, když je DG pozitivní.
Musí být dodána volná energie.
• Negativní DG neznamená, že reakce proběhne
dostatečně rychle. Rychlost reakce závisí na volné
aktivační energii DG*.
Standardní volná energie a její vztah
k rovnovážné konstantě reakce.
• A + B C + D
DG = DGo
+ RT ln [C] [D] / [A] [B]
DGo
= změna standardní volné energie
• Standardní podmínky: všechny reaktanty jsou přítomny
v koncentracích 1, 0 M.
• V biochemii: standardní stav pH = 7. Aktivita H+ a vody je rovna 1.
• Označení: DGo´.
• Keq
´ = [C] [D] / [A] [B]
DG
o´ = - 2, 303 RT log10 Keq
´
• Keq
´ = 10- DGo´ / (2, 303 RT)
• Při 25oC
• Po zjednodušení: Keq
´ = 10- DGo´ / 1, 36
Rovnovážná konstanta za standardních podmínek:
Enzymy snižují aktivační energii – volnou energii aktivace
Směr reakce
Volnáenergie
Substrát
Produkt
Přechodový stav, S
DG (katalyzovaná)
DG (nekatalyzovaná)
DG reakce
Závislost reakční rychlosti enzymové reakce na koncentraci
substrátu. Reakce dosahuje limitní rychlosti, dříve označované jako
maximální (Vlim).
Koncentrace substrátu [S]
Reakčnírychlost[vO
]
Limitní rychlost (Vlim
)
Saturační křivka
Model zámek a klíč (lock and key)
a
b c
Komplex ES
Substrát
a
b c
Enzym
Aktivní
místo
+
Model indukovaného přizpůsobení
(induced fit)
a
b c
Komplex ES
Substrát
a
b c
Enzym
Aktivní
místo
+
Rovnice Michaelise a Mentenové:
• Kinetický popis aktivity enzymu.
• Reakční rychlost vo se obvykle vyjadřuje jako počet molů
produktu vytvořených za sekundu.
• Podmínky pro odvození kinetické rovnice Michaelise
a Mentenové:
• Tvorba komplexu enzym-substrát [ES]
• Měříme počáteční rychlost vo , kdy se nenahromadilo takové
množství produktu, že by ovlivňovalo zpětnou reakci.
• Ustálený stav – koncentrace [ES] se nemění i když
koncentrace substrátu a produktu se mění. Rychlost tvorby
[ES] je shodná s rychlostí rozpadu [ES].
k2
E + S
k1
ES
kcat
E + P
Ustálený stav
Tvorba [ES] = Rozpad [ES]
k1
[E][S] = k2
[ES] + kcat
[ES]
[ET
] = [E] + [ES]
[E] = [ET
] - [ES]
k1
([ET
] - [ES]) [E] = k2
[ES] + kcat
[ES]
k1
[ET
] [S] - k1
[ES] [S] = k2
[ES] + kcat
[ES]
k1
[ET
] [S] = k2
[ES] + kcat
[ES] + k1
[ES] [S]
k1
[ET
] [S] = [ES] (k2
+ kcat
+ k1
[S])
[ET
] [S]
Km
+ [S]
[ES] = Km
= (k2
+ kcat
) / k1
dP/dt = vO
= kcat
[ES]
dP/dt = vO
=
kcat
[ET
] [S]
Km
+ [S]
Vlim
= kcat
[ET
]
vO
=
Vlim
[S]
Km
+ [S]
Rovnice Michaelise a Mentenové
k1
[ET
] [S]
(k2
+ kcat
+ k1
[S])
[ET
] [S]
(k2
+ kcat
+ k1
[S])
=
k1
[ET
] [S]
(k2
+ kcat
) / k1
+ [S]
k1
=[ES] =
vO
=
Vlim
[S]
Km
+ [S]
Dvojnásobně reciproká rovnice
Lineweavera a Burka
=
Km
+ [S]
Vlim
[S]
1
vO
=
Km
Vlim
[S]
1
vO
[S]
Vlim
[S]
+
=
Km
Vlim
[S]
1
vO
1
Vlim
+
Sklon = Km
/Vlim
Průsečík = 1/Vlim
Rovnice Michaelise a Mentenové
Závislost počáteční rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu
(hyperbola):
Koncentrace substrátu [S]
Počátečníreakčnírychlost[vO
]
Vlim
/2
Vlim
Vlim
Km
Saturační křivka
TEST
Dvojnásobně reciproké vynesení 1 / vo proti 1 / [S]
dle Lineweavera a Burka
1 / vo = Km / Vlim . 1 / [S] + 1 / Vlim
1 / [S]
1 / [vO
]
0
Km
Průsečík = -1/
VlimPrůsečík = -1/
Km
Sklon = / Vlim

Rychlostní konstanta -poznamka
• Uvažují, že rychlostní konstanta kcat nemůže být větší než
k1 neboť by to znamenalo, že se komplex ES se rozpadá
rychleji než se tvoří.
• Pozor: konstanty mají různé jednotky a proto nemohou být
srovnávány !!
• Konstanta k1 má jednotky M-1 x s-1 nebo (min)-1, konstanta
kcat má jednotky s-1 nebo min-1.
