2. Dědičné metabolické poruchy 2.1. Příčiny a druhy poruch. Dědičné metabolické poruchy (DMP). Diagnostika. Léčba 2.2. Enzymy, regulace metabolismu. 2.3. Příčiny zvýšené aktivity buněčných enzymů v plasmě. Klinicky významné enzymy. 0 PODSTATA METABOLICKÝCH CHOROB a) substrát mutace jaderné DNA ■ 0 b) O I dysfunkční protein produkt mutace mtDNA multiorgánové postiženi 2 Patobiochemie2017 i 2.1.Příčiny a druhy poruch. Dědičné metabolické poruchy (DMP). Dědičné metabolické poruchy (DMP) tvoří různorodou skupinu 700-800 onemocnění, která jsou způsobena enzymovým deficitem, dysfunkcí transportního proteinu či poruchou jiného proteinu souvisejícího s některou metabolickou dráhou. Typická je pro ně autozomálně recesivníf gonozomálně recesivní i dominantní, ale také mitochondriální dědičnost. K nedostatečné tvorbě enzymu či potřebného proteinu dochází následkem mutací jaderné či mitochondriální DNA. Konzervativní odhady kumulativní incidence všech dědičných metabolických poruch jsou uváděny kolem 1:500 (frekvence heterozygotů 1:15); je velmi pravděpodobné, že DMP jsou v současné době poddiagnostikovány. 2_Patobiochemie 2017 2 Ačkoliv je skupina dědičných metabolických poruch značně heterogenní poruchy, je možné najít některé společné rysy. 1) Již z jejich podstaty vyplývá, že u pacientů budou detekovatelné biochemické a enzymatické odchylky. 2) Dále vzhledem k tomu, že většina metabolických drah je společná pro řadu buněk v organizmu, bývá časté multiorgánové postižení (např. postižení CA/S, svalů, ledvin a jater u mitochondriálních onemocnění). 3) Klinické projevy DMP bývají velmi často nespecifické (neprospívání, nechutenství, porucha růstu, porucha psychomotorického vývoje, poruchy vědomí), 4) jen poměrně vzácně se vyskytují specifické známky svědčící s vysokou pravděpodobností pro některé DMP (např. zápach zpocených nohou u pacientů s izovalerovou acidurií nebo typická faciální dysmorfie u pacientů s mukopolysacharidózami či generalizovanými peroxizomálními onemocněními). 5) Postihují pacienty jakéhokoliv věku od prenatálního období až do Stan. 2_Patobiochemie2017 3 • Historie • Počátky objevování dědičných metabolických poruch jsou spojeny se jménem Archibalda Garroda, který jako první poukázal na souvislost lidských nemocí a Mendelovvch zákonů dědičnosti a formuloval koncept dědičných metabolických poruch (inborn errors of metabolism). • Garrod se zabýval studiem alkaptonurie a v roce 1902I publikoval knihu The Incidence of Alkaptonuria: a Stud)\ in Chemical Individuality, která je prvním záznamem případu recesivní dědičnosti u lidí. V roce 1923 vyšla další jeho kniha s názvem Inborn Errors of Metabolism, v níž publikoval své studie o alkaptonurii, cvstinurii. pentosurii a albinismu. Právě překladem termínu inborn errors of metabolism Phenylalanin vznikl u nás dlouho používaný nepřesný název vrozené metabolické poruchy (vrozené metabolické vady) Melanin i i 'henylketonurie —S/ smus Tyrosin < Kretinismus Sir Archibald Edward Garrod, I Alkaptonurie Homogentisinsäure -—->- C02 + H20 Phenylbrenztraubensäure Thyroxin Príčiny dedičných metabolických poruch a) PODSTATA METABOLICKÝCH CHOROB substrát mutace jaderné DNA dysfunkční protein mutace mtDNA multlorgánové postiženi • Nejčastější příčinou dědičných metabolických poruch jsou mutace nukleární DNA v zárodečných buňkách (a tím i následně v somatických buňkách) s typickou monogenní mendelovskou dědičností — běžně autozomálně recesivní, gonozomálně recesivní i dominantní. • Méně častou příčinou DMP jsou mutace mitochondriální DNA, které se přenášejí maternálním typem dědičnosti. • Fenotypové projevy u dvou jedinců se stejným genotypem se mohou lišit v důsledku dalších faktorů jako je vliv prostředí (dieta, životní styl u nemocí malých molekul) či jako jsou např. epigenetické změny, epistáze (interakce s alelickými variantami v jiných genech), inaktivace X-chromozomu (lyonizace). • Mutace mohou být typu bodových mutací (missense, nonsense, synonymní mutace), delecí a inzercí (s nebo bez posunu čtecího rámce), přičemž z typu mutace a její lokalizace nelze často přímo určit stupeň postižení funkce příslušného proteinu. 2 Patobiochemie2017 Dědičné metabolické poruchy obvykle AR, GR | D-ttt | obvykle enzym substrát I produkt klinicky variabilní 2 Patobiochemie 2017 Důsledky mutace Důsledkem mutace může být • změněné množství translatovaného proteinu (obvykle snížené či vzácně zvýšené) • změněné vlastnosti proteinů (změnou izolované funkce jed™ domény, nebo globální změnou všech funkcí např. při misfoldingu). • Mutace mohou vést i ke změnám funkce neproteinových genových produktů jako jsou například miRNAči siRNA, které regulují expresi řady cílových genů. Postiženým proteinem je většinou enzym (ENZYMOPATIE) některé metabolické dráhy, jež potom vázne a nevzniká její produkt, který může chybět, neodčerpává se substrát, který se může hromadit, případně metabolizovat na vedlejší produkt. Od toho se pak odvíjí postižení různých orgánů do různé míry. Další proteiny: strukturní, transportní, regulační 2_Patobiochemie 2017 7 Důsledky mutací > hromadění substrátu (malé molekuly-př. phenylalanin jsou difusně rozptýlené v tělesných tekutinách, přestup přes filtr, bariéru ledvin, exkrece močí. Velké molekuly -př. mukopolysachyridy hromadění v místě vzniku). Př = PKU - mutace genu pro PAH ( phenylalaninhydroxylasu). aktivita enzymu < 1% (postiž.2 alely). Nízké procento PKU je způsobeno mutací 1 alely nebo v genu pro kofaktor PAH -tetrahyrdobiopterin (lehčí forma PKU). ^chybění produktu > hromadění defektního enzymu 1 tvorba nesprávného produktu - blok metabolické dráhy ^ztráta mnohočetných enzymových aktivit 2 Patobiochemie 2017 Mutace TP53 Bodová mutace v TP53 způsobí ztrátu funkce p53 -jako nádorového supresoru 248 175 N I II .i iiiliilIlilLiLiiJ I..LJu■ 245 273 I, ,1 , J 282 i il IV L 50 100 150 200 250 300 350 Choetal. 1994 • Důsledky mutace pro funkce proteinu • Ztráta funkce PuPuPuC(A/T)(T/A)GPyPyPy • zesílení funkce - mutací zesílí některá z funkcí proteinu nebo intenzitu produkce proteinu /hromadění) • zisk nové funkce • nesprávná exprese proteinu ( v místě a čase) 2 Patobiochemie 2017 TEST Funkční dopad mutací TP53 a mechanizmy GOF TP53 mutation ^ ' M( I P53 Accumulation due to oncogenic events J DN Mutant p53 O Transcriptional regulation of Transcriptional regulation of genes that mediate growth- genes that mediate supression, apoptosis, DNA proliferation, drug-resistance, repair etc. survival, metastasis etc. Nature Reviews I Cancer ^|2jr Mechanismy zahrnující vazbu na DNA p53- nádorová supresor, antonkgen, transkripční faktor, protein vázající se na DNA mutantní p53- onkogen 2 Patobiochemie 2017 Incidence (výskyt) DMP • Individuální výskyt poměrně vzácný (1:15 000-200 000) • Kolektivní výskyt vysoký (1: 1000), incidence pravděpodobně i vyšší (kolem • novorozenecký screening 1:1000-1:4000 • selektivní screening nejméně 1:500-1:1000 •frekvence heterozygotů pro DMP nejméně 1:15 • zastoupení se liší podle populací • vyšší výskyt v imbredních populacích (PKU Turecko, organické acidurie Blízký Východ) • tyrosinemie l.typu Quebec • aspartylglykosaminurie Finsko • lysosomální nemoci Izrael Konzervativní odhady kumulativní incidence všech dědičných metabolických poruch jsou uváděny kolem 1 :bUU (trekvence heterozygotů 1:15); je velmi pravděpodobné, že DMP jsou v současné době poddiagnostikovány. Incidence, statistický ukazatel v epidemiologii, je podíl počtu nově hlášených nemocných jedinců za dané časové období (nových případů) a počtu všech jedinců ve sledované populaci. 