Fyzikálně-chemické vlastnosti látek MBDD 22.2.2018 ADME : Absorpce – Distribuce – Metabolismus – Exckrece Screening ADME vlastností je stejně důležité jako screening biologické aktivity látek. Velké farmaeutické firmy jsou schopny za rok otestovat více než 3 000 000 nových molekul na biologickou aktivitu. Přibližně 30 000 prokáže dobrou aktivitu. Většina z nich, jakkoliv jsou účinné, nemá potřebné vlastnosti z hlediska fyzikálního, metabolického nebo toxikologického. Přibližně 30 z nich projde do fáze klinického hodnocení. 0 - 3 z nich jsou pak uvedeny na trh jako léčiva. Přibližně 30% farmakologických testování je zastaveno kvůli problémům s ADME. „A“ z ADME (Absorpce) vlastnosti ovlivňující absorpci: acido-basický charakter lipopfilita rozpustnost membránová permeabilita Transportní model: permeabilita – rozpustnost - ionizace – pH-rozdělovací hypotéza Pasivní difuze: důsledek difuzivity a koncentračního gradientu Ionizovatelné molekuly musí být při permeaci v neionizovaném stavu. Množství neionizované formy je závislé na pH. Cm 0, Cm h : koncentrace neionizované formy v membráně (těžko se dá stanovit) h : tloušťka membrány logK : rozdělovací koeficient lipidy/voda CD, CA : koncentrace neionizované formy ve vodě (jednoduše se stanoví pomocí HPLC) Dm : difuzivita Pm : permeabilita Fyziologické vlastnosti GIT Jejunum + ileum > 99% povrchu absorpce Čas potřebný pro průchod: Prázdný žaludek: vodný roztok 5 - 20 min pevná strava 0,5 - 3 hod tučná strava až 13 hod Jejunum + ileum : 3 - 5 hod Kolon: 7 - 20 hod (záleží na čase spánku) pokles pH v kolonu může být způsoben krátkými mastnými kyselinami produkovanými střevní mikroflórou Intestine -glycocalyx zpomaluje absorpci lipofilních molekul -zonula occludens (tight junction) umožňuje volný průchod malým molekulám (< 200 Da) -pozitivně nabité molekuly mají lepší permeabilitu přes bazální membránu -kyselé pH mikroklima v mukózní vrstvě usnadňujě permeaci slabých kyselin pH nitrobuněčných struktur: Structura oktanolu. Oktanol slouží dlouhá léta jako model membrány Oktanol nasycený vodou: klastry oktanol-voda umožňují vstup i hydrofilních látek, dokonce i malému množství látek ionizovaných Klasifikační systém biofarmaceutik (BCS) Čtyři třídy BCS podle rozpustnosti a permeability Pro klasifikaci platí: Rozpustnost je množství vody potřebné k rozpuštění nejvyšší jednotlivou dávku při takovém pH v rozmezí (1-8), při kterém je rozpustnost látky nejhorší: nízká s > 250 ml > vysoká s Permeabilita je stanovována v lidském jejunu in vivo vysoká > 10-4 > nízká Biopharmaceutics classification system (BCS) Ionizace Slabé kyseliny a zásady se v roztocích ionizují pouze z části v závislosti na pH prostředí. pH prostředí tedy určuje množství neionizované formy potřebné pro absorpci. Termodynamickým parametrem tohoto procesu je disociační konstanta KA (pKA). Znalost pKA látky je velice důležitá – pomůže předvídat chování látky v procesech absorpce, distribuce i exkrece. Ionizace Příklad pH moče (normálně 5,7-5,8) může být jednoduše změněno perorálním podáním NH4Cl nebo NaHCO3 k usnadnění exkrece ionizovatelných látek v případě intoxikace. Slabé kyseliny jsou extrahovány do zásadité moče, slabé zásady do kyselé moče. Henderson-Hasselbachova rovnice termodynamické rovnováhy pro slabé kyseliny, baze a diprotický amfolyt: negativním zlogaritmováním získáme HendersonHasselbachovy rovnice: Henderson-Hasselbachovy rovnice pH = pKA : koncentrace ionizované a neionizované formy je stejná pH = pKA – 2 : poměr (1:100) 99,9% neionizováno pH = pKA + 2 : poměr (100:1) 99,9% ionizováno Konstantní iontové prostředí pro stanovení Iontová síla roztoku ovlivňuje míru disociace. Stanovování pKA musí proto probíhat ve standardizovaném prostředí: 0,15 M roztok KCl nebo NaCl jsou výhodné pro predikci chování v organismu (fyziologické podmínky) Potentiometrické měření Titrace vodného roztoku s přídavkem 0,15 M KCl nebo NaCl standardním roztokem HCl nebo KOH/NaOH Je vytvořena potenciometrická titrační křivka. V případě multiprotických látek může být ale analýza titrační křivky zavádějící! Musí být provedena Bjerrumova analýza: Postup Bjerrumovy analýzy: Postup Bjerrumovy analýzy: 1. Vytvoří se křivka vzniklá odečtením titrační křivky bez vzorku (blank) od titrační křivky se vzorkem (b) 2. obrátí se osy x za y (c) 3. Spotřeba se převede na poměr ionizovatelných vodíků (počet odvodíme od struktury): Provede se diference mezi celkovým počtem ionizovatelných vodíků a aktuálně ionizovaných vodíků. Rovnovážný stav vždy mezi dvěma vodíky odpovídá příslušné hodnotě pKA (d) Problémy s rozpustností: Mnoho biologicky aktivních látek je velmi špatně rozpustných ve vodě. > 100 µM: žádné problémy při potentiometrii 10 – 100 µM: lze měřit pouze pokud