• Nejsou to rychlosti, ale rychlostní konstanty prvního
a druhého řádu !!!
• Rychlost tvorby [ES] je k1 [E][S] a rychlost rozpadu [ES]
na E + P kcat[ES].
• Může nastat stav, kdy kcat >>k2 !! V tom případě se Km
redukuje na kcat / k1 !
Význam hodnot Km a Vlim (max)
• Michaelisova konstanta:
• Závisí na typu substrátu a podmínkách, jako jsou pH,
teplota (doporučuje se 30oC) a iontová síla roztoku.
• Základní významy Km :
• a) Koncentrace substrátu při které je substrátem
obsazena polovina aktivních míst enzymu. Odpovídá
koncentraci substrátu in vivo.
• b) Km = (k2 + kcat ) / k1 je vztah mezi Km a rychlostními
konstantami enzymové reakce ve smyslu rovnice Michaelise
a Mentenové.
• c) Koncetrace substrátu, při které reakce probíhá s
poloviční max rychlostí
TEST
• V případě, že k2 je mnohem větší než kcat to znamená, že
ES komplex disociuje na E a S mnohem rychleji, než se
tvoří produkt.
• Vztah se zjednoduší na Km = k2 / k1. Disociační konstanta
komplexu ES je:
KES = [E] [S] / [ES] = k2 / k1
• Jinými slovy: Km je v tomto případě rovno disociační
konstantě komplexu ES.
• Vysoké hodnoty Km ukazují na slabou afinitu substrátu k
enzymu, a naopak nízké hodnoty na vysokou afinitu.
Hodnoty Km některých vybraných enzymů a substrátů:
• Enzym Substrát Km ( mM.L-1)
•
• Trypsin N-Benzoyl-Arg ethyester 3 000
• Pyruvátkarboxylasa Pyruvát 400
• HCO3
- 1 000
• ATP 60
• Penicillinasa Benzylpenicilin 50
• Karbonátanhydratasa CO2 8 000
b-Galaktosidasa Laktosa 4 000
• Hexokinasa D-Glukosa 32
• ATP 1 200
• Glukokinasa D-glukosa 340
• ATP 250
Číslo přeměny enzymu
Km a Vlim (max)
• Maximální nebo limitní rychlost enzymové reakce je číslo
přeměny enzymu.
• Definujeme jako počet molekul substrátu převedených na
produkt enzymovou molekulou za časovou jednotku při plné
saturaci enzymu substrátem. Nazývá se také katalytická
konstanta kcat.
Čísla přeměny (turnover numbers) některých enzymů:
• Enzym Číslo přeměny (sec)
• Karbonátanhydrasa 600 000
• Acetylcholinesterasa 25 000
• Penicilinasa 2 000
• Laktátdehydrogenasa 1 000
• Chymotrypsin 100
• Tryptofansynthetasa 2
Kinetická dokonalost enzymové katalýzy.
Kriterium kcat / Km.
• V případě, že koncentrace substrátu je mnohem vyšší než
Km je rychlost enzymové reakce rovna kcat což je číslo
přeměny.
• Za fyziologických podmínek enzym nebývá substrátem
nasycen. Poměr [S] / Km je mezi 0, 01 až 1, 0.
• Za situace, kdy je [S] < < Km je rychlost enzymové reakce
mnohem menší než kcat, protože je mnoho aktivních míst
neobsazeno.
• Existuje nějaké číselné měřítko, které by
charakterizovalo enzym za podmínek v buňce ?
•
• Za podmínek, kdy je [S] < < Km závisí rychlost enzymové
reakce na kcat /Km a na celkovém množství enzymu [ E ]T.
•
• Pomocí tohoto kriteria můžeme porovnávat preferenci
enzymu pro různé substráty.
• Horním limitem je rychlost difůze substrátu do
aktivního místa enzymu.
Estery aminokyselin jako substráty chymotrypsinu dle
rostoucí hodnoty kcat / Km :
Ester aminokyseliny Vedlejší řetězec kcat /Km (s-1M-1)
Glycin - H 1, 3 x 10-1
Valin isopropyl 2, 0
Norvalin n-propyl 3, 6 x 102
Norleucin n-butyl 3, 0 x 103
Fenylalanin benzyl 1, 0 x 105
Nejdokonalejším substrátem je fenylalanin.
L-norleucin a L-norvalin. Neproteinogenní
-aminokyseliny.
COO
H C
H2
NH3
C
H2
C
H2
CH3
+
-
COO
H C
H2
NH3
C
H2
CH3
+
-
Enzymy pro které je hodnota kcat / Km blízko difůzí
kontrolované rychlosti vstupu substrátu do aktivního místa.
Enzym kcat / Km (s-1M-1)
Acetylcholinesterasa 1,6 x 108
Karbonátanhydratasa 8,3 x 107
Katalasa 4,0 x 107
Fumarasa 1, 6 x 108
Triosafosfátisomerasa 2,4 x 108
b-Laktamasa 1,0 x 108
Superoxiddismutasa 7,0 x 109
Jednotky enzymové aktivity
• 1 katal (1 kat) je aktivita enzymu, který katalyzuje
přeměnu jednoho molu substrátu za jednu sekundu.
