Mezibuněčná komunikace a interakce buněk imunitního systému Základy buněčné signalizace i. díl Povrchové receptory li. díl Cytokiny Lipidové mediatory zánětu Lukáš Kubala kubalal@ibp.cz Mezibuněčná komunikace a interakce buněk- buněčná signalizace Buňky komunikují s okolím prostřednictvím receptorů na membráně, které rozpoznávají extracelulárně přítomné molekuly- ligandy. w cell-surface receptors plasma membrane cell-surface receptor protein Ligandy mohou být: hydrophilic signál • rozpustné (např. cytokiny) mo,eajle • nerozpustné (např. struktury na površích jiných buněk nebo mezibuněčné hmoty) Í3j INTRACELLULAR RECEPTORS Další způsoby - např. signální molekuly přecházející přes cytoplasmatickou membránu mají receptory v cytosolu/jádře. carrier protein small, hydrophobic ^/signal molecule target nucleus intracellular receptor protein http://reasonandscience.heavenforum.org/t2181-cell-communication-and-signaling-evidence-of-design Buněčná signalizace přes membránově vázaný receptor - obecně extracellular signal molecule receptor protein plasma membrane of target cell intracellular signaling proteins + druzí poslové - malé molekuly produkované enzymatickými reakcemi nebo uvolňovány iontovými kanály effector proteins metabolic transcription cytosketetal enzyme regulatory protein protein i i altered metabolism altered gene expression altered cell shape or movement Figure 15-1 Molecular Biology of the Cell 6e (© Garland Science 2015) Základní mechanismy intracelulárního přenosu signálu u buněk imunitního systému Typy reversibilních změn zajištujících přenos signálu 1. Změna proteinové konformace 2. Fosforylace / defosforylace proteinů 3. Záměna GDP za GTP Základní typy přenosu signálu u buněk imunitního systému 1. Receptory spřažené s enzymy nebo přímo s enzymovou funkcí (Proteinové kinázy jako součást receptoru nebo jako asociované s receptory) 2. Receptory spřažené s G-proteiny 3. Receptory typu iontových kanálů Figure 15-1 Molecular Biology of the Cell 6e (© Garland Science 2015) Protein kinázy Protein kinázy (PK) jsou aktivovány vazbou ligandu na receptor. Následně pak aktivují další intracelulární signální dráhy. Vztah mezi receptory a PK: A) v cytoplasmatické části receptoru je přímo doména s PK aktivitou B) intracelulární domény receptoru jsou asociovány s cytoplasmatickými PK Fosforylace - navázání fosfátové skupiny díky aktivitě specifických PK; může být jak aktivační, tak inhibiční Defosforylace - odštěpení fosfátové skupiny pomocí specifických fosfatáz; může být jak aktivační, tak inhibičn PK a význam fosforylace v přenosu signálů protein kináza serinový, threoninový protein fosforylovaný protein fosfatáza G-proteiny INACTIVE MONOMERIC GTPase ACTIVE MONOMERIC GTPase Figure 15-3 Molecjlar Bio logy of the tell 6t\&Garland science 2015) Video Vápníkové ionty v signálních kaskádách Důležitým principem v buněčném signálování je změna intracelulární koncentrace Ca2+. Působením druhých poslů, hlavně inositoltrifosfátu (IP3), dochází k otevírání iontových kanálů a zvýšení koncentrace Ca2+. Ca2+ se váží na protein kalmodulin. Vazbou Ca2+ dochází ke změně konformace kalmodulinu a vytvoření aktivního místa (centra) pro vazbu substrátu. Celý komplex kalmodulin/Ca2+ se váže na regulační proteiny (např. fosfatáza calcineurin) a mění jejich aktivitu. Aktivace proteinu Přenos signálu přes membránu zprostředkovaný vápníkovými ionty Fosfolipáza C gamma (PLC-y) štěpí fosfatidylinositol bisfosfát (PIP2) na diacylglycerol (DAG) a IP3. IP3 otevírá vápníkové kanály uvolňující Ca2+ z endoplasmatického retikula a extracelulárního prostoru. Ca2+ aktivuje kalmodulin. DAG aktivuje PKC. Lumen of endoplasmic o reticulum