Vztah patobiochemie a klinické biochemie.
Klinicko-biochemická analytika a její specifické
rysy. Terminologie klinické biochemie.
Analyzovaný materiál. Odběr materiálu.
Vztah patobiochemie a klinické biochemie
• Patobiochemie = obor zabývající se biochemickými procesy za
patologických stavů/biochemickými mechanismy, které vedou ke
vzniku určité nemoci.
• Klinická biochemie = interdisciplinární obor zaměřený na zkoumání
základních biochemických procesů v lidském organismu z hlediska
lidského zdraví resp. z hlediska léčení nemocí, popřípadě z důvodu
prevence vzniku nemoci.
Klinicko-biochemická analytika
• Biochemický analyt = vyšetřovaná biochemická látka.
• Analyty mohou být endogenního nebo exogenního původu.
• Analyty endogenního původu: substráty a produkty buněčného
metabolismu: ionty, minerály, enzymy, vitamíny, stopové prvky a další látky,
které se fyziologicky nachází v lidském organismu.
• Analyty exogenního původu: látky přírodního původu (toxiny živočichů, hub,
rostlin, plísní, bakterií, alergeny), léky a jejich metabolity, alkoholy, drogy,
látky zneužívané k dopingu, průmyslové produkty, průmyslové odpady.
• Laboratorní vyšetření analytu se provádí přesně definovanou
vyšetřovací metodou a skládá se ze 3 části: preanalytické, analytické
a postanalytické fáze.
Preanalytická fáze
• Příprava pacienta k odběru biologického vzorku.
• Odběr biologického vzorku.
• Preanalytická úprava vzorku po odběru (přidání antikoagulační přísady – získání nesrážlivé krve, NaF pro vyšetření koncentrace
glukózy v plazmě, konzervačních látek …).
• Vyplnění žádanky.
• Transport vzorku do klinické laboratoře.
• Příjem vzorku.
• Separace séra/plazmy od buněčné složky krve.
• Uložení vzorků/jeho alikvotů (pokud není vzorek bezprostředně vyšetřen).
• Dočasná archivace vzorku pro případné opakování analýzy.
• Příprava vzorků analytických fyzikální a chemickou úpravou vzorků biologických (úprava pH, zahušťování, ředění, dialýza,
sedimentace, filtrace, extrakce do organické fáze, denaturace bílkovin, mineralizace, amplifikace – molekulárně biologická
vyšetření, sušení, homogenizace, lyofilizace…).
• Nestandardní podmínky preanalytické fáze (nesprávně provedený odběr, nepřijatelná doba transportu, nejednoznačná
identifikace vzorků, nedostatečně vyplněná žádanka, vylitý obsah zkumavek…)→ klinické laboratoře mají povinnost odmítnout
materiál.
Analytická fáze
• Příprava analytického systému: spuštění laboratorních přístrojů,
temperování vodních lázní, provedení optických testů a kalibrace,
vnitřní kontrola kvality).
• Analýza biologického vzorku příslušnou vyšetřovací metodou.
• Přepočet měrných fyzikálně-chemických veličin (absorbance,
fluorescence, chemiluminiscence atd.) na koncentrace analytu
vyjádřené v obvyklých jednotkách.
Postanalytická fáze
• Vyjádření získaného výsledku zaokrouhleného na příslušný počet
desetinných míst a dosazení získaných hodnot do vzorců (např. pro výpočet
ledvinové clearance).
• Interpretace výsledku vzhledem k fyziologickému rozmezí hodnot,
diagnóze, stádiu choroby, fázi její léčby a též k hodnotám analytu
naměřeným při přechozím odběru.
• Potvrzení výsledku zdravotní laborantkou a klinickým biochemikem.
• Odeslání výsledku (tištěná podoba/elektronická podoba) ošetřujícímu
lékaři.
• V některých případech může být výsledek vydán přímo pacientovi nebo
osobám právně zmocněným k jeho převzetí.