• Používají se mkat (10-6 kat) a nkat (10-9 kat).
• Aktivita se měří za optimálních podmínek – teplota, pH a
iontová síla roztoku.
• Specifická aktivita: Aktivita enzymu vztažená na množství
proteinu v jednotce objemu (např. nkat/mg – vše v jednom
mL).
• Sekvenční:
• A) Náhodný mechanismus (bi – bi)
• B) Uspořádaný mechanismus (bi – bi)
• Pingpongový mechanismus
Dvousubstrátové reakce
Náhodný mechanismus
• Je takový mechanismus enzymové reakce, kdy
nezáleží na tom, který z obou substrátů se váže jako
první na enzym.
Příklad: kreatinkinasa
Náhodný sekvenční mechanismus (kreatinkinasa):
ATP+
+
O
C
C
H2
N
C
NH2
O CH3
NH2
ADP+O
C
C
H2
N
C
N
H
O CH3
NH2
+
P
O
O
-
O
-
Kreatin
Fosfokreatin
-
Clelandovo schéma - náhodný sekvenční mechanismus
(kreatinkinasa):
ATP Kreatin
ATPKreatin
Enzyme Enzyme
Fosfokreatin ADP
FosfokreatinADP
E (kreatin)
(ATP)
E (fosfokreatin)
(ADP)
Uspořádaný mechanismus
• Vyznačuje se tím, že substráty se váží do aktivního
místa v určitém pořadí.
• Příklad: alkoholdehydrogenasa, laktátdehydrogenasa
(nejdříve se váže koenzym NAD+ a poté druhý
substrát)
Uspořádaný sekvenční mechanismus (laktátdehydrogenasa):
C
C
O CH3
OO - C
COH
CH3
OO
H
NADH
NAD+
H+
+ + +
LaktátPyruvát
Clelandovo schéma uspořádaného sekvenčního mechanismu
(laktátdehydrogenasa):
NADH Pyruvát
Enzyme Enzyme
Laktát NAD+
E (NADH) (pyruvát) E (laktát) (NAD+
)
• Vyznačuje se tím, že enzym přechází mezi dvěma
stálými formami.
• Po vazbě prvního substrátu se tvoří substituovaný
enzymový meziprodukt, modifikovaný enzym.
• První produkt se uvolní a poté se váže na
modifikovaný enzym druhý substrát a odštěpí se
druhý produkt.
• Příklad: aspartátaminotransferasa.
Pingpongový mechanismus
Pingpongový mechanismus (aspartátaminotransferasa):
H
NH3
+
COO
COO
-
-
COO
O
OOC
-
-
OOC
H
NH3
+
COO
-
-
COO
O
COO
-
+
+
Aspartát -Oxoglutarát Glutamát Oxaloacetát
Clelandovo schéma pingpongového mechanismu
(aspartátaminotransferasa):
Aspartát Oxaloacetát
Enzyme Enzyme
E
(aspartát)
(E-NH3
)
(oxaloacetát)
(E-NH3
)
(oxaloacetát)
(E-NH3
)
(-oxoglutarát)
E
(glutamát)
-Oxoglutarát Glutamát
+ + +
Allosterické enzymy
• Allosterické enzymy se neřídí kinetikou Michaelise a
Mentenové.
• Skládají se z podjednotek (kvarterní struktury). Mají
více aktivních míst a míst do kterých se váže inhibitor
nebo aktivátor.
• Závislost rychlosti enzymové reakce na koncentraci
substrátu má sigmoidní charakter.
Koncentrace substrátu [S]
Reakčnírychlost[vO
]
Aspartáttranskarbamoylasa (ATCasa).
• ATCasa katalyzuje první krok biosyntézy pyrimidinových
nukleotidů.
• ATCasa je inhibována produktem – cytidintrifosfátem (CTP).
• Tento typ inhibice se nazývá – zpětnovazebná inhibice nebo
inhibice konečným produktem. Vždy je inhibován první
reakční krok.
• CTP je strukturně odlišný od substrátu a váže se proto na
jiné místo enzymu než substrát. Taková místa se nazývají
allosterická (z řečtiny allos jiná a steros struktura, místo).
• ATCasa je složena ze dvou katalytických podjednotek (každá
obsahuje tři řetězce) a tří regulačních podjednotek (každá
obsahuje dva řetězce).
• ATP je allosterický aktivátor, CTP je allosterický inhibitor.
Aspartáttranskarbamoylasa
Aspartáttranskarbamoylasa jako příklad allosterického
enzymu. Přidavek allosterického inhibitoru – CTP.
[Aspartát], mM
Rychlosttvorby
N-karbamoylaspartátu
+ 0.4 mM CTP
10 20
Aspartáttranskarbamoylasa. Přídavek allosterického
aktivátoru ATP.
[Aspartát], mM
Rychlosttvorby
N-karbamoylaspartátu
+ 2 mM ATP
10 20
Rychlost enzymové reakce závisí na pH, teplotě a
iontové síle prostředí.
• Většina enzymů je aktivní pouze v úzkém rozmezí pH.