Extracellular fluid o Figure 6-5 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Video Vybrané typy povrchových receptoru buněk imunitního systému podle funkce 1. Imunoreceptory- receptory lymfocytů, NK buněk a žírnych buněk 2. Receptory prezentující antigen (MHC receptory) 3. Fas receptory 4. Receptory rozpoznávající struktury charakteristické pro patogeny a poškozené buňky (PRR, „Pattern Recognition Receptors") 5. Adheziny - adherence a migrace buněk • Integriny Dalsi • Selektiny přednáška • Adheziny patřící do velké rodiny imunoglobulinů • Cadheriny • Mucinové receptory Imunoreceptory Struktura a funkce: • multiproteinové komplexy klonálně variabilních řetězců vážících antigén (TCR a BCR) nebo protilátku (FcR) a invariantních přídavných řetězců zajišťujících signální funkce TCR (T lymfocyty) BCR (B lymfocyty) FcsRI (žírné buňky) Fc Rlll (NK buňky) Iga/lgp 0 ITAM („Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif') - funkčně důležité tyrosiny Průběh signalizace u imunoreceptorů s PK asociovanými s receptory vazba ligandu na imunoreceptor (TCR, BCR, FcR) i migrace receptoru do lipidových raftů a jejich agregace i zvýšení aktivity asociovaných PK (u antigenních receptoru se jedná o rodinu tyrosinových kináz Src) i fosforylace ITAM a následná aktivace dalších signálních drah v buňce i změna transkripce genů, stavby cytoskeletu, sekrece látek atd. i defosforylace signální molekuly protein fosfatázami => návrat do původního stavu Membránové lipidové rafty Lipidové rafty jsou nezbytné pro signálovém TCR, BCR a FcR. Jde o specializované regiony buněčných membrán bohaté na nasycené lipidy a cholesterol. Hojně se zde vyskytují proteiny vázající glykosylfosfatidylinositol (GPI) a PK (např. Src-rodiny). GPI-linked protein saturated phospholipid unsaturated phospholipid receptor Src-family kinase Figure 6-3 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Lipidové rafty velmi dynamicky mění strukturu a obsah proteinů. Některé typy receptoru po navázání ligandu migrují do těchto lipidových raftů a agregují zde. ligand Figure 6-3 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) TCR receptor TCR recognition CD3 G a ©® u© CD3 ITAMs © 0 © D 0 signaling Figure 6-9 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Přenos signálu přes TCR receptor Lek a Fyn jsou tyrosin kinázy ze Src rodiny. ZAP-70 je tyrosin kináza ze Syk rodiny. Navázání recept, na antigén prezentovaný MHC vede k vazbě koreceptoru (molekula CD4) na MHC a indukci fosforylace ITAM kinázami Lek a Fyn. Kináza ZAP-70 se váže na fosforylovaný ITAM a je následně sama fosforylována a aktivována. CD4 antigen-presenting cell MHC class II LAJ TCR CD3 CD3 Lek ZAP-70 T cell Figure 6-12 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Video CD4 Komplexní přehled přenosu signálu z TCR TCR:CD3 complex ZAP-70 /-v CD45 Fyn or Lck phosphorylates tyrosine residues on the CD3< and £ ITAMs, allowing ZAP-70 to bind A Fyn and Lck protein tyrosine kinase clustering activates kinase activity Protein tyrosine phosphatase activates Lck and Fyn Lck activates ZAP-70, which in turn phosphorylates LAT and SLP-76. SLP-76 binds and activates phospholipase C-7 (PLC-yK GEFs. and Tec kinases C PLC-y cleaves phosphatidylinositol bisphosphate (PIP2) to yield diacylglycerol (DAG) and inositol trisphosphate(IP3) J C DAG and Ca2+ activate protein kinase C Protein kinase C activates a transcription factor, NF*B Figure 6-16 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) IP3 increases intracellular Ca2+ concentration, activating a phosphatase, _cajcineyrin_ Calcineurin activates a transcription factor, NFAT (nuclear factor of activated T cells) \7 