Preanalytické vlivy na výsledek laboratorního vyšetření
• K ovlivnění výsledku laboratorního vyšetření může dojít ve všech třech
fázích.
• Nejdůležitější z hlediska možného ovlivnění výsledků je období
preanalytické.
• V preanalytické fázi může být výsledek ovlivněn:
• Osobou pacienta
• Odběrem vzorku
• Transportem vzorku
• Uchováváním vzorku před analýzou
• Přípravou vzorku ke zpracování
Osoba pacienta-faktory ovlivnitelné
• Pohlaví (většina laboratorních testů na pohlaví nezávisí, ale najdeme i metody, u kterých se referenční
rozmezí u žen a mužů liší, např. parametry červeného krevního obrazu).
• Rasa, etnická či sociální skupina obyvatel (např. negroidní rasy mají výrazně menší počet granulocytů
než běloši, liší se i v referenčních hodnotách dalších testů, jako je amyláza, alkalická fosfatáza,
kreatinkináza). Příslušníci etnických skupin se mohou lišit např. frekvencí určitých genů a tedy i
výskytem dědičných poruch metabolismu. Referenční hodnoty mohou být ovlivněny i stravovacími
návyky typickými pro určitou etnickou či sociální skupinu obyvatel.
• Věk: většina testů má v dětském věku nižší horní hranici referenčního rozmezí. Např. vyšší aktivita
kyselé alkalické fosfatázy a koncentrace anorganického fosforu v důsledku tvorby kostní tkáně. Výsledky
některých laboratorních testů (např. clearance kreatininu) je nutné u dětí korigovat podle hmotnosti
nebo povrchu těla.
• Současně probíhající jiná nemoc (např. u pacienta s revmatoidní artritidou nalezneme zvýšenou
hodnotu c-reaktivního proteinu).
• Biologický poločas analytu (např. diagnostika infarktu myokardu dle aktivity enzymů a hladin svalových
proteinů v séru). Znalost rychlosti vylučování látky z organismu má velký význam při hodnocení hladin
léků a toxických látek = poločas eliminace xenobiotika.
• Způsob stanovení referenčních hodnot.
Osoba pacienta-faktory ovlivnitelné
• Gravidita: v krvi a moči matky se objevují bílkoviny a jiné látky produkované trofoblastem
nebo orgány plodu (hCG, SP-1, α1-fetoprotein, placentární alkalická fosfatáza,
estrogeny…). Hormonální vlivy se uplatní i u některých běžných metabolitů: v posledním
trimestru stoupá cholesterolémie, vlivem hemodiluce klesá koncentrace hemoglobinu,
stoupá glomerulární filtrace → pokles kreatininu i močoviny v séru…
• Cyklické změny (např. diurální rytmus kortizolu, měsíční rytmus vylučování ženských
pohlavních hormonů. Cirkadiánnímu rytmu podléhají také koncentrace některých jiných
analytů.
Osoba pacienta-faktory neovlivnitelné
• Fyzická aktivita (např. stoupá koncentrace celkové bílkoviny a látek na ni vázaných, mění
se pH (při anaerobní záteži), zvyšuje se koncentrace laktátu, uvolňují se svalové bílkoviny
do krevního oběhu (stoupá aktivita CK, AST, LD, koncentrace myoglobinu)…Velikost změn
závisí na řadě faktorů, jako je délka zátěže, intenzita zátěže (aerobní, anaerobní),
trénovanost jedince.
• Psychický stres vede k vyplavení hormonů kůry a dřeně nadledvin a jejich metabolickými
účinky, např. hyperglykémií, vzestupem koncentrace volných mastných kyselin…
• Potrava, alkohol, příjem tekutin.
• Kouření (např. může ovlivnit rychlost metabolizace léku teofylinu).
• Léky: lék může působit na metabolismus analytu (mění jeho rychlost např. indukcí
syntézy či naopak inhibicí enzymů, ovlivňují vazbu na transportní bílkoviny…) nebo může
rušit (interferovat) při vlastní chemické reakci (např. maskování přítomnosti glukózy/krve
v moči kyselinou askorbovou při vyšetření diagnostickým proužkem).