Spočívá to ve vlivu pH na kombinaci faktorů:
• A) Vazba substrátu na enzym
• B) Stav ionizace substrátu
• C) Ionizační stavy vedlejších řetězců aminokyselin v
aktivním místě
• Většina enzymových reakcí vytváří zvonovou křivku
závislosti reakční rychlosti na pH. Např. fumarasa.
• Hodnotu pH, při které dochází k nejvyšší rychlosti
enzymové reakce nazýváme pH optimum.
Fumarasa (enzym cyklu trikarboxylových kyselin).
pH
Rychlost
0 5 6 7 8 9
Vliv teploty na stabilitu a aktivitu enzymů.
• Teplotní stabilita enzymů závisí na řadě faktorů jako je pH, iontová
síla prostředí a přítomnost nebo nepřítomnost ligandů. Substráty
obecně chrání enzymy před tepelnou denaturací. Nízkomolekulární
enzymy s jednoduchým polypeptidovým řetězcem obsahující
disulfidové vazby, jsou obvykle teplotně stabilnější než
vysokomolekulární oligomerní enzymy.
• Obecně, se zvyšující se teplotou roste aktivita enzymů. Enzymy jsou
proteiny u kterých se terciární a kvarterní struktura udržuje
slabými interakcemi jako jsou vodíkové vazby, iontové interakce
atd. Závislost rychlosti na teplotě obvykle vykazuje vrchol, který
označujeme jak teplotní optimum. Při dalším zvyšování teploty
obvykle dochází k denaturaci proteinu. Závislost mezi rychlostní
konstantou reakce a aktivační energií se vyjadřuje exponenciální
Arrheniovou rovnicí.
• Vliv teploty na rychlost reakce se také vyjadřuje termínem teplotní
koeficient Q10. Q10 je faktor kterým vzroste rychlost enzymové
reakce při růstu teploty o 10 oC.
• Pro teplotní oblast mezi 25 až 35 oC je tímto faktorem číslo 2.
• Pro práci s enzymy je doporučována IUB teplota 30 oC.
Inhibice enzymové aktivity
Ireversibilní Reversibilní
a. Kompetitivní
b. Nekompetitivní
c. Akompetitivní
Ireversibilní inhibice
• Ireversibilní inhibitory blokují nevratně enzymovou
aktivitu tím, že vytváří s enzymem velmi pevný kovalentní
komplex enzym – inhibitor.
• Příklad: Inhibice cholinestearasy a proteinas
diisopropylfluorfosfátem, který se kovalentně váže na Ser
v aktivním místě nebo reakce enzymů s ionty těžkých kovů.
Ireversibilní inhibice acetylcholinesterasy (enzym přenosu
nervového vzruchu) diisopropylfosfofluoridem (DIPF):
OH
CH3H
O
CH3
P
O
F
O
CH3H
CH3
Ser
Acetylcholinesterasa Inaktivovaný enzym
+ O
CH3H
O
CH3
P
O
O
CH3H
CH3
+ +F
-
H
+
DIPF
Inaktivace cysteinového řetězce enzymu jodacetamidem:
SH
Cys
Enzym Inaktivovaný enzym
+ I
-
H
+
Jodacetamid
I
C
H2
C
NH2
O
S
C
H2
C
NH2
O
+ +
Reversibilní inhibice
• Vytváří se reversibilní komplex mezi inhibitorem a
enzymem nebo mezi inhibitorem, enzymem a substrátem.
• Rozeznáváme tři typy reversibilních inhibicí:
• A) Kompetitivní – soutěží substrát a inhibitor o aktivní
místo.
• B) Nekompetitivní – inhibitor se váže na molekulu enzymu
do jiného místa než substrát, ale brání tvorbě produktu.
• C) Akompetitivní – vazba substrátu na enzym předchází
vazbě enzymu. Teprve vazbou substrátu na na enzym se
vytvoří vazebné místo pro inhibitor a vzniklý ternární
komplex je inaktivní.
Kompetitivní inhibice
S
IEnzym
Enzym
S
Enzym
I
Klasická kompetitivní inhibice
S
Enzym I
Enzym
I
Enzym
S
Neklasická kompetitivní inhibice
Buďto vstoupí substrát do
aktivního místa enzymu a
zamezí vstupu inhibitoru
nebo naopak.
