Mgr. Marie Brázdová, Ph.D. Mgr. Zuzana Bábková SDS-PAGE elektroforéza Barvení Western bloting Imunodetekce proteinů Patobiochemie 1. a 2. cvičení Školení o bezpečnosti a ochraně zdraví a požární ochraně Elektroforetické techniky 1.Elektroforéza proteinů v přítomnosti SDS (SDS-PAGE elektroforéza) 2. 2.Barvení 3. 3. 3.Přenos proteinů na membránu (bloting) 4. 4. 4.Imunodetekce proteinů na membráně Gelová elektroforéza • Historicky první byla elektroforéza na škrobovém gelu (nebo parciálně hydrolyzovaný škrob), nyní podle účelu preferován polyakrylamidový nebo agarosový gel. • • Při přípravě gelu je možné ovlivňovat stupeň polymerace (zesíťování) - tedy velikost pórů. U gelů s velmi velkými póry lze docílit stavu podobnému volné elektroforézy v roztoku, u malých pórů se uplatňuje efekt gelové filtrace. 1.Využívá schopnosti nabitých částic pohybovat se v elektrickém poli. 2.Rychlost pohybu částic je závislá na velikosti náboje a velikosti molekuly. 3.Různě velké a různě nabité molekuly se pohybují odlišnou rychlostí. Použití •pro účely analytické i preparativní •k separaci velkých molekul (proteiny nebo nukleové kyseliny) •k separaci menších nabitých molekul (cukry, peptidy, nukleotidy) Faktory ovlivňující pohyblivost látky 1.Celkový povrchový náboj 2.Velikost a tvar 3.Koncentrace Princip elektroforézy Dva hlavní typy gelové elektroforézy 1. Nativní gelová (nedenaturační) elektroforéza •Probíhá bez denaturačních činidel. •Proteiny i DNA migrují gelem podle svého celkového náboje, velikosti a tvaru. •Podle velikosti pórů v gelu. • 2. Denaturační elektroforéza •Proteiny jsou denaturovány dodecylsíranem sodným (SDS) a b-merkaptoetanolem (zruší disulfidické vazby). •Pohyblivost závisí na molekulové hmotnosti polypeptidových řetězců. •Vhodná pro analýzu makromolekulárních komplexů. •DNA je denaturována močovinou. obr • Gely tvoří přechod mezi pevným a kapalným stavem, 99% je voda. • • Vytváří se trojrozměrná síť, póry slouží jako molekulové síto. • • Velikost pórů odpovídá velikosti proteinů a nukleových kyselin. q Agaróza (A) - síť tvořená dlouhými cukernými polymery vázanými nekovalentními vodíkovými můstky a hydrofóbními vazbami. Akrylamid (B) – síť monomerů akrylamidu (CH2=CH-CO-NH2) spojených kovalentními příčnými vazbami pomocí N,N´-methylylenbisakrylamidu (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2), vytváří dlouhé řetězce. Gelová elektroforéza •patří mezi nejpraktičtější a nejvýkonnější metody pro dělení makromolekul • •polyakrylamidový gel: •tvořen polymerací akrylamidu a N,N´-methylenbisakrylamidu v pufru, zahájenou volnými radikály. •Ty vzniknou při rozkladu persíranu amonného • •fyzikální vlastnosti gelu a velikost pórů dány podílem polyakrylamidu v gelu a stupněm jeho zesíťování. • •nejčastěji používané koncentrace polyakrylamidu jsou 5-15% (přičemž koncentrace N, N´-methylebisakrylamidu je obvykle 5% celkového množství akrylamidu) Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (PAGE) Polymerace akrylamidu Smísením roztoku monomeru a dimeru (bis-akrylamidu). Pozor jde o látky škodlivé zdraví. Akrylamid je karcinogenní a neurotoxický s kumulativním účinkem. Radikálová polymerace Iniciátorem reakce je persíran amonný (peroxodisulfát ((NH4)2S2O8) a katalyzátorem je N,N,N´,N´-tetramethylendiamin (TEMED). Tyto látky lze ve funkci nahradit riboflavinem