2_Patobiochemie 2017 11 Výskyt DMP v ČR ČR, 2005, n=127 incidence pro ČR ~ 1:1000 dosud -150 různých nosologických jednotek 2_Patobiochemie 2017 12 Způsoby přenosu DPM (dědičnost) a) PODSTATA METABOLICKÝCH CHOROB substrát mutace jaderné DNA b) mutace mtDNA dysfunkční protein JADERNA DNA Autosomálně recesivní Autosomálně dominantní Gonosomálně dominantní Gonosomálně recesivní MIMOJADERNÁ DNA Maternální typ dědičnosti ( mitochondriální DNA) multiorgánové postiženi 2 Patobiochemie 2017 13 Dědičnost AR (Autosomálně recesivní) • Dědí se tak naprostá většina DPM např. PKU • Onemocnění se projeví pouze u homozygota ( nositel obou defektních alel pro daný znak) • Heterozygot je klinicky zdravý jedinec, je přenašečem defektního genu malka olcc pr?nq&c£ka ptanašoč postiíDni dit# diiě normálni dité píenašeč přenášce (Jité SCID lr/kýkomhinc™nýim«iW(leliCi('_ Dědičnost GR (Gonosomálně recesivní) • Abnormní gen recesivního typu je vázán na pohlavní chromozom X • Klinicky se projeví jen u v O muzu ( mají jeden X chromozom, ženy mají XX) • Je-li postižen jeden z rodičů, pak jsou - muži buď zdraví, nebo trpí chorobou - ženy mohou být z 50% přenašečky Příklady: mukopolysacharidóza Hunterova, glykogenóza typ VIII matku prcnašcčka ľdruvy žena postižený idravá prcnaáccka muž ÍMA zdravý mui 2 Patobiochemie 2017 15 Maternální typ dědičnosti • Přestože mitochondriální DNA (mtDNA) má zanedbatelný objem proti jaderné DNA, mutace v mtDNA mohou způsobit závažné choroby 1) Veškeré mitochondrie zdědí každý jedinec výhradně po matce ( mitochondrie zygoty jsou toíiz všechny původem z vajíčka, všechny mitochondrie spermie zanikají). 2) V každé buňce je okolo 1000 mitochondrií - jedna mitochondrie s mutovanou mtDNA tudíž na buňku nemá žádný vliv. Zda se mutace v mtDNA nějakým způsobem projeví na úrovni buňky nebo celého organismu závisí na tom, kolik procent mitochondrií má mutovanou genetickou informaci. 2_Patobiochemie 2017 16 Dělení DMP dle postižené metabolické dráhy * Dědičné metabolické poruchy typicky zahrnují poruchy metabolizmu: * poruchy metabolizmu organel • mitochondriální onemocnění • peroxizomální onemocnění • lysozomální onemocnění • poruchy qlykosvlace (vázané na endoplazmatické retikulum) * poruchy metabolizmu primárně nevázané na organely • poruchy metabolizmu aminokyselin • organické acidurie • poruchy metabolizmu sacharidů včetně glykogenóz • poruchy metabolizmu purinů a pyrimidinů • poruchy metabolizmu lipidů • porfvrie •jiné DMP 2_Patobiochemie 2017 17 Klasifikace DMP 1. Podle rychlosti nástupu klinických příznaků 2. Podle jednotlivých metabolickcýh systémů 3. Podle subcelulární lokalizace změněného proteinu 4. Podle typu molekul 5. Podle analytické metodiky používané pro průkaz DPM 2 Patobiochemie 2017 18 1. Podle rychlosti nástupu klinických příznaků - onemocnění: •akutní metabolická •s intermitentním průběhem •chronické 2. Podle jednotlivých metabolických systémů - poruchy metabolismu •aminokyselin •sacharidů • lipidů •purinů a pyrimidinů • vysokomolekulárních látek • barviv atd. 2_Patobiochemie 2017 19 3. Podle subcelulární lokalizace změněného proteinu : * cytosolové •mitochondriální •lysozomální •peroxisomální •Golgiho aparátu •iontových kanálů atd. 4. Typ molekul: * nemoci malých molekul * nemoci komplexních molekul 2_Patobiochemie 2017 20 1) Klinika DMP • Projevy - v kterémkoliv věku od narození až do dospělosti • Manifestace - pestrá, od mírných chronicky probíhajících forem až po akutní život ohrožující stavy • Závažnost se odvíjí od stupně postižení změněného proteinu ( např. aktivita enzymu 0-20%) Klinické příznaky DMP • Nespecifické - těch je většina (poruchy svalového napětí, poruchy chování, poruchy vědomí, křeče, neprospívání, zvracení, postižení funkce srdce, svalů, jater, ledvin... •Specifické - např. typický abnormální zápach moče, potu...,ektopie čočky a trombembolické příhody 2_Patobiochemie 2017 21 Laboratorní nespecifické nálezy • Acidóza ( např. laktátová při deficitu PDH) • Alkalóza ( např. deficit OTC- ornitinkarbamoyltransferáza) • Hypoglykémie • Hyperamonémie • Hypoketóza (s hypoglykémií u poruch poxidace) • Hyperketóza (u některých org. acidurií) • Hypourikémie/hyperurikémie (porucha met.purinů) • Hypocholesterolémie/hypercholesterolémie (deficit 7-dehydrocholesterolu tzv. Smith-Lemli-Opitzúv sy) 2_Patobiochemie 2017 22 11. Akutní metabolická onemocnění •Začátek: obvykle v časném novorozeneckém či raném kojenecké období •Projevy: respirační selhání, sepse, křeče, poruchy vědomí, protrahovaná žloutenka, rozvíjející se RDS či DIC atd. •Příklady: poruchy metabolismu AMK, galaktózy, ureageneze, organických kyselin, (3 oxidace mastných kyselin 2_Patobiochemie 2017 23 12. Metabolická onemocnění s chronickým průběhem •Charakteristika: střídání bezpříznakových období s atakami, které se typicky objevují po zátěži např. změna výživy (bílkovinná zátěž), horečnaté období (zvýšená energetická potřeba organismu v průběhu katabolismu)... •Příklady: pozdní formy deficitu OTC (ornitinkarbamoyltransferáza -porucha močovinového cyklu), některé poruchy ß oxidace MK 2_Patobiochemie 2017 24 1_3. Chronicky progredující metabolická onemocnění •Charakteristika: zpočátku normální psychomotorický vývoj se po určitém období zastavuje případně dochází k jeho regresi •Příklady: střádavá onemocnění (mukopolysacharidózy, neurodegenerativní onemocnění...) 2_Patobiochemie 2017 25 4) Dělení DMP podle projevů DMP Zásadní rozdíl v povaze metabolitů, které způsobují klinické projevy onemocnění, umožňuje dědičné metabolické poruchy rozdělit do dvou skupin: •nemoci malých molekul •nemoci komplexních molekul Fenotypové projevy u dvou jedinců se stejným genotypem se mohou lišit v důsledku dalších faktorů jako je vliv prostředí (dieta, životní styl u nemocí malých molekul) či jako jsou např. epigenetické změny, epistáze (interakce s alelickými variantami v jiných genech), inaktivace X-chromozomu (lyonizace). 2_Patobiochemie 2017 26 4_1_Nemoci malých molekul jsou způsobeny - hromaděním malých toxických molekul (amoniak, organické kyseliny) - nedostatkem žádoucích metabolitů (ketolátky, glukóza), které vznikají katabolismem látek přijímaných potravou (aminokyseliny bílkovin, sacharidy, mastné kyseliny). - 1)Typicky se onemocnění manifestuje v novorozeneckém věku v průběhu několika hodin či dnů, k nevyvážené koncentraci toxických molekul dojde po zvýšeném přísunu zdroje v potravě či při horečnatých infektech, a to atakovitě, jako akutní stav se změnou chování až přechodem do komatu (např. hypoketotické kóma u deficitu MCAD-Deficit acyl-CoA dehydrogenázy mastných kyselin se středně dlouhým řetězcem (MCAD)). - Ataky se mohou dostavit opakovaně, ve spojení se specifickou situací, se kterou si ji pacient spojuje (dlouhé hladovění nebo naopak náhlé přejídání). 