Příklad klasické kompetitivní inhibice sukcinátdehydrogenasy
(enzym citrátového cyklu) malonátem:
Sukcinátdehydrogenasa
COO
CH2
CH2
COO
-
-
Sukcinát
OOC CH
CH COO
-
-
2 H+
Fumarát
COO
CH2
COO
-
-
Malonát
Kompetitivní
inhibitor Ki
= [E] [I] / [EI]
E + I EI
Kompetitivní inhibice
dvojitě reciproké vynesení dle Lineweavera a Burka:
1 / [S], M-1
1/[vO
]
10
0
20
30
100 200 300 400 500
( ) 1
Vlim
1/vi
=
Km
Vlim
[S] Ki
[I]
1 + +
1
Vlim
1/vO
=
Km
Vlim
[S]
+
Kompetitivní inhibice
Bez inhibice
Mění se sklon
Vlim
se nemění
Km
se mění
Stejné množství
substrátu a inhibitoru:
E + S ES E + P
+
I
EI
Nadbytek substrátu:
E + S ES E + P
+
I
S
S
S
S
S
S
Ki
= [E] [I] / [EI]
E + I EI
Potlačení intoxikace ethylenglykolem – ethanolem:
Ethylenglykol
Tvorba oxalové kyseliny z ethylenglykolu je inhibována ethanolem:
Inhibováno ethanolemOHCH2
CH2 OH
CH3
CH2OH
Ethanol
Alkoholdehydrogenasa
OHCH2
C
O H
COOH
COOH
Aldehyd
Ethandiová
kyselina,
oxaláty+
Schéma nekompetitivní inhibice:
S
Enzym I
Nekompetitivní inhibice
Enzym
S
Enzym
I
Enzym
SI
Schéma a grafické vynesení nekompetitivní inhibice dle
rovnice Michaelise a Mentenové:
E + I ES E + P
EI
K
i
EIS
S
S
Koncentrace substrátu [S]
Relativnírychlost
100
80
60
40
20
Bez inhibitoru
[I] = K
i
[I] = 5 K
i
[I] = 10 K
i
Nekompetitivní inhibice
dvojitě reciproké vynesení dle Lineweavera a Burka:
1 / [S], M-1
1/[vO
]
10
0
20
30
100 200 300 400 500
1
Vlim
1/vO
=
Km
Vlim
[S]
+
Nekompetitivní inhibice
Bez inhibice
( ) 1
Vlim
1/vi
=
Km
Vlim
[S] Ki
[I]
1 + +
( )Ki
[I]
1 +
Vlim
se mění
Km
se nemění
Mění se sklon
Ki
= [E] [I] / [EI]
E + I EI
Ki
= [ES] [I] / [ESI]
ES + I ESI
Stejné množství
substrátu a inhibitoru:
E + S ES E + P
+
I
EI + S EIS
+
I
Nadbytek substrátu:
ESI
S
E + S ES
+
I
S
S
S
S
S
Nadbytek substrátu
neovlivní reakci.
Akompetitivní inhibice. Podmínkou vazby inhibitoru
je vazba substrátu. Ternární komplex.
S IEnzym Enzym
S
Akompetitivní inhibice
Enzym
SI
Akompetitivní inhibice
dvojitě reciproké vynesení dle Lineweavera a Burka:
Ki
= [ES] [I] / [ESI]
ES + I ESI
Stejné množství
substrátu a inhibitoru:
E + S ES E + P
EIS
+
I
Nadbytek substrátu:
ESI
S
E + S ES
+
I
S
S
S
S
S
Nadbytek substrátu
neovlivní reakci.
1 / [S], M-1
1/[vO
]
10
0
20
30
100 200 300 400 500
1
Vlim
1/vO
=
Km
Vlim
[S]
+
Akompetitivní inhibice
Bez inhibice
1
Vlim
1/vi
=
Km
Vlim
[S]
+
( )Ki
[I]
1 +
Vlim
se mění
Km
se mění
Nemění se sklon
Tabulka typů inhibice a příslušných konstant:
Inhibice Konstanty
Kompetitivní
I se váže jen na E
Roste Km, Vlim se nemění.
Nekompetitivní
I se váže jak na E tak na ES
Klesá Vlim, Km se nemění
Akompetitivní
I se váže jen na ES
Klesá Vlim a Km
Poměr Vlim / Km se nemění
PENICILIN jako INHIBITOR vzniklý enzymovou
reakcí – sebevražedný substrát.
• Penicilin ireversibilně inhibuje růst bakterií – narušuje
syntézu bakteriální stěny.
• Penicilin inhibuje enzym glykopeptidtranspeptidasu tím,
že napodobuje přirozený substrát enzymu a tím je D-AlaD-Ala
(dipeptid). Penicilin se kovalentně naváže na Ser
aktivního místa glykopeptidtranspeptidasy.
• Inhibice penicilinem zasahuje do stavby buněčné stěny.
Penicilin zabraňuje zesíťování peptidoglykanových vláken
buněčné stěny.
Struktura penicilinu. Dipeptid (Val a Cys).
Thiazolidinový kruh, reaktivní peptidová vazba b-laktamového kruhu a
R je zaměnitelná skupina.
N
NH
R O
S
CH3
CH3
COO
O
H
Thialozidinový
kruh
Variabilní skupina
Reaktivní peptidová
vazba v b-laktamovém
kruhu
-
Model benzylpenicilinu – penicilin G.
Na místě skupiny R je benzyl.
Thialozidinový kruh
Benzylová skupina
Velmi reaktivní
peptidová vazba
Porovnání konformací penicilinu a dipeptidu
D-Ala-D-Ala, který penicilin napodobuje:
Penicilin R-D-Ala-D-Ala peptid
Schématické znázornění peptidoglykanu bakterie
Streptococus aureus.
Žlutý je sacharid, červený tetrapeptid a pentaglycinový můstek je modrý.
Tvorba sítě peptidoglykanu (S. aureus).
Koncová aminoskupina pentaglycinového můstku v buněčné stěně napadá
peptidovou vazbu mezi dvěma D-alaniny a tím dochází k zesíťování.