za přítomnosti světla a malého množství kyslíku. Inhibitory polymerace jsou kyslík (O2) v nadbytku, látky s SH- skupinami. Koncentrace monomeru ovlivňuje délku řetězců, obsah dimeru stupeň zesíťování. PAGE Gelová ELFO (obyčejné) Diskontinualní gelová ELFO Dělicí gel se překryje asi 1 cm vrstvou startovního gelu o nižším pH než gel dělicí a s velkými póry. Elektrodový pufr musí obsahovat slabou kyselinu, obvykle glycin. SDS-PAGE • koncentrační gel (molekuly proteinu se nedělí ale zakoncentrovávají) • separační gel nativní page, vazba proteinů na DNA… SDS-PAGE Nejčastější elfo separační technika pro proteiny. Provádí se v prostředí 0.1% dodecylsulfátu sodného (laurylsulfát, SDS), anionogenního detergentu. Proteiny v gelu mají uniformní záporný náboj, pro separci je důležitá jen jejich velikost. Vzorek proteinu se zpracuje s tzv. vzorkovým pufrem („sample buffer“), který mimo SDS obsahuje i redukční činidlo dithiothreitol nebo β-merkaptoethanol. Působením těchto látek dojde k rozrušení kvarterní, terciární a do značné míry i sekundární struktury. Lineární závislost (se záp. směrnicí) mezi log molekulové hmotnosti a elektroforetickou mobilitou (10 - 200 kDa). Pro vlastní odhad molekulové hmotnosti neznámého proteinového vzorku se používají komerční směsi proteinů - standardy. SDS • vzorek nanášen v denaturované formě, možnost nativních struktur je téměř vyloučena • • chlazení vhodné pouze z důvodu zachování ostrosti bendů a pevnosti gelu (teplo, vznikající při elfo, zvyšuje difuzi) • • možnost použití hmotnostních standardů – rychlost pohybu proteinu zde závisí POUZE na jeho velikosti BioRad_Mini-PROTEAN_II_Tank Barvení proteinových gelů Pro vizualizaci separovaných proteinů se používají dvě techniky barvení, které se liší citlivostí a náročností provedení: Modré barvivo Coomassie Brilliant Blue (G-250, R-250), barvení se provádí v kyselém prostředí (7% k. octová). Protein je tak fixován v gelové struktuře a positivně nabit, což umožňuje vazbu barviva, které se váže i hydrofobními interakcemi. Citlivost 0,1 mg. Odbarvování roztokem methanolu a kyseliny octové (koncentrace dle požadované rychlosti odbarvování). Tzv. koloidní barvení se provádí 0.08% CBB v prostředí 8% síranu amonného, 1.6% k. fosforečné a 20% (v/v) methanolu. Obdobné použití má barvivo Coomassie Violet R-150, které se používá v prostředí 10% kyseliny fosforečné. Odbarvování se děje 3% k. fosforečnou. Coomassie Brilliant Blue R-250 a Coomassie Violet R-150 coomassie_forms basic (arginine) and aromatic amino acids residues (Compton and Jones 1985). The protein-dye complex causes a shift in the absorption maximum of the dye from 465 nm (red) to 595 nm (blue) Western blot (imunoblot) Technika na bázi elektroforézy a enzymové reakce 1. fáze: klasická SDS-PAGE Antigen nanesen do polyakrylamidového gelu a separován v elektrickém poli dle molekulární hmotnosti proteinů antigenu. 