2) Některá onemocnění se ovšem mohou od tohoto schématu lišit a mívají i subakutní či chronickou formu a postihují i jiné orgány než jen CNS. 2 Patobiochemie 2017 27 4_2_Nemoci komplexních molekul • Nemoci velkých molekul vznikají defektem v metabolizmu (porucha tvorby, transportu látek, ale také v jejich odbourávání) endogenně tvořených makromolekul (glykosaminoglykany, glykolipidy, glykoproteiny a jiné). • Některé tyto látky tvoří stavební části buněčných membrán, což se pak projeví defektem tohoto typu, jiné jsou odbourávány v peroxisomech a lysozomech, v nichž se pak mohou hromadit. To trvá řádově měsíce až roky, nemoc probíhá bez atak a zřejmých krátkodobých nutričních či infekčních souvislostí, má chronický charakter, který se manifestuje až po uběhnutí latentní fáze, během níž se nahromadilo dostatek makromolekul, aby se defekt projevil na úrovni funkce. • Nemoci, při nichž se hromadí makromolekuly v peroxisomech či lysosomech, mohou imitovat neurodegenerativní či nádorová onemocnění. • Nemoci, při nichž dochází k membránovým defektům, zase chromozómové aberace, a to příznaky jako organomegalie, dysmorfie hlavy a obličeje, postižení CNS a jiných orgánu. 2_Patobiochemie 2017 28 Příklady nejznámějších DMP • Poruchy metabolismu AMK • Organické acidurie • Poruchy metabolismu sacharidů • Poruchy metabolismu lipoproteinů • Poruchy metabolismu purinů a pyrimidinů • Poruchy metabolismu vysokomol. látek 2_Patobiochemie 2017 29 Laboratorní diagnostika DMP - na několika úrovních: • Prenatální diagnostika - vyšetření ke zjištění, zda je plod postižen DMP, která byla prokázána v rod i nejen odůvodněné případy (AFP, vada v rodině) • Postnatální diagnostika - novorozenecký screening (PKU hypothyreosa aj.) Většinu DMP lze diagnostikovat prenatálně - analýzou enzymové aktivity nebo mutací v choriových klcích či amniocytech, nebo vyšetřením metabolitů v plodové vodě. •Včasná diagnostika - léčba, kompenzace Metabolická příručka, Laboratorní příručka Diagnostických laboratoří Ústavu dědičných metabolických poruch VFN a 1. LF UK - udmpAflxuni.cz/file/5673/Metabolická%20příručka%20verze%2002.pdf Laboratorní diagnostika DMP DNA/RNA Enzymologie substrát i produkt Metabolity 1. na úrovni metabolitu 2. na úrovni enzymů J^Patobiochemie 2017 3. na molekulární úrovni Příznaky specifické-např. zápach barva moči nespecifické-např. koma PMR dysmorfie hepato/myopathie další TEST 31 Diagnostika symptomatická PMR dysmorfie 2_Patobiochemie2017 ^ , 32. hepato/myopathie Diagnostika presymptomatická i° i substrát produkt vyšetření příbuzných s rizikem DMP prenatální diagnostika screening segmentu populace jedna nemoc nebo skupina předem známych nemocí 2 Patobiochemie 2017 novorozenecký screening Základní situace s rozdílnou diagnostikou pro DMP •DMP malé molekuly • akutně nemocný novorozenec • (opakovaná) ataka dlouhotrvajícího bezvědomí • neprospívání kojence • hypoglykémie • DMP velké molekuly • progredující postižení CNS a svalstva • dysmorfie obličeje • organomegalie (játra, slezina, srdce) 2_Patobiochemie 2017 34 Abnormální zápach a barva moči zápach (malé těkavé molekuly): • zpocené nohy-isovalerát • karamel/javorový sirup-oxokyseliny • vařené zelí-methionin oxid • rybina-trimethylamin • černý rybíz- některé organické kyseliny • myšina-fenylacetát zbarvení • červenooranžové-uráty • černohnědé při oxidaci-homogentisát • modré-indoxalové deriváty • zelené-4-OH-butyrát 2 Patobiochemie 2017 35 1.Diagnostika na úrovni metabolitů (biochemické vyšetření) •Charakteristika: prokazujeme změněnou koncentraci nějakého metabolitů ( substrát, produkt, abnormní metabolit). Nejstarší,nejjednodušší, nej rozšířenější. •Užití: všude tam, kde defektním proteinem je enzym či trasportní protein —►v místě metabolického bloku dochází k hromadění substrátu a nedostatku produktu, případně k tvorbě jiných metabolitů v důsledku aktivace alternativních metabolických drah •Materiál: sérum či plazma, moč, likvor, plná krev v podobě suché krevní skvrny na filtračním papírku 2_Patobiochemie 2017 36 prekursor substrát vedl. produkt produkt 2 Patobiochemie 2017 37 prekursor substrát vedl.produkt Příklady: • Phe a Phe-deriváty • amoniak • cystin u cystinosy • cystin u cystinurie • mukopolysacharidy 2 Patobiochemie2017 38 Příklady: • glukosa u GSD • ketolátky u poruch beta.oxidace MK • plasmalogeny u peroxisom.poruch • cystein u deficitu CBS • AdoMet u RM • ATP u mitochondriálních nemocí 2_Patobiochemie 2017 D M P- diagnostika metabolitů Substrát 2_Patobiochemie 2017 1.Diagnostika na úrovni metabolitů -pokračování - vyšetřovací metody •Vyšetřované metabolity: AMK, sacharidy, oligosacharidy, glykosaminoglykany, puriny, pyrymidinyjipidy, steroidy atd. • Používané laboratorní techniky: chromatografie - papírová - tenkovrstvá - kapalinová (iontoměničová, vysokoúčinná HPLC) - plynová (s hmotnostní spektrometrií GC/MS ) elektromigrační techniky - elekrtroforéza - kapilární elektroforéza tandemová hmotnostní spektrometrie MS/MS 2_Patobiochemie 2017 41 Běžné laboratorní nálezy u DMP Krev glykemie cholesterol TG kys. močová MAc hyperamonemie, RAIk ALT, AST CK anemie/pancytopenie Moč • ketolátky • kys. močová • krystal u rie • myoglobinurie 2 Patobiochemie 2017 42 MPS I - Hurlerova choroba (deficit a -iduronidasy) MPS I in a 6-year-old girl Electrophoresis of urinary GAGs (excretion ofdermatan sulphate/DS and heparan 2_Patobiochemie 20 #7 -1 sulnhate/HS ) Glykoproteinosy - HPTLC oligosacharidů v moči ORCINOL RESORCINOL / -mmm \ KO Sial P1 GM1 P2 Fuc KO Sial P2 Sch P1 NANA KO 2 Patobiochemie 2017 44 Diagnostika DMP - enzymů 2_Patobiochemie 2017 2. Diagnostika na úrovni enzymů •Charakteristika: prokazujeme sníženou aktivitu postiženého enzymu. Vyšetření je náročnější (ekonomicky nákladnější, často větší zátěž pro pacienta - odběr materiálu). •Užití: v prenatální diagnostice, pro potvrzení příslušné DPM, obvykle mu předchází vyšetření na úrovni metabolitů •Materiál: leukocyty, erytrocyty a trombocyty izolované z periferní krve, sérum nebo plazma, kultura kožních fibroblastů, tkáň ze svalové či jaterní biopsie 2_Patobiochemie 2017 46 Principy enzymologického vyšetření separace substrátu a produktu kvantifikace přírůstku či úbytku substrát II kofaktor produkt zmenený kofaktor kvantifikace přírůstku či úbytku 2 Patobiochemie 2017 47 Stanovení enzymů u DMP •Obvykle nutné buňky • Leukocyty, fibroblasty •Tkáně plodu a obalů plodu •Techniky fluorimetrické a radiometrické (event. fotometrické) •Měřený parametr: úbytek substrátu nebo tvorba produktu 2_Patobiochemie 2017 48 Typické výsledky enzymologie Postižení homozygoti jasně deficitní Heterozygoti: překryv Zdraví homozygoti: obvykle normálni rozdělení aktivity v populaci nmol/mg/h _ 40 20 0 r A A A A 2 Patobiochemie 2017 KONTROLY PACIENT HETEROZYGOTI 49 Množství enzymu • katalytická koncentrace enzymu, enzymová aktivita • Imunochemické stanovení enzymu o • Katal -množství enzymu, které • Specifická protilátka, neměří katalizuje přeměnu 1 mol aktivitu enzymu substrátu za 1s, za definovaných • mg/l podmínek (T, pH, nasycení mol. Enz S) • mkatal/l (na 1 L vyšetřované tekutiny) •dříve mezinárodní jednotka U/IU ( • přeměna 1 mmol S za 1 min) • mkatal/l= 60 U/l 2_Patobiochemie 2017 Molekulární diagnostika DMP produkt 2_Patobiochemie 2017 3. Diagnostika na molekulární ú rovn i •Charakteristika: diagnostika na úrovni DNA prokazuje přímo defektní gen. Ekonomicky nejnákladnější, indikovat