upravil a přeložil Tomáš Goněc podle:
Barrie Martin, AstraZeneca R&D Charnwood
Chemistry, Lecture 3: Molecular interactions and drug potency
Interakce protein - léčivo
Závislost účinku na dávce
(kompetitivní) inhibitory enzymu:
Měří se míra inhibice při různých
koncentracích látky.
10nM 30nM 100nM 300nM 1mM
%
Inhibice
0
50
100
IC50=85nM
[Inhibitor]
IC50 - Koncentrace inhibitoru, která způsobí
50% snížení vnitřní aktivity enzymu
pIC50 = - log10(IC50)
IC50 1mM = pIC50 6.0
IC50 1nM = pIC50 9.0
Agonisté: Měření % odpovědi při různých koncentracích agonisty
EC50 – Koncentrace agonisty, která způsobí 50% maximální odpovědi. pEC50 = - log10(EC50)
Pro léčivo je typická cílová aktivita pIC50  8 (odpovídá koncentraci <10 nM)
[agonista]
%
max.
aktivity
EC50=85nM
Antagonisté: Situace je daleko složitější. Antagonisté posouvají nějakým způsobem křivku závislosti
odpovědi na koncentraci agonisty doprava – nejužitečnější je proto měření afinity (pA2) – měří se
množství navázaného agonisty při různých koncentracích antagonisty.
Problematické u ireverzibilních antagonistů a u parciálních agonistů (antagonistů s vnitřní aktivitou)
iNOS – Výzkumný projekt AZ Charnwood
Aktivní místo
Hem & inhibitor
NH2
NH
NH2
NH
O
OH
NH2
NH
NH2
O
O
OH
iNOS
+ NO
NO syntetasa – katalyzuje uvolňování oxidu
dusnatého z argininu v tkáních – způsobuje
vazodilataci a otoky při zánětlivých
onemocněních, např. revmatoidní artritidě
N
N
N
O
N
N
NH2
F
F
AZ10896372
pIC50 7,5
Účinný selektivní inhibitor iNOS
vyvinutý Astra Zeneca Charnwood
Jak se léčiva váží na enzymy a receptory?
Léčiva se váží na konkrétní místa enzymů a receptorů. V případě enzymů je to nejčastěji
aktivní místo. Receptory mají vazebná místa tvořená transmembránovými doménami,
kam se většinou léčiva váží (ne vždy je totožné místo pro vazbu agonisty a antagonisty).
Tato místa jsou tvořena množstvím různých
aminokyselin, které vytvářejí specifický 3-D
tvar a fyzikální vlastnosti místa:
• Náboje: CO2
- , NH3
+, =NH-+
• Polární skupiny: OH, C=O, CONH
• Hydrofobní skupiny: fenyl, alkyl, SMe
U enzymů jsou přítomna některá typická aktivní centra, např.:
• Asp-His-Ser v esterasách
• SH v některých proteasách
• kovové ionty (CYP-450, iNOS).
N
H
O
N
H
N
H
O
O
O O
O
SER S
GLU E PHE F
N N
NN
Fe
CO2H
HO2C
Haem group – iNOS, CYP-450
Malé molekuly vážící se na tato místa musí splňovat obě
vlastnosti:
• komplementarita tvaru molekuly a vazebného místa
• energeticky výhodné vazebné interakce vyvolávající
účinek
Komplementarita tvaru
NH
N
S
N
H
N
H
CN
NH
N
NH2
Cimetidin
Histamin
Antagonisté H2 receptorůInhibitor iNOS
AZ10896372
Arginin
N
N
+
N
H
NH2
F
F
H
O
N
N
NH2 N
+
NH2
H
NH3+
O
O
Molekula léčiva musí pasovat na vazebné místo a komplementarita tvaru je důležitou vlastností
molekuly. Kompetitivní inhibitory často připomínají strukturu substrátu enzymu, protože se váží na
stejné aktivní centrum. Toto platí i pro antagonisty vážící se na stejné místo jako agonista. Většina
antagonistů se však váže na jiné místo receptoru než agonista a může mít proto zcela odlišnou
strukturu.
Síla interakce závisí na komplementaritě fyzikálně chemických vlastností funkčních skupin, které
jsou v těsné blízkosti, tj. povrchu proteinu a struktury ligandu.
Vazebná místa nejsou zcela rigidní. Postranní řetězce aminokyselin tvořící vazebné místo mají
určitou mobilitu. Velké množství podobných struktur může stejně dobře pasovat do místa, což je
dáno drobnými změnami tvaru aktivního místa. Tuto schopnost vysvětlujeme hypotézou
„indukované komplementarity“.