GEFs activate Ras, which in turn activates a MAP kinase cascade The Ras-induced kinase cascade induces and activates Fos, a component of the AP-1 transcription factor The transcription factors NF*B, NFAT, and AP-1 act to induce specific gene transcription, leading to cell proliferation and differentiation Přenos signálu přes BCR receptor Membránově vázaná IgM (mlg) recognition ■—i— signaling Figure 6-8 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Antigenem indukované shlukování IgM receptoru umožňuje kinázám asociovaným s těmito receptory (Src kinázy) fosforylovat ITAM. (© Garland science 2005) Komplexní přehled přenosu signálu z BCR IgM cross-linked by antigen CD45 Tyrosine kinase (Blk, Fyn, or Lyn) O Receptor cross-linking activates tyrosine kinases Blk, Fyn, and Lyn 3 Syk tyrosine kinase bakteriální sacharidy - lipopolysacharidy (LPS), lipoteichoová kyselina, manóza > bakteriální proteiny a peptidy - flagelin, N-formylmethionine > glukany hub, chitin > nukleové kyseliny - bakteriální DNA (nemethylované CpG dinukleotidy), virová dvouvláknová RNA (dsRNA) 2. Konzervované molekulární vzory asociované s s poškozenými hostitelskými (vlastními) buňkami (DAM Ps „ Damage-associated molecular patterns") • Typické molekuly: > intracelulární proteiny - proteiny tepelného šoku („Heat Shock Proteins", HSP) > komponenty extracelulární matrix - fragmenty hyaluronanu > kyselina močová, ATP, DNA Charakteristika PRR Dělení PRR A. Podle umístění -> membránově vázané a cytoplazmatické B. Podle specifity ligandu PRR membránově vázané (jak na povrchu buňky, tak v endosomech) > Toll-like receptory (TLR) > C-lektinové receptory (CLR) PRR cytoplazmatické > NOD-like receptory (NLR) > RIG-l-like receptory (RLR) Toll-like receptory (TLR) • Poprvé objeveny u drosofil (produkty genu Toll regulují ontogenetický vývoj a obranu). • Podobné struktury identifikovány u vyšších rostlin, u bezobratlých a u obratlovců včetně člověka - u člověka popsáno 10 funkčních členů TLR rodiny. • Typická struktura složená z domén bohatých na leucin => specifický tvar podkovy. • Aktivace TLR: převážně tvorba dimerů - spouští specifické signální dráhy diacyl ^\acy\ lipopeptides Prehled TLR a jejich ligandü Innate immune recognition by mammalian Toll-like receptors Toll-like receptor Ligand Hematopoietic cellular distribution TLR-1:TLR-2 heterodimer Lipomannans (mycobacteria) Lipoproteins (diacyl lipopeptides; triacyl lipopeptides) Lipoteichoic acids (Gram-positive bacteria) Cell-wall |}-glucans (bacteria and fungi) Zymosan (fungi) Monocytes, dendritic cells, mast cells, eosinophils, basophils TLR-2:TLR-6 heterodimer TLR-3 Double-stranded RNA (viruses), poly l:C Macrophages, dendritic cells, intestinal epithelium TLR-4 (plus MD-2 and CD14) LPS Gram-negative bacteria) Hiipefeichoic acids (Gram-positive bacteria) Macrophages, dendritic cells, mast cells, eosinophils TLR-5 Flagellin (bacteria) Intestinal epithelium, macrophages, dendritic cells TLR-7 Single-stranded RNA (viruses) Plasmacytoid dendritic cells, macrophages, eosinophils, B cells TLR-8 Single-stranded RMA (viruses) Macrophages, neutrophils TLR-9 DNA with unmethylated CpG (bacteria and herpesviruses) Plasmacytoid dendritic cells, eosinophils, B cells, basophils TLR-10 (human only) Unknown Plasmacytoid dendritic cells, eosinophils, B cells, basophils TLR-11 (mouse only) Profilin and profilin-like proteins {Toxoplasma gondii, uropathogenic bacteria) Macrophages, dendritic cells (also liver, kidney, and bladder) TLR-12 (mouse only) Profilin {Toxoplasma gondii] Macrophages, dendritic cells (also liver, kidney, bladder) TLR-13 (mouse only) Single-stranded RNA (bacterial ribosomal