uvážlivě •Užití: k definitivnímu potvrzení diagnózy tam, kde tak nelze jednoznačně učinit na základě vyšetření metabolitů či enzymů, dále v genetickém poradenství •Materiál: leukocyty z periferní krve, buňky z plodové vody získané amniocentézou, buňky choriových klků získané biopsií placenty 2_Patobiochemie 2017 52 OTC: Mutace c. 829 OT (R277W) A G A A A A A Gď/OG-G CT C C AGG GT Normální sekvence UJCI CaGGGOC C A G G GGAAAGAC GGC Heterozygotní delece A A A C XXAGGGCC C/, C R K K tGGÁ / \ 2_Patobiochemie 2017 1GACW2RC 54 Screen i Screening = metoda vyhledávání časných forem nemocí nebo odchylek od normy v dané populaci formou testů provádí se u všech novorozenců narozených na území ČR • rychlá diagnostika a hlavně včasná léčba dědičných metabolických poruch • potvrzení / vyvrácení onemocnění ještě před jeho projevy a poškozením dítěte Metoda odběru kapky krve z patičky na novorozeneckou screeningovou kartičku Novorozenecký screening (NS) je aktivní a celoplošné (=celostátní) vyhledávání chorob v jejich časném, preklinickém stadiu tak, aby se tyto choroby diagnostikovaly a léčily dříve, než se stačí projevit a způsobit dítěti nevratné poškození zdraví. Pod pojem novorozenecký screening lze v širším slova smyslu zahrnout i pravidelné klinické vyšetření dětským lékařem při pátrání po vrozených vývojových vadách různých orgánů či vrozených infekcích, vyšetření ortopedem při vyhledávání vrozené poruchy vývoje kyčlí (dysplazie), vyšetření očním lékařem při vyhledávání vrozeného očního zákalu (katarakty), vyšetření sluchu při vyhledávání vrozené hluchoty či ultrazvukové vyšetření ledvin k časnému záchytu vrozených vývojových vad močového ústrojí. 2_Patobiochemie 2017 55 1962 -zakladatel - prof. Robert Guthrie - zavedl bakteriální test pro včasné rozpoznání PKU a hyperfenylalaninemiev USA (využití kmene bakterií Bacillus subtilis, množí se v prostředí v vysokou koncentrací fenylalaninu) •od r. 1969 Guthrieho metoda i u nás, celoplošný screening až od r. 1975 • od r. 1985 - rozšíření screeningu o vyšetření kongenitální hypotyreózy (CH) -jodový deficit plodu, těžké pošk. vývoje mozku dítěte • od r. 2006 - přibývá vyšetření kongenitálníadrenální hyperplazie (CAH) - dříve tzv. adrenogenitální syndrom • 2009 - změny a rozšíření screeningu (dle Věstníku MZ ČR) - screening rozšířen o screening cystické fibrózy 2_Patobiochemie 2017 56 • V užším slova smyslu se novorozeneckým screeningem rozumí tzv. novorozenecký laboratorní screening (NLS), který je předmětem těchto webových stránek. Spočívá v diagnostice screenovaných onemocnění na základě stanovení koncentrace specifické látky (event. i průkazu genové mutace) v suché kapce krve na filtračním papírku - tzv. novorozenecké screeningové kartičce, která je odebírána všem novorozencům na území státu. • Pravděpodobnost, že právě jeden konkrétní vyšetřovaný novorozenec bude trpět některým z výše uvedených onemocnění, je velmi malá. Stane se tak pouze u jednoho dítěte z přibližně 1150 narozených. Právě jemu ale novorozenecký screening pomůže uchránit zdraví, někdy i život, a z hlediska ekonomie zdravotnictví sníží náklady na jeho léčbu, protože náklady na léčbu komplikací vzniklých z pozdě diagnostikované choroby bývají mnohem vyšší. http://www.novorozeneckyscreenin g.cz/historie-ns-cr Metabolická příručka, Laboratorní příručka Diagnostických laboratoří Ústavu dědičných metabolických poruch VFN a 1. LF UK - udmpdflxunixz/file/5673/Metabolická%20příručka%20verze%2002.pdf 2_Patobiochemie 2017 57 Novorozenecký screening (NS) = aktivní celoplošne J »\ / vyhledávání choroby v jejím preklinickém stadiu. Analýza suché kapky krve na filtračním papírku odebrané standardním způsobem z patičky všem novorozencům. 2_Patobiochemie 2017 58 Hyperfenylalaninémie/ fenylketonurie Charakteristika: nedostatečná přeměna Phe na Tyr Příčina: 1) Deficit fenylalaninhydroxylázy 2) Porucha metabolismu koenzymu tetrahydrobiopterinu Výskyt: asi 1:10 000, patří mezi nejčastější Existuje novorozenecký Screening- u nás od r. 1975 celoplošně - Guthrieho test Tandemová hmotnostní spektrometrie 2 Patobiochemie2017 59 Odběr krve na novorozenecký screening 2_Patobiochemie 2017 Předpoklady pro provádění celoplošného screeningu jsou shrnuty v následujících bodech: • Vyšetřovaná choroba musí být jasně definována, tj. diagnostikovatelná. • Choroba představuje významný zdravotně sociální problém. • Choroba je častá, má v danéjDopulaci určitou incidenci. Hranice incidence je však relativní a je ovlivněna především faktory ekonomickými. Ve vyspělých zemích lze v současné době spatřovat tuto hranici v incidenci 1:50 000 — 1:100 000. • Zachycení choroby v jejím časném, presymptomatickém stadiu umožňuje taková léčebná opatřeni, která zásadním způsobem pozitivně ovlivní průběh choroby či dokonce sníží úmrtnost na ni. Léčebná opatření musí být běžně dostupná a zajistitelná pro všechny zachycené jedince. Péče o pacienty je většinou soustřeďována clo specializovaných center s cílem dosažení maximální efektivity a kvality léčby. • Existuje obecně uznaný screeningový test, tj. choroba je v preklinickém stadiu detekovatelná obecně uznaným laboratorním testem v suché kapce krve s obecně přijatou hranicí negativity (tzv. "cut-off" limit) a obecně akceptovatelnou zátěží zdravé Dopulace (frekvence opakování odběru NS pro nejasný výsledek - tzv. "recall-rate" a álešná pozitivita, vyjádřená pozitivně prediktivní hodnotou - PPV).Pozn.: Parametry hodnoty "cut-off" limitu, „recall-rate", falešné pozitivity a falešné negativity jsou hlavními měřítky věrohodnosti screeningu. • Společnost [e schopna zajistit provádění laboratorního testu u všech svých novorozenců po stránce organizační a ekonomické. • Efektivita a účinnost NS je předmětem průběžného vyhodnocování. • Díky vědeckému a technologickému pokroku se počet onemocnění, která je možno diagnostikovat z nepatrného množství krve v suché kapce krve na filtračním papírku, \Jr v ■ i vil"!!''!! ' II-* navýšil na několik desítek. 2 Patobiochemie 2017 62 V České republice se od 1. 6. 2016 vyšetřuje 18 onemocnění: 1. vrozená snížená funkce štítné žlázy (kongenitální hypotyreóza - CH) 2. vrozená nedostatečnost tvorby hormonů v nadledvinách (kongenitální adrenální hyperplazie - CAH) 3. vrozená porucha tvorby hlenu (cystická fibróza - CF) 4. dědičné poruchy látkové výměny aminokyselin* 1. vrozená porucha látkové výměny aminokyseliny fenylalaninu (fenylketonurie - PKU a hyperfenylalaninemie - HPA) 2. argininémie (ARG) 3. citrulinémie I. typu (CIT) 4. vrozená porucha látkové výměny větvených aminokyselin (leucinóza, nemoc javorového sirupu - MSUD) 5. homocystinurie z deficitu cystathionin beta-syntázy (CBS), pyridoxin non-responzivní forma 6. homocystinurie z deficitu methylentetrahydrofolátreduktázy (MTHFR) 7. glutarová acidurie typ I (GA I) 8. izovalerová acidurie (IVA) 5. dědičné poruchy látkové výměny mastných kyselin* 1. deficit acyl-CoA dehydrogenázy mastných kyselin se středně dlouhým řetězcem (deficit MCAD) 2. deficit 3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenázy mastných kyselin s dlouhým řetězcem (deficit LCHAD) 3. deficit acyl-CoA dehydrogenázy mastných kyselin s velmi dlouhým řetězcem (deficit VLCAD) 4. deficit karnitinpalmitoyltransferázy I (deficit CPT I) 5. deficit karnitinpalmitoyltransferázy II (deficit CPT II) 6. deficit karnitinacylkarnitintranslokázy (deficit CACT) 6. dědičná porucha přeměny vitamínů* 1. deficit biotinidázy (BTD) *Metodika tandemové hmotnostní spektrometrie použitá pro vyšetřování dědičných metabolických poruch může zachytit dalších přibližně 20 onemocnění. 