+C
C
H2
NH3
+
O
R1
- C
C
N
H
O
O C N
H
R2
H CH3 O
CH3H
+N
H
C N
H
R2
O
CH3H
C
C
H2
O
R1
- C
C
NH2
O
O
H CH3
Koncový glycin
pentaglycinového můstku
Koncová D-Ala-D-Ala
skupina
Gly-D-Ala křížová vazba D-Ala
Interakce penicilinu s transpeptidasou vedoucí
k velmi stabilnímu inaktivnímu komplexu.
Glykopeptidtranspeptidasa
OH
Ser
+ N
NH
R
O
S
CH3
CH3
COO
O
H
H
Komplex
peniciloyl-enzym
O
NH
NH
R
O
S
CH3
CH3
COO
O
H
H
-
Penicilin
Struktura transpeptidasy s vázaným penicilinem.
Suicide substrates, mechanism based inhibitors – sebevražedný
substrát. Příklad: ornithindekarboxylasa a difluormethylornithin
(DFMO).
• A) Oxidoreduktas
• B) Transferas
• C) Isomeras, ligas, lyas
KOENZYMY
Koenzym Enzymová reakce Vitaminový zdroj Onemocnění
z nedostatku
Biocytin Karboxylace Biotin Není známo
Koenzym A Přenos acylů Pantothenát (B5) Není známo
Kobalaminové koenzymy Alkylace Kobalamin (B12) Perniciosní anemie
Flavinové koenzymy Oxidace-redukce Riboflavin (B2) Není známo
Lipoová kyselina Přenos acylů - Není známo
Nikotinamidové koenzymy Oxidace-redukce Nikotinová Pelagra
kyselina (niacin,B3)
Pyridoxalfosfát Přenos aminoskupinPyridoxin (B6) Není známo
Tetrahydrofolát Přenos C1 skupin Listová kyselina Megaloblastická
anemie
Thiaminpyrofosfát Přenos aldehydů Thiamin (B1) Beriberi
Přehledná tabulka běžných koenzymů:
• A) Nikotinamidové
• B) Flavinové
Koenzymy oxidoreduktas:
N
NH2
O
N
OH
O
Nikotinamid
(niacinamid)
Nikotinová kyselina
(niacin)
Nikotinamid H
+
X = H Nikotinamidadenindinukleotid (NAD+
)
X = PO3
2Nikotinamidadenindinukleotidfofát
(NADP+
)
D-Ribosa
N
NH2
O
R
HH
++ 2 [H ]
X
Oxidovaná forma Redukovaná forma
Adenosin
N
NH2
O
O
OH
H
OH
H
OH
CH2
H
O
PO OH
O
PO OH
O
N
O
OH
H
O
H
OH
CH2
H
N
N
N
NH2
+
Dvouelektronový přenos (hydridový aniont)
při oxidačně-redukční reakci NAD+ na NADH.
N
NH2
O
R
H
NAD+
H
-
:+
N
NH2
OH H
R
NADH
+
Alkoholdehydrogenasová reakce za účasti nikotinamidového
koenzymu:
CH3
C
H
O
CCH3
OH
HH
NAD+
+
ADH
NADH H+
+ +
Ethanol Acetaldehyd
Struktura flavinadenindinukleotidu (FAD)
s vyznačením reaktivních míst.
P
O
O
-
O
N
O
H
H
OH
H
OH
CH2
H
N
N
N
H
NH2
HO
P
O
O
-
O
C OH
C
C
H
OH
C
H
OH
CH2
H
H
N
H
CH3 N
N
NH
OH
H
OCH3
Reaktivní místa
R
N
CH3 N
N
N
OH
H
OCH3
H
2
1
3
45
4a
10a
10
5a
9a
9
8
7
6
7a
8a
R
N
CH3 N
N
N
OH
H
OCH3
H
H
R
N
CH3 N
N
N
OH
H
OCH3
H
H
H
Flavinadenindinukleotid (FAD)
(oxidovaná nebo chinonová forma)
H
H
FADH (radikálová nebo semichinonová forma)
FADH2 (redukovaná nebo hydrochinonová forma)
Oxidovaná a plně redukovaná forma flavinového koenzymu (FAD).
Mechanismus shodný s flavinmononukleotidem (FMN).
R
N
CH3 N
N
N
OH
H
OCH3
H
R
N
CH3 N
N
N
OH
H
OCH3
H
H
H
(FAD)
Oxidovaná forma
(FADH2
)
Redukovaná forma
+ 2 H
+
+ 2 e-
Oxidace (dehydrogenace) vazby mezi dvěma uhlíky
za účasti FAD:
H
C
R2
C
H
R1
C
C R2
HH
R1
H H
FAD+ FADH2
+
• A) Koenzym A
• B) Lipoová kyselina
• C) Thiaminpyrofosfát (TPP)
Koenzymy transferas:
Koenzym A, CoA, CoASH.
Vyznačena struktura složeného nukleotidu s reaktivní SH skupinou na konci.
Pantothenát – vitamin B5.
b-Merkaptoethylamin
P
O
O
-
O
N
O
H
H
OH
H
OH
H
N
N
N
H
NH2
H
O
P
O
O
-
O
NH NH
O O
H OH
CH3CH3
SH
Pantothenát
Reaktivní skupina
Thioesterová vazba s vysokým obsahem energie.