RNA) Macrophages, dendritic cells Fig. 3.10 Immunobiology, 9/e. (© Garland science 2017) TLR signalizace LBP Příklad: Stimulace buněk pomocí LPS/TLR4 signální dráhy • Rozpoznání LPS vyžaduje interakci i dalších proteinů - LBP, CD14 aj. • Aktivace TLR4 vede k asociaci intracelulárních domén s různými adaptorovými molekulami • Intracelulární signalizace závislá na adaptorové LPS molekule MyD88 vede především k aktivaci MAP-kinázové dráhy a transkripčního faktoru NF-kB => indukce sekrece prozánětlivých cytokinů a kostimulačních molekul. • Signalizace závislá na adaptorové molekule TRIF vede zejména k indukci interferonu a a (3. MAPKs (ERK, JNK, p38) NF-kB Vereščáková H., Ph.D. Thesis, Masaryk University, Brno, 2016. induction of pro-inflammatory cytokines, chemokines, iNOS, etc. induction of Type 1 IFNs and IFN-inducible genes MyD88-dependent pathway MyD88-independent pathway C-lektinové receptory (CLR) Velká skupina receptoru s jednou a více C-lektinovými doménami Jak membránově vázané, tak solubilní. Rozpoznávají: > různé cizorodé struktury - např. manózu, fukózu a glukany > nově přítomné „nevlastní" povrchové antigény poškozených či pozměněných buněk-např. onkofetální antigén Velké množství skupin CLR, např: > manózový receptor (MR) - na povrchu makrofágů nebo dendritických buněk; rozpoznání a navázání opakujících se manéžových jednotek na povrchu mikrobů > MBL („Mannose Binding Lectin") - solubilní; klíčový v aktivaci komplementu > dectin 1 a dectin 2 - na povrchu dendritických buněk; rozpoznání beta glukanů kvasinek a plísní > galaktózový receptor - rozpoznání galaktózových zbytků na senescentních erytrocytech NOD-like receptory (NLR) („Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors'') - Intracelulární sensory bakteriální infekce a poškození buněk. - lokalizovány v cytosolu Rozpoznávají fragmenty peptidoglykanů z buněčné stěny bakterií: > NOD1 rozpoznává y-glutamyl diaminopimelovou kyselinu - produkt rozpadu peptidoglykanů G~ bakterií (Salmonella) nebo G+ bakterií (Listeria). > NOD2 rozpoznává muramyl dipeptid - součást peptidoglykanů většiny bakterií. Signálování: • V neaktivním stavu se NOD proteiny vyskytují v cytosolu v podobě monomerů. • Po rozpoznání ligandu dochází k jejich konformační změně a oligomerizaci. • Typická je aktivace dráhy NF-kB => indukce zánětlivé odpovědi RIG-l-like receptory (RLR) RLR jsou RNA helikázy rozpoznávající cytoplasmatickou virovou RNA, jednovláknovou (ssRNA) i dvouvláknovou (dsRNA). Zástupce: • RIG-I - exprimován v mnoha různých tkáních a buněčných typech, kde rozpoznává intracelulární RNA viry - rozlišuje virovou a hostitelskou RNA na základě odlišností 5'konců RNA transkriptů Signálování RIG-I: • V neaktivní (auto-inhibiční) konformaci se RIG-I vyskytuje v cytoplasmě. • Po vazbě virové RNA dochází ke konformační změně, aktivaci dráhy NF-kB a spuštění antivirového programu buňky => produkce pro-zánětlivých cytokinů a interferonů typu I. RLR často interagují s TLR při regulaci adaptivní imunitní odpovědi. Video Další PRR FMLP receptor 1 („N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine receptor 1") • Exprimován především na fagocytech. • Rozpoznává fMLP uvolňovaný z invadujicích mikroorganismů a poraněných tkání. • Stimuluje leukocyty k destrukci patogenu nebo odstranění zbytků zničených tkání. Scavengerové receptory • Přítomny na membránách makrofágů. • Rozeznávají zejména modifikované lipoproteiny. • Role v iniciaci procesu fagocytózy nejen patogenů, ale také apoptotických buněk. Různé plazmatické proteiny • Zahrnují skupinu pentraxinů (do ní patří např. C-reaktivní protein) nebo také receptory bohaté na leucin (např. CD14 vážící LPS).