2_Patobiochemie 2017 63 Analýza DNA - poznámka • Laboratoř provádí molekulárně genetickou diagnostiku vybraných DMP a jiných genetických chorob. V současné době pracoviště může analyzovat více než 60 genů pro potřeby postnatální i prenatální diagnostiky (Tabulka 23 - metodická příručka). Základními technikami je sekvenování Sangerovou metodou, • fragmentační analýza a MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification). • Při vyšetření genomové DNA je metodou sekvenování analyzována celá kódující sekvence genu • spolu s přiléhajícími intronovými oblastmi. Pokud byly v rodině mutace již identifikovány, u • příbuzných se obvykle vyšetřují pouze tyto mutace. 2_Patobiochemie 2017 64 Léčba DMP 2_Patobiochemie 2017 65 Pro pacienty s cystickou fibrózou (CF), kteří mají mutaci I Apko A i-7olní třídy III G551D, je od roku 2012 k dispozici kauzální léčba. LcGUd I " KaUZ-clI 11 Mechanismus účinku léku ivacaftor spočívá v opravě funkce chloridového kanálu CFTR, poškozeného touto mutací. Potvrzená účinnost nového léčebného postupu, reprezentovaného právě lékem ivacaftor, přináší reálnou naději, že bude časem možné řešit základní příčinu onemocnění i u pacientů s dalšími typy mutací v genu CFTR, substrát transplantace 1 enzym transportér produkt gen promotor enzym vitamin chaperon 2 Patobiochemie 2017 66 Léčba 2- ovlivnění dráhy potrava toxicky prekursor substrát toxický vedl. produkt netoxický produkt 1 1 produkt 4 2 Patobiochemie 2017 67 Léčba 3- systémová Eliminace toxinů Hemodialýza Hemadsorption Výměnná transfúze Obecná lecba Energie Hydratace Léčba infekce Atd. 2 Patobiochemie 2017 68 Léčba DPM 1. Na úrovni metabolitu 2. Na úrovni enzymu 3. Na buněčné úrovni • Jediná kauzální léčba - na buněčné úrovni. • Léčba symptomatická a podpůrná - zmírňuje projevy neodstraňuje příčinu. 2_Patobiochemie 2017 69 1. Léčba na úrovni metabolitu a) Omezení příjmu či vzniku toxických metabolitu (např. dieta u PKU, galaktosémie, prevence katabolismu u aminoacidopatií, org.acidurií) b) Odstranění toxických metabolitu ( peritoneální dialýza, hemodialýza.výměnná transfúze) a využití alternativních metabolických drah (např. podávání benzoátu u hyperamonémií) c) Podávání metabolických inhibitorů ( např. allopurinol při hyperurikémii) d) Náhrada deficitních produktů ( např. argininu u poruch močovinového cyklu, tyrosinu u PKU) 2_Patobiochemie 2017 70 2. Léčba na úrovni enzymu a) Aktivace enzymu dodávkou koenzymů ve farmakologických dávkách ( např. pyridoxinu u deficitu cystathionin (3-synázy) b) Dodávka deficitního enzymu přímo -enzymoterapie ( např. u Gaucherovy či Fabryho choroby, některých typů mukopolysachyridóz či glykogenóz) 2_Patobiochemie 2017 71 3. Léčba na buněčné úrovni •Genová terapie s virovými či nevirovými vektory •Zvláštní postavení v léčbě pak zaujímá transplantace orgánů a tkání ( např. jater u tyrosinémie, ledvin u cystinózy, kostní dřeně u adrenaleukodystrofie) 2_Patobiochemie 2017 72 Choroby potenciálne léčitelné genovou terapií Chybějící sérové proteiny Hemoniie-fekiorVIII, IX Wiisonova choroba- Ceruloplasmin Metabolické choroby Deficiente orniiin dekarfcoxylázy Svalov* dystrofie Poruchy imunitního systému SCID-ADAdefcienoe, X=linked... Daläi choroby s Mtndůlovskou dědičnosti Cysľickď fibroza i 9 £ -ID M li Malignity Solídni nádory Leukémie, Lymfomy Neurodegeneratlvni choroby AlzJhůlmůr- aarů^aců TaL Huntinglonova choroba Partíinsorwva choroba -1 Kardiovaskulární choroby Ůčrii Choroby Komponzac* poruchy, regulace • Gene Therapy has made important medical advances in less than two decades. Within this short time span, it has moved from the conceptual stage to technology development and laboratory research to clinical translational trials for a variety of deadly diseases. Among the most notable advancements are the following: • Gene Therapy for Genetic Disorders • Severe Combined Immune Deficiency (ADA-SCID) ADA-SCID is also known as the bubble boy disease. Affected children are born without an effective immune system and will succumb to infections outside of the bubble without bone marrow transplantation from matched donors. A landmark study representing a first case of gene therapy "cure," or at least a long-term correction, for patients with deadly genetic disorder was conducted by investigators in Italy. The therapeutic gene called ADA was introduced into the bone marrow cells of such patients in the laboratory, followed by transplantation of the genetically corrected cells back to the same patients. The immune system was reconstituted in all six treated patients without noticeable side effects, who now live normal lives with their families without the need for further treatment. Chronic Granulomatus Disorder (CGD) CGD is a genetic disease in the immune system that leads to the patients' inability to fight off bacterial and fungal infections that can be fatal. Using similar technologies as in the ADA-SCID trial, investigators in Germany treated two patients with this disease, whose reconstituted immune systems have since been able to provide them with full protection against microbial infections for at least two years. • Hemophilia Patients bom with Hemophilia are not able to induce blood clots and suffer from external and internal bleeding that can be life threatening. In a clinical trial conducted in the United States , the therapeutic gene was introduced into the liver of patients, who then acquired the ability to have normal blood clotting time. The therapeutic effect however, was transient because the genetically corrected liver cells were recognized as foreign and rejected by the healthy immune system in the patients. This is the same problem faced by patients after organ transplantation, and curative outcome by gene therapy might be achievable with immune-suppression or alternative gene delivery strategies currently being tested in preclinical animal models of this disease. • Other genetic disorders After many years of laboratory and preclinical research in appropriate animal models of disease, a number of clinical trials will soon be launched for various genetic disorders that include congenital blindness, lysosomal storage disease and muscular dystrophy, among others. 