Acetyl CoA + H2O = acetát + CoA + H+
D Go´ = - 31, 4 kJ/mol
R
C
S
CoA
O
CH3
C
S
CoA
O
Acyl CoA Acetyl CoA
Lipoová kyselina
OH
O
S
S
H
Lipoová kyselina
Lipoamid – isopeptidová vazba lipoové kyseliny na vedlejší řetězec
apoenzymu (Lys) s vyznačením reaktivní disulfidové vazby:
NH
O
S S
H
N
H
O
H
Lipoamid
Reaktivní disulfidová vazba
Postranní řetězec
lysinu
Přenos acetylu z acetyldihydrolipoamidu na CoA:
R
SH
S
H
CH3
O
SHCoA
Koenzym A Acetyllipoamid
+ SCoA
O
CH3
R
SH
SH
H
+
Acetyl CoA Dihydrolipoamid
Struktura thiaminpyrofosfátu:
Thiaminpyrofosfát (TPP)
P
O
O
-
O
-
O
P
O
O
-
O
CH2 CH2
N
N
N
NH2
NH2
S
H
CH3
+
Uhlíkový atom mezi atomy dusíku a síry thiazolového kruhu je silně kyselý
(pKa = 10). Dochází k ionizaci za tvorba karbaniontu, který se váže na
oxoskupiny (např. pyruvátu v pyruvátdehydrogenase).
Karbaniont TPP
R1
R2
N
+
S
H
CH3
+
R1
R2
N
+
S
CH3
H
+
TPP
-
Interakce karbaniontu TPP s pyruvátem (součást pyruvátdehydrogenasy).
Hydroxyethyl-TPP se také označuje jako „aktivní acetaldehyd“.
Adiční sloučenina
R1
R2
N
+
S
CH3
-
C
C O
O
O
CH3 R1
R2
N
+
S
CH3
C
C
OH
O
-
O
CH3
CO2
R1
R2
N
S
CH3
C
OH
CH3 R1
R2
N
+
S
CH3
C
OH
CH3
-
H
+
H
+
CO2
R1
R2
N
+
S
CH3
C
OH
CH3
H
Karbaniont TPP Pyruvát
Rezonanční formy hydroxyethyl-TPP Hydroxyethyl-TPP
-
Adenosintrifosfát – ATP, univerzálně významný
koenzym a enzymový regulátor.
• ATP urychluje řadu metabolických reakcí při kterých
dochází k jeho hydrolýze.
• Chemická energie ATP se uplatňuje při aktivním
transportu, může se převést na mechanickou práci
(svaly), na světlo (bioluminiscence), elektrickou energii
a teplo.
• ATP se účastní řady biosyntetických reakcí přenosem
fosfátu, difosfátu, adenosylu a adenylu na druhé
metabolity.
Fosfoanhydridové
vazby
Adenosin
P
O
O
O
P
O
O
-
O
N
O
OH
H
OH
H
OH
CH2
H
N
N
N
NH2
P OO
-
O
O
-
b
Fosfoesterová
vazba
AMP
ADP
ATP
Proč je ATP tak energeticky bohatá molekula?
• Aktivní forma ATP je obvykle komplex ATP s Mg2+ nebo
Mn2+.
• ATP je energeticky bohatá molekula, protože její
trifosfátová část obsahuje dvě fosfoanhydridové vazby.
Důvodem je resonanční stabilizace, elektrostatické
odpuzování a stabilita produktů.
• Produkty hydrolýzy, jako je fosfát:
AMP (adenosinmonofosfát) nebo ADP (adenosindifosfát),
vykazují větší stabilitu a menší elektrostatickou repulzi
než ATP.
Tabulka změny standardní Gibbsovy energie
hydrolýzy fosfátů některých biologicky
významných sloučenin:
• Sloučenina D Go' (kJ.mol-1)
• Fosfoenolpyruvát - 61, 9
• 1,3-bisfosfoglycerát - 49, 4
• ATP (→ AMP + PPi→ 2Pi) - 45,6
• Acetylfosfát - 43, 1
• Fosfokreatin - 43, 1
• ATP (→ ADP + Pi) - 30,5
• Glukosa-1-fosfát - 20, 9
• PPi - 19, 2
• Fruktosa-6-fosfát - 13, 8
• Glukosa-6-fosfát - 13, 8
• Glycerol-3-fosfát - 9, 2
Výpočet změny volné energie hydrolýzy
ATP na ADP a Pi v buňce.
• Vnitrobuněčná koncentrace ATP se udržuje v rozmezí:
2 – 10 mM.
Koncentrace ADP a Pi jsou variabilní.
• Při typické buněčné koncentraci
[ATP] = 3, 0 mM,
konc. [ADP] = 0, 8 mM
konc.[ Pi] = 4, 0 mM je volná energie hydrolýzy ATP na
ADP a Pi při 37oC: - 48, 1 kJ.mol-1
Podle vzorce:
DG = D G o´ + RT. ln [ADP].[ Pi ]/ [ATP].