2. fáze: blotování Gel z elektroforézy se následně přiloží na nitrocelulózovou membránu. Na blotovacím zařízení dojde působením elektrického proudu k přeblotování proteinů z gelu do membrány. Na membráně vznikne jakoby „kopie“ proteinů separovaných na gelu. image Western blot (imunoblot) Imunodetekce proteinů Výsledek obrázku pro imunodetekce proteinů Imunodetekce proteinů •Detekci proteinů provádíme imunochemickými metodami •Postup •vysycení volných vazebných míst •inkubace v primární protilátce (silná specificita vůči studovanému proteinu) •promytí •inkubace v sekundární protilátce konjugované s enzymem (druhově specifická – dle druhu organismu, ve kterém byla produkována) •promytí •imunodetekce – • • Výsledek obrázku pro protein immunodetection •Imunochemická detekce - využití reakce antigen-protilátka • •Antigeny jsou látky, které organismus rozpoznává jako cizorodé. •Jejich přítomnost stimuluje tvorbu protilátek. • •Každý antigen obsahuje antigenní determinanty (epitopy) tvořené 5-8 aminokyselinami. •Schopnost protilátek rozlišovat i malé rozdíly epitopů je základem specifity imunitních reakcí. • Imunodetekce proteinů •Protilátky patří mezi imunoglobuliny a jsou produkovány jako součást imunitní odpovědi. •třídy: IgG, IgM, IgA, IgE a IgD • •Protilátky jsou charakterizovány •afinitou •síla vazby protilátky s jednou vazebnou determinantou antigenu •aviditou •síla vazby mezi protilátkou a celou molekulou antigenu (většina antigenů je multivalentních, tzn. má více vazebných determinant pro různé protilátky) •specifitou •protilátky jeví minimální interferenci s látkami, pro které není protilátka určena • •Protilátky mohou být polyklonální či monoklonální. • Imunodetekce proteinů •Polyklonální protilátky se připravují imunizací zvířat, kdy se zvířeti aplikuje příslušný antigen. •Polyklonální protilátka může obecně reagovat s několika antigenními determinantami. •Výhodou je vyšší citlivost a avidita. •Nevýhodou je individuální imunitní odpověď a tedy i nereprodukovatelnost. • •Monoklonální protilátky nejsou produkovány organismem, ale buněčnou kulturou. •Myš je imunizována antigenem, následně se ze sleziny získají lymfocyty produkující protilátky. Klonováním lze vybrat buňky, které produkují protilátky proti konkrétní antigenní determinantě antigenu. Takto syntetizovaná protilátka obsahuje jediný typ vazebného místa, a tedy rozeznává jedinou antigenní determinantu. Monoklonální protilátky se vyznačují vyšší čistotou a specifitou, jsou reprodukovatelné, mají však nižší afinitu. • • Imunodetekce proteinů •specifické primární protilátky proti tomuto proteinu •DO1, která specificky rozpoznává N-konec přirozené i mutantní formy proteinu p53. Jedná se o myší monoklonální protilátku třídy IgG. • •sekundární protilátky konjugované s reportérovým enzymem. •Sekundární protilátka je produkována imunizací pomocí dané primární protilátky. Imunizace probíhá v jiném druhu hostitelského organismu, než u primární protilátky. V našem případě byla protilátka DO1 produkována myší, proto sekundární polyklonální protilátka (anti-mouse IgG) byla produkována kozou, které byla injikována primární protilátka. – •Sekundární protilátka se tedy váže na primární protilátku a je konjugována s reportérovým enzymem umožňujícím detekci, v našem případě křenovou peroxidázou a alkalická fosfatáza. • Imunodetekce proteinů d_45_1_01 Imunodetekce proteinů Imunodetekce proteinů Děkuji za pozornost 1. část Vzorek A 1. neředěný 2. 10 × zředěný (1 μl z neředěného vzorku + 9 μl deionizované vody) 3. 100 × zředěný (1 μl 10 × naředěného vzorku + 9 μl deionizované vody) IMG_20190212_075717_1.jpg IMG_20190212_081046.jpg 1. 2. 3. 2. část •Stanovení koncentrace celkových bílkovin ve vzorku séra pomocí automatizovaného fotometrického analyzátoru BS 200