2_Patobiochemie 2017 74 Gene Therapy for Acquired Diseases • Cancer Multiple gene therapy strategies have been developed to treat a wide variety of cancers, including suicide gene therapy, oncolytic virotherapy, anti-angiogenesis and therapeutic gene vaccines. Two-thirds of all gene therapy trials are for cancer and many of these are entering the advanced stage, including a Phase III trial of Ad.p53 for head and neck cancer and two different Phase III gene vaccine trials for prostate cancer and pancreas cancer. Additionally, numerous Phase I and Phase II clinical trials for cancers in the brain, skin, liver, colon, breast and kidney among others, are being conducted in academic medical centers and biotechnology companies, using novel technologies and therapeutics developed on-site. • Neurodegenerative Diseases Recent progress in gene therapy has allowed for novel treatments of neurodegenerative diseases such as Parkinson's Disease and Huntington's Disease, for which exciting treatment results have been obtained in appropriate animal models of the corresponding human diseases. Phase I clinical trials for these neurodegenerative disorders have been, or will soon be, launched. • Other acquired diseases The same gene therapeutic techniques have been applied to treat other acquired disorders such as viral infections (e.g. influenza, HIV, hepatitis), heart disease and diabetes, among others. Some of these have entered, or will soon be entering, into early phase clinical trials. • www.asact.org/about gene therapy/diseases.php • http://www.asgct.org/about_gene_therapy/diseases.php 2_Patobiochemie 2017 75 Enzymy - proteiny - urychlují biochemické reakce • 1 molekula přeměněná v nekatalyzované reakci na 106 až 1014 molekul přeměněných při reakci katalyz.enzymem Mechanismus účinku enzymů spočívá ve snížení aktivační energie pro příslušnou reakci (umožňují průběh metabolických pochodů při relativně nízkých teplotách (37°C) a při pH 6,5-7,5 ve vodném prostředí) V živočišné buňce je 1000 až 4000 různých enzymů >bílkovinná část - apoenzym, nebílkovinná - koenzym >látky vstupující do reakce - substráty, látky vznikající -produkty >Reakce : substrát se váže na specifické vazebné místo na molekule enzymu (vazebné místo je vklíněno do prohlubně enzymu tzv. aktivní centrum) 2_Patobiochemie 2017 76 Enzymatická reakce-princip Vazba substrát - enzym ; > prostřednictvím nekovalentní iontové vazby > vodíkových a hydrofobních můstků > van der Waalsových interakcí • Na funkční skupiny aminokyselinových zbytků akt.v.místa enzymu jsou napojeny koenzymy, příp.atomy kovu (metaloenzymy), účastní se katalyzované reakce • Funkční skupiny aktivují substrát a snižují energii, která je potřebná pro vytvoření vysokoenergetického intermediárního stadia 2_Patobiochemie 2017 77 ba enzym-substrát 2_Patobiochemie 2017 Patobiochemie regulací enzymové aktivity Inhibice enzymové aktivity Účinek četných léků nebo toxinů spočívá ve schopnosti inhibovat enzym. Nejsilnější inhibitory- váží se kovalentně k funkčním skupinám aktivního místa, příp. ako analogy substrátové molekuly - tvoříš enzymem komplexy Rychlost enzymové reakce: a) koncentrací substrátu, produktu b) koncentrací aktivátorů, koncentrací inhibitorů Vztah mezi rychlostí enzymové reakce a koncentrací substrátu - dán rovnicí podle Michaelise a Mentenové E + S^^ES^P + E 2_Patobiochemie 2017 79 Produkty aj. fyziologické inhibitory mohou soutěžit se substrátem o vazbu v aktivním centru enzymu a tak zpomalovat rychlost reakce Fyziologická regulace metabolických drah - schopnost měnit rychlost průběhu metabolických reakcí v dané metabolické dráze pomocí aktivace enzymů, které kata lyžují její nejpomalejší článek Enzymy mají tzv. allosterické aktivátory nebo inhibitory tj sloučeniny, které se váží na jiné místo v molekule enzymu než je aktivní centrum a ovlivňují tak konformaci molekuly enzymu Regulace také - fosforylací nebo modulátorovými proteiny Isoenzymy: enzymy, které mají odlišný sled aminokyselin v peptidovém řetězci, ale katalyzují stejnou reakci Mechanismy regulace enzymové aktivity - INHIBICE Reverzibilní inhibice aktivního centra • Enzymový inhibitor je sloučenina, která snižuje rychlost reakce vazbou na enzym. Reverzibilní inhibitory- vazba není kovalentní, mohou se od enzymu odpoutat. Produkty - jsou reverzibilními inhibitory své vlastní reakce. Kompetitivní inhibice • Reverzibilní inhibitor může soutěžit o vazbu v aktivním centru se substrátem a vytvářet s enzymem komplex, ten může disociovat na volny enzym a inhibitor Nekompetitivní inhibice • Tento inhibitor nesoutěží o vazebné místo, ale jeho vazba na enzym snižuje koncentraci aktivního enzymu, tj. snižuje vždy Vmax 2_Patobiochemie 2017 81 Při kompetitivní inhibici o vazebné místo pro substrát A soutěží strukturálně velmi podobný jiný substrát. Při nekompetitivní inhibici substrát A se dostane na své vazebné místo, ale pozici na vazebném místě jeho partnera tj. substrátu B zaujímá non-kompetitivní inhibitor (vzhledem k substrátu A), který je ale kompetitivní vzhledem k B. U nekompetitivní inhibice se inhibitor váže na komplex substrát-enzym. Příklady inhibice Nekompetitivní inhibice • nekompetitivní inhibitor se váže pouze na komplex enzym-substrát (když enzym váže substráty regulovaně): • první molekula substrátu navodí změny v konformaci molekuly enzymu, otevře se vazebné místo bud' pro kosubstrát nebo pro inhibitor. Nekompetitivní inhibitor snižuje jak Km, tak Vmax. Irreverzibilní kompetitivní inhibice • molekuly inhibitoru - strukturálně podobné substrátu se vážou kovalentně nebo tak pevně v aktivním centru, že z této vazby nemohou byt vytěsněny. Tento způsob-častým mechanismem účinku léků nebo antimetabolitů 2_Patobiochemie 2017 83 Iiihibiior Enzym Účinek, použití aspiim cyklooxygena^a protizánětlivý efekt allopurinol xanrhiiioxidasa léčeni dny 5-fluorouiacil rh>iuidy lát syutha sa kancexostatilaim penicilin transpeptidasa antibiotikum ■i; ar m cholinesterasa bojový plyn p -aminoprop io nitril lysyloxidasa abnormálni ^e?ir"o\^ni kolagenu (lathyr ismus) 2_Patobiochemie 2017 84 Mechanismus účinku irreverzibilních inhibitorů >změna afinity vazebného místa - substrátový anolog má velmi reaktivní skupinu, která není v přirozeném substrátu a která trvale blokuje aktivní centrum pro substrát (kovalentní vazba s aminokyselinovým zbytkem) 2_Patobiochemie 2017 85 Indukcí [3-laktamasv jsou takto pozměněna tzv. [3-laktamová antibiotika : ^peniciliny, cefalosporiny, karbapenemy Obdobný účinek může mít indukce: >acetyltransferasy/ fosfotransferasy nebo nukleotidyltransferasy na aminoglykosidv >acetyltransferasa na chloramfenikol 2_Patobiochemie 2017 86 Alosterické regulace Alosterický efektor se reversibilně váže na jiné místo, než je aktivní místo enzymu. Tato vazba navodí: konformační změnu aktivního místa, a to tak, že buď dojde k aktivaci enzymu nebo jeho inhibici (vazetinä .tti'wí pro s ľdsľst Schéma alosterické aktivace a inhibice 2_ 87 Další mechanismy regulace enzymové aktivity Kovalentní modifikace fosforylací hydroxylové skupiny fosforylasakinasou. Fosforylace enzymu aktivuje aktivní místo enzymu -> aktivní konformace, defosforylace -> inaktivace. Limitovaná proteolýza - aktivace je navozena odštěpením krátkého peptidu z polypeptidového řetězce, tzv.proenzymu nebo enzymogenu Svede ke změně konformace aktivního místa, které může v této formě navázat substrát Příkladxhymotrypsinogen -» chymotrypsin prothrombin —> thrombin Poznámka: - proteolytické pankre athui enzym slinivce jako prekurzory, se aktivují v lumen střeva. Jinak by natrávily vlastní tkáň pankreatu. 