D G o´ = - 35, 6 kJ.mol-1
Hydrolýza fosfoanhydridové vazby:
P
O
O
O
P
O
O
-
OO
P
O
O
O
HO P
O
O
OH
O
H2O
+
nebo
nebo
Spojení endergonní reakce s exergonní (hydrolýza ATP):
Endergonní poloreakce 1 Pi
+ glukosa glukosa-6-P + 13.8
Exergonní poloreakce 2 ATP + H2
O ADP + Pi
- 30.5
Celková spojená reakce ATP + glukosa ADP + glukosa-6-P - 16.7
G´ (kJ.mol-1
)
DGO
´hydrolýzy(kJ.mol-1
)
Vysokoenergetické
sloučeniny
Nízkoenergetické
sloučeniny
-10
-30
-50
-20
-40
-60
0
Fosfoenolpyruvát
1,3-Bisfosfoglycerát
Fosfokreatin
Glukosa-6-fosfát
Glycerol-3-fosfát
ATP
~P
~P
~P
P
P
Fosfoanhydridová vazba bývá často značena ~
a používán název „makroergická vazba“.
Acetylfosfát
CH3 C
O
OPO3
2-
~
1,3-Bisfosfoglycerát
C C
OOH
OPO3
2-
~2-
O3
POCH2
Fosfoenolpyruvát D Go' (kJ.mol-1) = 61, 9
P v kroužku značí fosfát, zde esterově vázaný.
COO
C-O-
CH2
P
O
P
O
O
O
= P-
-
-
COO
CH3
O
-
Pyruvát
-D-Glukosa-6-fosfát
C O
C
CC
C
OH
H
H
H
OH
OH
H OH
H
CH2OPO3
2C
H
CH2OH
OH
CH2OPO3
2-
L-Glycerol-3-fosfát
Zásobní fosfageny (guanidinové fosfáty) obratlovců:
C
NH2
+
N
N P
O
O
-
O
-
R
X
H
nebonebo
Fosfokreatin
Fosfoarginin
CH2 CO2
CH2 CH2 CH2 CH CO2
NH3
+
R =
R
=
HX
=
CH3X =
Doplněk:
Strukturní vzorce vitaminů rozpustných ve vodě a uplatňujících se jako
prekurzory koenzymů a vitaminu C (L-askorbová kyselina):
C OH
C
C
H
OH
C
H
OH
CH2OH
H
H
N
H
CH3 N
N
NH
OH
H
OCH3
Vitamin B2
(Riboflavin)
N
H
+
O
-
O
Vitamin B3
(Niacin)
OH
O
-
C
H2
C
H2
N
H
C
H2
O O
H OH
CH3CH3
Vitamin B5
(Pantothenát)
Vitamin B6
(Pyridoxin)
N
H
+
CH2OH
OHHOH2C
CH3
C
OHOH
O
C
CH2OH
OH
H
H
Vitamin C
(Askorbová kyselina)
C OH
C
C
H
OH
C
H
OH
CH2OH
H
H
N
H
CH3 N
N
NH
OH
H
OCH3
Vitamin B2
(Riboflavin)
N
H
+
O
-
O
Vitamin B3
(Niacin)
OH
O
-
C
H2
C
H2
N
H
C
H2
O O
H OH
CH3CH3
Vitamin B5
(Pantothenát)
Vitamin B6
(Pyridoxin)
N
H
+
CH2OH
OHHOH2C
CH3
C
OHOH
O
C
CH2OH
OH
H
H
Vitamin C
(Askorbová kyselina)
Askorbová kyselina, askorbát (aniont) a oxidovaná forma
dehydroaskorbová kyselina.
C
OHOH
O
C
CH2OH
OH
H
H
Askorbová kyselina
C
O
-
OH
O
C
CH2OH
OH
H
H
Askorbát
C
OO
O
C
CH2OH
OH
H
H
Dehydroaskorbová kyselina
Účast askorbátu (vitaminu C) na hydroxylaci prolinu na trans -4-hydroxyL-prolin
v peptidovém řetězci - klíčová role při syntéze kolagenu. Dalším
kofaktorem je Fe3+. Nedostatek vit. C - skorbut.
C
N
H H
O
Prolin-součást
peptidového řetězce
CO2
-O
O
O
O
O
-
-Oxoglutarát
O2+ +
C
N
H OH
O
Hydroxylovaný prolin
v řetězci
Sukcinát
+ +
-
-
O
O
O
O
+ ascorbát
Prolylhydrolasa
Strukturní vzorce vitaminů rozpustných v tucích:
Vitamin A
(Retinol)
CH3
CH2OH
CH3CH3CH3
CH3
Vitamin D2
(Kalciferol)
CH3
CH2
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Vitamin E
(-Tokoferol)
( )3
H
CH3
O
CH3
CH3
CH3
OH
CH3
CH3
Vitamin K1
O
CH3
O CH3
H
CH3
( )3
Vitamin A
(Retinol)
CH3
CH2OH
CH3CH3CH3
CH3
Vitamin D2
(Kalciferol)
CH3
CH2
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Vitamin E
(-Tokoferol)
( )3
H
CH3
O
CH3
CH3
CH3
OH
CH3
CH3
Vitamin K1
O
CH3
O CH3
H
CH3
( )3