je elektroda vekmi pečlivě nakalibrována < 10 µM: je nutno použít prostředí směsi rozpouštědel Směsi organické rozpoštědlo-voda: alkohol - voda (methanol, ethanol, propanol) dimethylsulfoxid (DMSO) – voda dioxan – voda Naměřené hodnoty ve směsi můžeme extrapolovat na hodnoty v samotné vodě pomocí strukturně podobných standardů Spectroscopická stanovení (UV-VIS): nutný chromofor spojený s ionizovatelnými skupinami vynesou se křivky závislosti molární absorbance na pH v širokém spektru vlnových délek je potřeba najít vlnové délky při kterých se projeví změna absorbance nejvíce pro každou látku je potřeba vyvinout specifickou metodu Kapilární elektroforéza mobilita ionizovatelných látek závisí na pKA sestrojí se křivky závislosti změřené mobility na pH křivky mají sigmoideální tvar, hodnota pH v inflexním bodě odpovídá pKA Makrokonstanty / mikrokonstanty Některé multiprotické molekuly umožňují více tautomerních možností uspořádání struktury se stejným stupněm ionizace. Změřené hodnoty pKA jsou pak průměrné hodnoty několika hodnot dílčích procesů – jsou to makrokonstanty. Mikrokonstanty mohou být stanoveny porovnáním mnoha sérií měření v různých směsích rozpouštědel (přídavkem kosolventu se posouvá každá pKA o různou hodnotu) a UV-VIS detekcí změn chromoforů. Makrokonstanty / mikrokonstanty (cetirizin) Rozdělování do oktanolu P – rozdělovací koeficient D – skutečný rozdělovací koeficient (distribuční koeficient (závisí na pH) Partitioning equilibria: látky, které se neionizují, mohou být jednoduše přímo stanoveny Rozdělování do oktanolu ionizovatelné molekuly se rozdělí také, avšak v mnohem menším měřítku: Rozdělování do oktanolu: Propranolol Rozdělování do oktanolu Rozdíly mezi ionizovanou a neiozovanou formou: Rozdíl mezi jednotlivými rozdělovacími koeficienty je roven rozdílu mezi jednotlivými pKA logD Distribuční koeficient D se užívá pro ionizovatelné molekuly refers to a collection of all species: profily lipofility: Vytřepávací metoda koncentrace je stanovena ve vodné fázi (HPLC) HPLC metody retenční čas při použití hydrofobní kolony a vodného pufru jako mobilní fáze je úměrný lipofilitě hodnoty logP mohou být vypočteny z retenčních časů s použitím standardů (strukturně podobných látek se známým logP) metoda založená na stanovení pKA titrace látky v obou fázích dohromady Bjerrumova analýza je vytvořena pro potenciometrické křivky pro oktanol/vodu a samotnou vodu zvlášť Rozdíl mezi pKa ve vodě a změřenou pKa ve směsi je rovna rozdělovacímu koeficientu pH metrické stanovení hydrofilní / lipofilní látka Rozdělování do liposomů liposomy jsou podobnější skutečné membráně rozdělení mezi membránu a vodné prostředí Rozdělování do liposomů Rozdělování do liposomů Změny dielektrických vlastností fosfolipidové vrstvy Rozdělování do liposomů Liposomy jsou přidány do definovaného roztoku látky po ustálení rovnováhy jsou liposomy odstraněny: dialýzou ultrafiltrací centrifugací Množství, které zůstalo ve vodné fázi je stanoveno Rozdělování do liposomů rozdělování do liposomů může být také odvozeno od hodnot logP složitým matematickým procesem Rozdělování do liposomů složitá nelineární závislost Rozpustnost Rozpustnost ionizovatelných látek závisí na pKa monoprotické látky: diprotický amfolyt: Rozpustnost mnoho experimentálních problémů: krystalická/amorfní forma amorfie polymorfismus pevné solváty krystalové kosolventy tvorba agregátů v roztoku tvorba micel u povrchově aktivních látek Vytřepávací metoda termostatovaný nasycený roztok je protřepáván mezi fázemi (pevná/roztok) dlouhý čas ustavení rovnováhy (12h – 7 dní) koncentrace ve vodní fázi je stanovena HPLC po mikrofiltraci a centrifugaci (oddělení pevné fáze) Membránová permeabilita V nejjednopdušším modelu můžeme permeabilitu lineárně odvodit od rozdělovacího koeficientu membrána-voda v praxi se často objevuje nelinearita: -nepromíchaná vodní vrstva -hydrofilní póry v membráně -zadržení lipofilních látek uvnitř membrány -mikrokrystalické srážení uvnitř membrány -gradient pH uvnitř membrány -vodíkové vazby, elektrostatické a hydrofobní interakce mezi látkou a složkami membrány -náboj na povrchu membrány Membránová permeabilita další problémy in vivo: -rozdílné složení vnitřní a vnější vrstvy membránové dvouvrstvy -aktivní transportéry -efluxní systémy P-gp -aktivní enzymy v membráně – možnost metabolizace látky během permeace Modely s umělou membránou Paralelní testování na umělé membráně (Paralell artificial-membrane permeability assay - PAMPA) -sendvičové mikrodestičky pokryté fosfolipidovou membránou -složení fosfolipidů blízké skutečné membráně -umožňuje high-throughoutput screening Modely s buněčnou vrstvou permeace přes jednobuněčné vrstvy, např. kultivovaných caco-2 epiteliálních buněk