2_Patobiochemie 2017 88 Pokrač-Další mechanismy regulace enzymové aktivity >Indukce syntézy enzymu množství enzymu v buňce závisí na rychlosti jeho syntézy nebo degradace (trvá několik hodin až dní, předcházející způsoby regulací aktivity jsou minutové záležitosti) > Potlačení syntézy enzymu Příklad: tímto mechanismem -potlačením syntézy - působí např. Omeprazol -potlačuje syntézu proteinu tzv. protonové pumpy v žaludeční sliznici, brání tak produkci HCl. Používá se proto pro snížení acidity žaludečního sekretu a tím omezení jeho agresivního účinku (léčba vředové choroby) >Zpětnovazebná regulace konečný produkt reguluje rychlost své vlastní syntézy, konečný produkt může metabolickou dráhu inhibovat nebo příbuzný metabolit může aktivovat regulační (klíčový) enzym Konečný produkt může regulovat svoji vlastní syntézu - působením na gen pro transkripci klíčového enzymu metabolické dráhy - mnohem pomalejší proces než regulace allosterickým mechanismem. 2_Patobiochemie 2017 89 Klasifikace a názvosloví enzymů Třídy enzymů: 1. oxidoreduktasy 2. transferasy 3. hydrolasy 4.lyasy 5. isomerasy 6. ligasy Koncovka názvu enzymů: substrát + -asa Př. laktátdehydrogenasa, amylasa, alkoholdehydrogenasa.aspartáttransaminasa... TEST 2_Patobiochemie 2017 23 Enzymy v diagnostice Složení krve červené krvinky - A2% bílé knrfnky-1M plazma-57% Plazma tvoří 55% naší krve a sestává se 91% z vody. Obsahuje více než 120 různých proteinů, které přebírají životně důležité funkce, jakými jsou např. obranyschopnost organismu před infekcemi a srážlivost krve při poraněních. Složeni krevní plazmy voda - STO minerální látky-2% plazmatické bílkoviny - 8*ú 2_Patobiochemie 2017 91 2. Plasma vs. serum •Plasma is the liquid, cell-free part of blood, that has been treated with anticoagulants. Serum is the liquid part of blood AFTER coagulation, therfore devoid of clotting factors as fibrinogen. Anticoagulated Clotted -4 .Ä 1 *serum= plasma - fibrinogen serun Mood clot 2 Patobiochemie 2017 TEST 92 ENZYMY V KLINICKÉ DIAGNOSTICE Druhy enzymů v plasmě: >normálně fyziologicky přítomny v plasmě pouze enzymy kaskády krevního srážení nebo cholinestersa (fyziologická funkce) >přítomny v plasmě (jsou uvolňované z buněk), ale nemají zde funkci, v p asmě v nízké, nepatrné koncentraci Buněčné a sekreční enzymy: >Buněčné enzymy -enzymy metabolických dějů, lok. v cytoplasmě nebo organelách - mitochondriích, při poškození buněk se uvolňují do krevního oběhu, většina enzymu v klinicko-biochemické diagnostice (AST, ALT, CK, LD, GMT) >Sekreční enzymy - jsou sekretovány buňkami žláz (slinné žlázy, pankreas) do extrace ulárního prostoru, NE do plasmy! (typicky-trávicí enzymy), při onemocnění orgánu se tyto enzymy dostávají do krevního oběhu... (amylasa, pankreatická lipáza) V krvi zdr. člověka - koncentrace obou typů enzymů velmi nízká X v buňce asi 103 -104x vyšší - malé množství enzymů v plasmě je důsledkem přirozené obměny buněk. 2 Patobiochemie2017 93 Příčiny zvýšené aktivity, koncentrace enzymů v plasmě 1. Patologické ť kone, enzymů v plasmě - důsledek zvýšené permeability buněčné stěny - poškozena chemickými látkami, anoxií, hypoxií, viry, zánětem. Může vést k degradaci buňky. Při odumírání, zániku buňky —► zvyš.aktivity fosfolipas, ty odbourávání fosfolipidů cytopl.membrány —► perforace —► uvolnění obsahu + enzymy do extracelu árního prostoru —► plasmy 2. Příčinou zvýšené hladiny E, zvýšená syntéza E - není patol., ale souvisí se stavem v org : Př. růst kostí f aktivitu osteoblastů f v krvi alkalická fosfatasa U dětí ALP 3x-7x vyšší než dospělých Léky, alkohol | aktivitu enzymů (jaterních) - ALP, GMT apod. 2_Patobiochemie 2017 94 Příčiny zvýšené koncentrace enzymů v plasmě 3- Uvolňování z buněk nesouvisející s smrtí buňky nebo zvyš. syntézou - Př. ethanol uvolňuje expresi mitochondriální AST v hepatocytech, její přesun na povrch hepatoctů —► uvolnění do krve. Př. Příjem potravy —► uvolnění střevní ALP —>do lymfy, | v krvi . Př. Jaterní enzymy jsou vázány na povrch hepatocytů, mohou být uvolňovány do krve.... 4. Některé případy zvýš.hodnot - nedostatečné odstraňování z cirkulace. Př. malé enzymy - amylasa, lipasa - odstraňovány z cirkulace glomerulární filtrací. Porucha fce ledvin, renální selhání ť jejich hodnoty v krvi. Tvorba komplexů E-Ab (tzv. makroenzym), poločas rozpadu Ig-3tvdny 2_Patobiochemie 2017 95 Časový průběh nárůstu a poklesu enzymové aktivity v plasmě Časový průběh - ovlivněn řadou faktorů: >Při apoptose se defekty buněč. membrány prohlubují s časem. Důsledek- z buňky se uvolňují nejdříve malé molekuly E, později velké E. Př. při infarktu myokardu(IM) - nejdříve v plasmě AST a CK (malé molekuly), později LD (větší). Při IM - koncentrace CK v plasmě je úměrná velikosti ložiska zasaženého IM. >Když příčina poškození buněk vymizí, koncentrace enzymu přetrvává nějakou dobu, poté klesá. Př. akutní hepatitída se dá odlišit od toxického poškození jater. Při vir. hepatitíde - imunologické poškození buněk, delší setrvávání zvyš. koncentrace enzymu, tox. poškození -rychlejší návrat hladiny enzymu k normálu (GGT,AST, ALT). 2_Patobiochemie 2017 96 Aktivita enzymů v plasmě ^Gradient koncentrace enzymů mezi buňkou a plasmou - uvnitř hepatocytu v cytoplasmě = vyšší koncentrace AST než ALT , LD zde minimálně. • Př. při poškození hepatocytu - nejrychlejší nárůst AST, ale LD minimálně. • Př. myokard - vysoká konc.CK, nízká LD, poškození—► rychlý vzestup CK v plasmě Koncentraci enzymu v plasmě určuje rychlost jeho odstraňování. >nízkomolekulární -glomerul. filtrace >ostatní (většina) - inaktivovány v plasmě, odstraněny buňkami RES přes receptory, endocytóza 2_Patobiochemie 2017 97 Definice - biologický poločas enzymu Dobu, jdo kterou je enzym v plasmě zvýšen určuje jeho biologicky poločas . Biologicky poločas enzymu - doba, za kterou by množství enzymu Kleslo na polovinu, pokua bv nebyl enzym ze tkání doplněn Enzvmv Biol.Določas ALP 3-7 dny AMS 9-18 hod ALT 2 dny AST 12-14 hod CHS 10 dní CK 10 hod GMT 3-4 dny LDH1 (HHHH) 4-5 dní LDH5(MMMM) 10 hod 2_Patobiochemie 2017 98 Subcelulární lokalizace některých enzymů v jaterní buňce Hlavní diagnostické enzymy jaterní buňky jsou lokalizovány v různých oblastech hepatocytu. ALT a cytoplazmatický isoenzym AST se nachází v cytoplazmě. cytoplazma - napr. ALT. LD. cAST (30 % AST) mitochoudne - napr. GMD, niAST (70 % AST) Golgiho komplex, endoplazuiatické retikulum (CHS. AMS) lyzosom (ACP) buněčná membrána {GGT. ALP) TEST • Při membránovém poškození (např. virovém, nebo chemickou látkou) jsou tyto enzymy uvolněny a dostávají se do sinusoidu. Důsledkem je zvýšení hladiny v plazmě. • Mitochondriální AST je primárně uvolněna při poškození mitochondríí, např. při působení alkoholu. • ALP a GGT se nachází na kanalikulárním povrchu hepatocytu a uvolňují se zejména při cholestáze v důsledku působení žlučových kyselin na membránu. • GGT se nachází rovněž v mikrosomech, kde je indukována některými léky. Podávání těchto léků pak zvyšuje hladinu GGT v plazmě. 