• Operace: narkotikum (hepatotoxicita), zhmožděná tkáň a řez tkání (vzestup aktivity CK,
AST, LD, koncentrace myoglobinu), hormonální odpověď na stres.
Základní vzorky biologického materiálu
• Krev srážlivá
• Krev nesrážlivá
• Krevní sérum
• Krevní plazma
• Moč (jednorázová, sbíraná)
• Pot
• Žaludeční obsah
• Likvor (mozkomíšní mok)
• Výpotek a jiné tělesné tekutiny
• Stolice
• Kostní dřeň
Odběr vzorku
• Záleží na poloze pacienta určitou dobu před odběrem a během odběru vzorku a druhu odebrané
krve. Výsledek také mohou ovlivnit přídavky k odebrané krvi a druh nádobky.
• Odběr venózní krve: z loketní žíly.
• Poloha pacienta: doporučuje se odběr v leže. Vstoje dochází k přesunu tekutiny z
intravazálního prostoru do intersticia a koncentrace vysokomolekulárních látek (a látek na ně
vázaných) v krvi včetně hematokritu může stoupnout o 10 – 15 %.
• Dezinfekce kůže: použiti alkoholického roztoku dezinfekce před odběrem krve na stanovení
koncentrace alkoholu → falešně pozitivní výsledek. Dezinfekce kůže povrchově aktivní látkou
(Ajatin) → hemolýza.
• Stažení paže + cvičení by mělo být co nejkratší, jinak může dojít k výše uvedenému přesunu
tekutiny, anaerobnímu metabolismu (lokální acidóza).
• Pozor na podtlak při nasávání krve. Příliš velký podtlak → mechanická hemodialýza.
• Odběr jiných typů krve než venózní: kapilární krev (např. z bříška prstu pro stanovená glykémie),
tepenná krev (vyšetření krevních plynů), arterializovaná kapilární krev (vyšetření acidobazické
rovnováhy).
Odběrová nádobka
• Popsat nádobku jménem pacienta před vlastním odběrem vzorku! Je možné
také identifikovat pacienta pomocí kódu, např. čárového.
• Krev vypouštět ze stříkačky pomalu, nikdy ne přes jehlu (aby nedošlo k
hemolýze).
• Většina vyšetření se provádí ze séra → krev se musí nechat srazit.
• Nejvhodnější jsou odběrové nádobky na jedno použití. Většinou jsou z plastové
hmoty (krev se v nich pomalu a nedostatečně sráží, častěji dochází k hemolýze)→
výrobce opatřuje stěny odběrových zkumavek vrstvou kaolinu či skelnou vatou
→ urychlení srážení. Oddělení séra umožňuje speciální interní gel (tvoří rozhraní
mezi krvinkami a vrstvou séra).
• Skleněné nádobky → lepší srážlivost krve, ALE: častější prasknutí při
odstřeďování (znehodnocení vzorku, kontaminace centrifugy).Před opakovaným
použitím je nutné nádobku dekontaminovat a umýt → zbytky činidel ve
zkumavce → znehodnocení výsledků analýzy.
Vyšetření z nesrážlivé krve a plazmy
• Pro některá vyšetření je nutné získat nesrážlivou krev, jde o vyšetření prováděná z celé
krve (acidobazická rovnováha, laktát, glykémie, minerály pomocí iontově selektivních
elektrod) z erytorcytů (glykovaný hemoglobin, kalium/magnezium v erytrocytech, 2,3bisfosfogylcerát,
superoxiddismutáza, glutathion…) nebo plazmy (fibrinogen, kyselá
fosfatáza).
• Důležité je dodržet předepsaný poměr mezi objemem roztoku antikoagulantu a přidané
krve.
• Krev se vždy přidává do odběrové nádobky s antikoagulačním přípravkem, nikdy
naopak.