Vazebné energie protein-léčivo
K = [P:L]
[P] x [L]
Změna entalpie (DH) tak i entropie (DS) ovlivňují sílu vazby
DG=-RTlnK and DG=DH-TDS
Změna Gibbsovy volné energie
[Protein] + [Léčivo] [P:L]
K
Pro vazebnou rovnováhu mezi Proteinem a Léčivem
DG
Léčivo ProteinLéčivoProtein
Když se léčivo dostává z vodního prostředí do vazebného místa, musí zpřetrhat
H-vazby s vodou, desolvatovat se atd. Tyto procesy vyžadují energii, proto může
být čistá vazebná energie pouze zlomkem výše uvedených vazebných energií.
Interakce protein - léčivo
Vazba Příklad kJ/mol
Van der Waal Xe…Xe, alkylové skupiny 2
Hydrofobní Ph…Ph (p-interakce) 5
Dipól - Dipól C=O…HN-R (d+/d-)...(d+/d-) 5
Vodíková H2O…H2O (X-H) …(Y-R) 35
Ion - Dipól F-…H2O (+/-ve)…(d+/d-) 170
Ion - Ion H+…Cl- (+ve)…(-ve) 450
Kovalentní C-O 350
Electrostatické interakce
• Výsledkem přitažlivosti mezi dvěma molekulami s opačnými náboji.
• Silné iontové interakce mohou mít velký podíl na celkové síle vazby.
• Proteiny obsahují jak CO2
- tak NH3
+ zbytky, a ty mohou být přítomny
v aktivních místech a interagovat s opačně nabitými skupinami léčiva.
Inhibitor neuraminidasy (Antivirotikum)
O
O
OOH
OH
OH
R
R
N
N
N
H
H
H
H H
ARG
-
+
AZ-10896372 inhibitor iNOS
N
N
N
H
O
N
N
F
H
+
N
H H
O
O
GLU
F
• Energie iontových vazeb může být v řádech >30 kJ/mol
• Můžou vést ke zvýšení afinity až o >106 násobek
Vodíkové vazby
Vodíková vazba vzniká pokud je vodík mezi dvěma silně elektronegativními atomy:
Donor má navázaný vodík, Akceptor má volný nevazebný elektronový pár
D-X-H….Y-A např. R-O-H…..O=C
N
N
N
O
N
N
F
H
+
N
H H
O
H
N
H
O
N
H
H
O
H
H
O
OH
OOH
O
O
R
R
H
HO
O
GLU
AZ10896372 - iNOS komplex
amid-tyrosin H-vazba
Inhibitor neuraminidasy
vodíková vazba zesílená nábojem
Hydrofobní interakce
• Léčiva obecně jsou většinou hydrofobní molekuly
• Vazebná místa mají v rámci proteinu také obecně hydrofobní charakter
• Z toho plyne určitá přirozená přitažlivost mezi jakýmkoliv léčivem
a jakýmkoliv vazebným místem
• Co je důvodem této přitažlivosti?
• Každá -(CH2)- skupina může přispět >1 kJ/mol k celkové vazbě
• Každý fenyl / heteroaryl / násobné vazby může přispět >2 kJ/mol k
celkové vazbě
• Tyto efekty se sčítají a proto mohou být hydrofobní interakce
rozhodující složkou celkové vazebné energie
• Přírůstek entropie je tvořen vytlačením molekul vody z aktivního
místa a jejich návratu do více náhodného stavu ve vnějším
prostředí.
• Přírůstek entalpie může být tvořen van der Waalsovými vazbami:
• mezi alkyly, aryly, halogeny
• p-p interakce jsou velmi důležité (silnější než výše uvedené)
Hydrofobní interakce : D Entropie
Molekuly vody jsou
ve vysoce neuspořádaném
stavu. Každá molekula
maximalizuje počet
H-vazeb k ostatním
molekulám
Pokud je hydrofobní léčivo
umístěno do vody,
struktura vody v jeho okolí
se stane více uspořádanou.
Vazby H2O-H2O sice zůstanou
zachovány, ale v blízkosti látky
se omezí pohyblivost molekul H2O.
To vede ke snížení entropie
a je energeticky méně výhodné.