2_Patobiochemie 2017 99 Využití enzymů v klinické diagnostice >Detekce poškození tkáně ^Identifikace počátku poškození tkáně > Sta n o ve ní rozsahu poškození ^Odhad závažnosti poškození buněk >Diagnóza základních onemocnění ^Specifikace diagnózy v rámci poškozeného orgánu TCCT 2_Patobiochemie2017 100 Upřesnění diagnózy • Informace vhodná pro upřesnění diagnózy se získá: • - z hodnoty katalytické koncentrace enzymu v tělní tekutině (přímá úměra mezi stupněm poškození orgánu a zvýšenou aktivitou enzymy v krvi). • - s přítomného spektra enzymů v krvi (např. při těžkém poškození jaterního parenchymu doprovázeném nekrózou buněk je zvýšení aktivity enzymů v krvi následné: LD > AST > ALT). • - z výpočtu poměru aktivit enzymů (např. dle poměru aktivit AST/ALT v séru lze odlišit počáteční obštrukční ikterus (AST/ALT < 1) od aktivní chronické hepatitídy (AST/ALT > 1). U akutních onemocnění lze z poměru aktivit enzymů s krátkým a dlouhým biologickým poločasem určit fázi onemocnění nebo předpovědět průběh onemocnění, např. u akutní hepatitídy pokles poměru AST (poločas 12 h)/AI_T (poločas 2 dny) napomáhá rozlišení typu hepatitídy. • - z monitorování enzymové aktivity (mechanismus uvolňování enzymů do krve z poškozené tkáně a jejich clearance je charakteristický typickými kinetickými křivkami aktivity, z jejichž průběhu je možné odvodit časový úsek, během kterého je onemocnění přítomné nebo lze určit fázi onemocnění) • - ze stanovení isoenzymu. 2 Patobiochemie2017 101 Makroenzymy • Makroenzymy jsou komplexy tvořené enzymem navázaným imunoglobulin, některý lipoprotein, protein nebo fragment buněčné membrány. • Obecně mají makroenzymy větší molekulovou hmotnost a delší poločas v krvi. Přítomnost makroenzymu v séru může ovlivnit jeho analytické stanovení nebo způsobit chybnou interpretaci výsledku stanovení. • Známým příkladem je makroamylasemie, kdy amylasa tvoří komplex jinými makromolekulami a není tudíž filtrovatelná do moče. V důsledku toho se akumuluje v krvi. Hladina amylasy je pak v krvi zvýšená, aniž by docházelo k jejímu zvýšenému uvolňování z poškozené tkáně (asi 1-3% pacientů se zvýšenou hladinou sérové amylasy). • Protože makroamylasa neprostupuje do moče, hladina amylasy moči je v tomto případě normální nebo snížená, na rozdíl od situace při např. pankreatitidě, kdy zvýšená hladina amylasy v séru je provázena i zvýšením amylasy v moči. Makrolipáza (makroforma enzymu) * byla prokázána u 2 ze 20 pankreatitid se zvýšenou hodnotou lipázy a tvořila 10-18 % celkové aktivity. Poprvé byla popsána v roce 1987 u non-Hodgkin lymfomu, kdy katalytická aktivita lipázy byla zvýšena v séru 7*. Výskyt makrolipázy je v mnoha případech provázen i makroamylázou či onemocněními autoimunitního charakteru, např. céliakií. PROCES ABSORPCE LIPIDU STRUKTURA MICELY A CHYLOMIKRONU Tkáňová distribuce diagnosticky významných enzymů • Poškozená tkáň může být diagnosticky nepřímo lokalizována buď ze stanovení aktivity tkáňově specifických enzymů, nebo isoenzymů v krvi. • Tkáňově specifické enzymy se vyskytují přednostně v určité tkáni nebo mají v dané tkáni vysokou aktivitu. Příklady tkáňově specifických enzymů jsou uvedeny v následující tabulce. • Exprese isoenzymů je většinou pro každou tkáni určena geneticky. Proto stanovení isoenzymů v krvi umožňuje identifikovat poškozenou tkáň, z které pocházejí (např. pankreatická lipasa, CK-MB, LD1). Orgán AST ALT LD LDi CK GGT^ ALP ACP AMS LPS CHS Játra x xx x xxx x xxx Myokard x x xx xx Sval x x x xx Žlucovod xx Ledviny x x x x x Kosti xx x Erytrocyty* x x x xx Prostata xxx Pankreas x xx xx xxx Parotis xx * v eiytrocytech lOOkrát více LD než v plazmě " nízká orgánová *peciííčiiost_ snadno indiikovatelný Klinicky významné enzymy TEST Am i notransf erasy >zajišťují konverzi aminokyselin a a-ketokyselin přenosem aminoskupiny, donor a akceptor aminoskupiny je 2-oxoglutarát/ L-glutamát • Alaninaminotransferasa. ALT - donorem -NH2 Ala za vzniku pyruvátu, marker- játra (virová hepatitída, alkohol, hepatopatie ...) • Aspartátaminotransferasa. AST - donorem - NH2 Asp za vzniku oxalacetátu, marker poškození - játra, srdce, infarkt myokardu, svalová poškození ALT alaninaminotransferasa hepatopatie;srdeční onemocnění; poměr AST / ALT > 1 alkoholické jaterní choroby, infarkt myokardu, AST / ALT < 1 virová hepatitída AST aspartátaminotransferasa infarkt myokardu; hepatopatie; krevní choroby; svalová poškozenfatob,oche,me2017 105 Klinicky významné enzymy oc-amylasa, AMS >syntetizována ve slinivce, štěpí a-1,4-glykosidickou vazbu glykogenu a škrobu za vzniku oligosacharidů, produkovaná slin.žlázami a slinivkou břišní, liší se cukernou složkou, izoenzymy S/P, příčiny -poškození žlaz (např. akutní pankreatitida), snížené vylučování enzymu ledvinami alkalická fosfatasa, ALP >hydrolýza monoesterů kyseliny fosforečné s alkoholem, fenolem, glycinem - nespecifická - štěpí vazbu P-O-C, P-O-P, P-S, P-N, má několik izoforem podle tkáně syntézy - kostní, jaterní, placentami, střevní, optimum v alkalické oblasti, marker - poškození kostí, jater kyselá fosfatasa, ACP •vlastnosti ALP, optimum v kyselé oblasti, marker- prostata 2_Patobiochemie 2017 106 Další klinicky významné enzymy kreatinkinasa, CK >katalyzuje reverzibilní fosforylaci kreatinu na kreatinfosfát za spotřeby ATP, marker poškození svalů, srdce Laktátdehydrogenasa, LDH >isoformy (tkáň) srdce, játra, katalysuje reakci: I aktá t + NAD+ <-> pyruvát + NADH + H+ (reversibilní), není specifická, poškození tkáně dle isoformy - elektroforeticky (plicní embólie LDH3,infarkt myokardu LDH1,2, hepatopatie + nemoci koster.svalstva LD4,5). LD (S; konc. katal. akt. [|jkat/l] abs. spektrofotometrie) Výpovědní hodnota •LD se vyskytuje v cytoplasmě všech buněk, koncentrace ve tkáních je asi 500x vyšší oproti koncentraci v séru. Proto i při minimálním poškození buněčné mebrány dochází k elevaci LD v séru. •Je nespecifickým ale velmi citlivým markerem poškození buněk (především hepatocytů, myocytů, kardiomyocytů, erytrocytu, leukocytu), lze ji použít jako obecný screeningový marker buněčné lýzy •Dříve používané elektroforetické vyšetření izoenzymů LD k rozlišení etiologie je v současné době nahrazeno specifičtějšími vyšetřeními (haptoglobin, troponiny, jaterní enzymy atd.). https://wwwikemxz/plmJp/^P^2290-L0000006.htm Klinicky významné enzymy • Příčiny zvýšené aktivity v séru • AST aspartátaminotransferasa infarkt myokardu; hepatopatie; krevní choroby; svalová poškození • ALT alaninaminotransferasa hepatopatie;srdeční onemocnění; poměr AST /ALT > 1 alkoholické jaterní choroby, infarkt myokardu, AST / ALT < 1 virová hepatitída • LD laktátdehydrogenasa LD1,2 - infarkt myokardu, hemolytické anemie;LD3 - plieni embolie;LD4,5 -hepatopatie, nemoci kosterního svalstva • HBD hydroxybutyrátdehydrogenasa aktivita podjednotek H (LD1,2), infarkt myokardu • GGT gama-glutamyltransferasa hepatopatie (zánět, alkohol, léky);test chronické konzumace alkoholu;cholestáza • ALP alkalická 1vsfatasa jaterní isoenzym - nemoci žlučových cest;kostní isoenzym - nemoci kostí (Pagetova choroba, rachitis, nádory), fyziologicky zvýšen v období růstu • ACP kyselá fosfatasa prostatický isoenzym - tumory prostaty;kostní isoenzym - metastázy tumorů do kostí, marker osteoporózy • CK kreatinkinasa CK-MB — především infarkt myokardu;ale též při regeneraci kosterních svalů, chronických svalových onemocnění a akutním renálním selhání; • CK-MM - nemoci kosterního svalstva,intramuskulární injekce, tělesná aktivita • AMS amylasa (Mr ~ 50 000) pankreatický isoenzym - akutní pankreatitida;slinný isoenzym - parotitida • LPS lipasa akutní pankreatitida;akutní zvrat chronické pankreatitidy • PSA prostatický specifický antigén karcinom prostaty TEST • Příčiny snížené aktivity v séru • CHE cholinesterasa chronické hepatopatie,alkoholicko-toxická hepatitída (intoxikace organofosfáty);ukazatel jaterní prOteOSyntézy 2_Patobiochemie2017 108