• Antikoagulační přípravek ovlivňuje složení odebrané krve. Např. všechny antikoagulanty
včetně heparinu vážou Ca2+ a Mg2+ a snižují tak jejich koncentraci. Pro stanovení
koncentrace Ca2+ musíme používat heparin vytitrovaný těmito ionty. Může dojít k inhibici
různých enzymů. Všechny antikoagulanty jsou anionty, kde doprovodný kation je Na+ (K+,
NH4
+, Li+). Např. pro stanovení iontů z krve odebrané do nádobky určené pro stanovení
glykémie (obsahuje NaF a Na2EDTA) dostaneme hodnotu Na+ zvýšenou.
Transport vzorku
• Transport krve probíhá v uzavřených odběrových nádobkách.
• Krev při transportu chráníme před extrémní teplotou (v teple dochází
k inaktivaci enzymů, rychleji klesá koncentrace glukózy, mráz může
způsobit hemolýzu).
• Vystavení krve světlu může způsobit odbourávání bilirubinu.
• Transport musí být dostatečně rychlý, aby mohlo být odděleno sérum
od krvinek (1-2 h od odběru v závislosti na analytu).
• Na delší vzdálenost vždy raději posíláme sérum než celou krev (hrozí
mechanická hemolýza).
Uchovávání vzorku
• Podmínky uchovávání mají vliv na stabilitu analytů.
• Při delším stání odebrané krve dochází k vyčerpání energetických zdrojů erytrocytů (glukózy) →
porucha funkce membrány (zajišťuje transport Na+ ven a K+ do buňky) → únik K+ z erytrocytů →
hyperkalémie.
• Uchovávání v teple → leukocyty spotřebovávají kyslík + produkce CO2 + anaerobní glykolýza v
erytrocytech → pokles pH krve. Proto se krev na vyšetření acidobazické rovnováhy a krevních
plynů uchovává na ledu.
• Při stanovení glykémie/laktátu se přidává NaF → inhibice glykolýzy. Bez přídavku NaF klesá
glykémie činností erytrocytů.
• Většina vyšetření se provádí z krevního séra. Uchovává se v chladničce při +4°C v dobře zavřené
zkumavce, aby nedošlo k zahuštění vzorku odpařením vody (analyty a enzymy jsou stabilní několik
dní). Delší skladování → uchovávání zmraženého séra (při -20°C/-80°C).
• Chemická konverzační činidla se pro stabilizaci séra užívají vzácně (nesmí interferovat při
analýze). Používají se pouze pro konverzaci vzorků moči → vždy vybíráme podle druhu analýzy.
Příklady chemických konzervačních činidel: thymol v izopropanolu, HCl, formalin (fixace buněk).
Prvotní zpracování a příprava vzorku k analýze
• Odstředění krve. Příliš razantní → hemolýza krve !
• Oddělení séra/plazmy.
• Deproteinace vzorku před analýzou (obvykle pomocí chemického
činidla → volit dle následné analýzy).
• Zahuštění vzorku (např. zahušťování bílkovin obsažených v
moči/mozkomíšním moku před jejich separací elektroforézou, volit
správnou velikost pórů).
• Vzácněji další postupy (např. promývání erytrocytů).
Hemolýza
• = rozpad erytrocytů + vylití jejich obsahu včetně červeného krevního braviva do
plazmy (séra).
• K hemolýze obvykle dochází in vitro, tj. při odběru, transportu a zpracování krve.
• Ovlivnění výsledků hemolýzou:
• Z erytrocytů se do plazmy uvolňuje intracelulární obsah erytrocytů → zvýšení koncentrace
intracelulárních komponent (např. LD, AST, ACP, draslíku).
• Červená barva hemoglobinu vadí při fotometrickém stanovení analytů.
• Hemoglobin působí jako pufr a mění pH činidla → ovlivňuje průběh reakce (např. stanovení
albuminu, hemolýza výsledek snižuje).
• Podle příčiny dělíme hemolýzu na:
• Mechanickou (příliš silné třepání, nasávání krve při odběru jehlou/vystřikování krve jehlou,
centrifugace při vysokých otáčkách, transport plné krve na delší vzdálenost aj.)