Hydrofobní interakce : D Entropie
D E
• Hydrofobní interakce mezi proteinem a léčivem je energeticky preferována
přírůstkem entropie:
• Voda v okolí se vypuzením léčiva vrátí do méně uspořádaného stavu
• Molekuly vody jsou vypuzeny z aktivního místa
• Navíc je tu nárůst entalpie vznikem nových vazeb (např van der
Waalsovy interakce)
DE
Optimalizace hydrofobicity
ve vývoji léčiv
NH
N
H
NH2
R
F
F
Nový iNOS inhibitor R =Me, malý lipofilní substituent iNOS pIC50 7.8
Cíl: vyzkoušet velikost lipofilní kapsy – co jiného se sem vejde?
Syntetizována série analogů:
NH2
NH2
NHF
F
R
O
Vliv hydrofobicity na aktivitu
Vazba do lipofilní kapsy iNOS
NH
N
H
NH2
R
F
F R cLogP IC50 mM
Me 1.13 0.016
Et 1.66 0.009
CF3 1.75 0.008
Thiofen 2.02 0.003
Fenyl 2.34 0.015
2-Me-thiofen 2.48 0.026
cLogP
7.6
7.8
8
8.2
8.4
8.6
1
1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6
iNOS_pIC50
Moc objemné, nevejdou se
(komplementarita tvaru)
Bioisostery
Isoster:
Podobnosti ve fyzikálně-chemických vlastnostech atomů / funkčních skupin / molekul s podobným
elektronovým uspořádáním (počet a uspořádání elektronů valenčních vrstev). Často mezi prvky
stejné skupiny (Cl  Br, C  Si).
Grimmovo pravidlo záměny hydridů (1925) -
Bioisostery:
Nejjednodušší definice – jakákoliv skupina se stejným typem vazby na protein
Dvě zaměnitelné funkční skupiny zachovávající biologickou aktivitu.
Bioisosterní záměna často vede ke zlepšení jak v účinku tak v jiných vlastnostech molekuly (např.
metabolická stabilita, absorpce....)
O
O N
N
NN N
O
S O
O
--
karboxylová skupina a bioisostery
O S
O
N
H
N
H
N
N
S
N
H
O O
-CH2 & bioisostery
amid & bioisostery
C N O F Ne Na+
CH NH OH FH
CH2 NH2 OH2 FH2
+
CH3 NH3 NH4+
„neviditelné“ isostery
N
N
MeO
MeO
NH Br
N
MeO
MeO
NH Br
N
EGF-R 2.2 nM EGF-R 7.5 nM
N
MeO
MeO
NH
Br
N
H
O
Me
NH
O
N
N
HMeO
MeO
NH
Br
H O
H
H O
Me NH
O
Vodíkové vazby mohou vznikat prostřednictvím molekuly vody nebo přímo
Optimalizace účinku
N
N
N
NH2
F
F
O
N
N
Potřeba poznat, které části molekuly jsou nezbytné pro účinek
– postupné odstranění substituentů.
Prozkoumat, kam by se daly zavést další skupiny zvyšující
účinek tvorbou hydrofobních interakcí nebo vodíkových vazeb.
Nahrazovat nezbytné funkční skupiny bioisostery.
Při plánování použít dostupné informace o struktuře vazebného
místa – např. krystalovou strukturu aktivní látky navázané na
protein.
Použít modelování k vývoji a předběžnému potvrzení možných
modifikací struktur.
Syntetizovat navržená analoga a experimentálně potvrdit
hypotézy.
Vyvinout vhodný syntetický postup umožňující rychlou syntézu
celé řady rozdílných analogů – vytvoření co největší série.
pIC50 7.5
Nezapomenout vzít v potaz spoustu dalších vlastností, které ovlivní změna
struktury – absorpci, metabolismus, toxicitu, rozpustnost atd.
Jak může být zvýšena účinnost této molekuly?
NH2
F
F NH2
NH
N
O
O
OEt
NN
H
F
F NH2
NH
OH
OEt
O
N
+
F
F NH
NH2
N
OEt
O
N
N
F
F NH
NH
OEt
O
N
N
F
F NH2
N
OEt
O
Tautomerism
Následná syntéza - 1
NH2
F
F
N
NH2
F
F NH
NH
OH
NH2
F
F NH2
NH
N
O
O
OEt N
N
H
F
F NH2
N
O
OEt
i, NH2OH, NaOMe,
methanol, reflux
ii, H2, Raney Ni,
ethanol, 60C
iii, ethanol,
reflux
Následná syntéza - 2
N
N
H
F
F NH2
N
O
OEt
NH
N
H
F
F NH2
N
N
N
H
F
F NH2
N
O
N
N
OH
O
N
N
iv, NaOH, H2O,
EtOH, D
v, (COCl)2, CH2Cl2,
then amine, NEt3, CH2Cl2