• Osmotickou (mokrá zkumavka)
• Tepelnou (krev vystavena mrazu/vysoké teplotě).
• Chemickou (dezinfekční prostředek, který rozrušuje membránu erytrocytů).
Vyšetřovací metody v klinické biochemii
• Laboratorní pozorování:
• analyt vyšetřován lidskými smysly (zrak, čich).
• Často se používá mikroskop, např. mikroskopické určení
močového kamene (konkrementu).
• Laboratorní pozorování = kvalitativní analýza →
hodnotíme, co je přítomno ve vzorku, nevyjadřujeme se
k množství, obsahu nebo koncentraci analytu.
• Kvalitativní biochemické metody patří mezi Identifikační
metody → provádíme průkaz (důkazu) analytu =
určujeme přítomnost/nepřítomnost analytu ve vzorku.
Vyšetřovací metody v klinické biochemii
• Laboratorní měření:
• Analýza se provádí v biochemických analyzátorech.
• Vyšetření založeno na snímání fyzikálních nebo chemických veličin pomocí detektorů → laboratorní měření.
• Instrumentální vyšetřovací metody: metody optické (spektrofotometrie v UV-VIS, reflexní fotometrie, atomová
absorpční spektrometrie, luminiscenční spektrometrie, turbidimetrie, nefelometrie), separační (chromatografie,
elektroforéza, hmotnostní spektrometrie, ultracentrifugace), elektrochemické (potenciometrie, amperometrie,
coulometrie, konduktometrie), fyzikální (osmometrie, průtoková cytometrie) a mikroskopické (diaskopická a
episkopická mikroskopie).
• Laboratorní měření kvalitativního charakteru: výsledek měření při hodnocení daného vzorku odpovídá
pozitivní/negativní odezvě detektoru. Např. průkaz mutace genu pomocí metody real-time PCR, v laboratorním
nálezu hodnotíme přítomnost/nepřítomnost mutace.
• Laboratorní měření kvantitativního charakteru: odezva detektoru je v určitém měřícím intervalu úměrná intenzitě
měřené fyzikálně-chemické veličiny (Lambert-Beerův zákon). Máme-li dostatečně velký počet kalibračních standardů,
můžeme jejich analýzou určit závislost měřené veličiny na koncentraci analytu → zisk rovnice kalibrační přímky →
určení koncentrace analytu. Výsledek se vyjadřuje numericky a je opatřen jednotkou (mmol/l, μmol/l, g/l, mg/l,
μkat/l). určujeme koncentraci/množství sledovaného analytu ve vzorku, stanovujeme daný analyt ve vzorku.
• Laboratorní měření semikvantitativního charakteru: pro hodnocení analytu nemáme referenční vzorek (kalibrátor)
→ nejsme schopni definovat rovnici kalibrační křivky. Koncentraci můžeme pouze odhadnout, můžeme říci, jestli je
patologická, fyziologická nebo nízká, střední, vysoká (na základě, zkušeností, spolehlivosti přístrojů a referenčních
vzorků obsahujících známé množství látky o podobných fyzikálně-chemických a biologických vlastnostech jako je
sledovaný analyt). Např. imunochemická analýza benzodiazepinů (přístroj je nakalibrovaný na jedno léčivo ze skupiny
benzodiazepinů a ostatní léčiva této skupiny se vyšetřují s nižší spolehlivostí.
Zdroje:
• BERÁNEK, Martin a Miloš TICHÝ. Vybrané kapitoly z klinické
biochemie: pro studijní program Zdravotnická bioanalytika. Praha:
Karolinum, 2013. ISBN 978-80-246-2186-9.
• RACEK, Jaroslav. Klinická biochemie. 2., přeprac. vyd. Praha: Galén,
c2006. ISBN 80-726-2324-9.
• http://lekarske.slovniky.cz/pojem/patobiochemie
• https://cs.wikipedia.org/wiki/Klinická_biochemie