HODNOCENÍ TOXICITY IN SILICO             =                         nnnnnn n n b b b x x x aaa aaa aaa      2 1 2 1 21 22221 11211  REACH ▪ Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 ▪ Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals ▪ prohloubit znalosti o nebezpečných vlastnostech jednotlivých chemických látek používaných v rámci Evropské unie ▪ v konečném důsledku by se na evropském trhu neměly vyskytovat látky, jejichž nebezpečné vlastnosti (toxikologické, ekotoxikologické a fyzikálně-chemické) nebyly dostatečně prostudovány, popsány, zhodnoceny a experimentálně prokázány REACH ▪ jenže: ▪ nové i existující chemické látky ▪ experimentální testování toxikologických a ekotox. vlastností vyžaduje značné množství laboratorních zvířat ▪ potřebné množství testovacích organismů bylo minimální (3R) ▪ provádění nových studií na obratlovcích pouze jako poslední možnost, nejsou-li dostatečně průkazné výsledky jiných alternativních metod PREDIKČNÍ TOXIKOLOGIE ▪ zabývá se metodami stanovení toxicity a toxických indexů chemických látek, které dosud nebyly testovány experimentálně ▪ alternativní metody testování ▪ in silico (stanovení/odhad výpočtem) ▪ in vitro (buňky, tkáně, nízké organismy) ▪ cíle: získat informaci o nebezpečnosti chemických látek pro zdraví rychle, levně a s co nejmenším utrpením pokusných zvířat IN SILICO METODY ▪ neocenitelné ▪ využívají výpočetních metod k rozšíření stávajících experimentálních dat ▪ mohou být použity pro rychlejší posouzení tisíců chemikálií ▪ in silico = s využitím počítače IN SILICO METODY ▪ SAR a QSAR ▪ Read-across ▪ sdružování látek ▪ analýza trendu 1. (Q)SAR ▪ SAR (Structure-Activity Relationship) ▪ je obecným označením metod a modelů pro rozbor a popis kvalitativních vztahů strukturálních vlastností látek a jejich vlivu na fyzikální, chemické či biologické vlastnosti ▪ ke kvantifikaci těchto vztahů pak slouží metody a modely QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) 1. (Q)SAR ▪ statistické modely popisující vztah typicky mezi strukturálními či fyzikálně-chemickými vlastnostmi látky a jejich chemickými vlastnostmi či biologicky účinky ▪ k vytvoření modelů (Q)SAR je využíváno standardních postupů a metod statistiky, vytěžování dat (data mining) a strojového učení ▪ vytvoření modelu obvykle vyžaduje použití rozsáhlého množství dat a informací o značném počtu chemických látek chemických struktur ▪ tyto informace pak tvoří trénovací, testovací a validační množinu pro sestavení modelu ▪ po důkladné validaci a ověření spolehlivosti modelu jsou následně vytvořená pravidla uplatňována na chemickou strukturu, jejíž vlastnosti chceme odhadnout 1. QSAR ▪ vlastnosti fyzikálně chemické jsou společně dány uspořádáním elektronů v molekule, molekulovými orbitaly té které sloučeniny ▪ biologická účinnost, velikost biologického účinku, je určena kritickým procesem, který je nejpomalejší a který určuje velikost účinku – koncentraci účinné látky v místě účinku ▪ může být řízen vlastnostmi molekul: ▪ hydrofobní („lipofilní“) ▪ elektronové (polární) ▪ sterického charakteru ▪ případně ostatní, výše nezařaditelné, např. kombinované z více výše zmíněných příspěvků (molární refrakce a jiné), topologické indexy a další 1. QSAR ▪ nejobecnější tvar QSAR rovnice představuje Hanschova rovnice: log BAi = k1.log Pi + k2.(log Pi)2 + k3Ri + k4.Si +k5 BAi je biologická účinnost látky i log Pi je rozdělovací koeficient látky i mezi n-oktanol a vodu Ri je konstanta simulující reaktivitu látky i Si je konstanta simulující stérické uspořádání molekuly látky i Hanschova rovnice, obsahující substituentové konstanty: log BAi = k1.πi + k2.πi 2 + k3σi + k4.Es + k5 πi je Hanschova substituentová konstanta hydrofobnosti substituentu i σi jeho Hammettova substituentová konstanta Es Taftova stérická konstanta a koeficienty k jsou čísla vycházející z regresní analýzy 1. FRAGMENTAČNÍ ANALÝZA ▪ ve farmakologii zakořenila spíše fragmentální analýza, jež výpočtem konstant de novo (Free-Wilsonova analýza) slouží při hledání struktury molekul nových účinných léčiv ▪ spočívá v představě, že každý fragment molekuly přispívá určitou, vždy stejnou, velikostí biologického účinku do biologické účinnosti celé molekuly: BAi = an + µ (n = 1, 2, 3,…) an jsou příspěvky fragmentů molekuly µ je biologická účinnost té části molekuly, která se nemění ▪ o předpokladu aditivity těchto příspěvků se vedou diskuse 2. READ ACROSS ▪ analogický přístup ▪ využití dat/informací o určité chemické struktuře a posouzení významu a relevance těchto informací vzhledem k jiné chemické struktuře ▪ postup, při kterém je jedna nebo více vlastností chemické látky odvozena na základě srovnání s chemickou látkou s podobnou strukturou či fyzikálně-chemickými vlastnostmi ▪ lze aplikovat k posouzení fyzikálně-chemických vlastností, toxicity, osudu látky v životním prostředí či ekotoxicity ▪ read-across může být provedeno kvalitativně nebo kvantitativně 2. READ ACROSS ▪ predikce toxicity metodou read-across se opírá o dva klíčové kroky: ▪ identifikaci strukturně podobné (analogické) látky, či identifikaci chemické substruktury, která je společná pro obě látky (jak pro látku výchozí se známými vlastnostmi, tak pro látku cílovou s neznámými vlastnostmi) ▪ využití předpokladu, že přítomnost vlastnosti/účinku pro látky lze odvodit z přítomnosti vlastnosti/účinku látky strukturně podobné ▪ na základě tohoto předpokladu lze usoudit, že strukturně podobné (analogické) látky budou (do určité míry) vykazovat podobné vlastnosti ▪ klíčovou otázkou pak je zhodnocení vzájemné strukturní podobnosti látek 2. READ ACROSS ▪ výsledkem kvalitativního přístupu read-across je určení pozitivního/negativního (respektive přítomnosti či absence) účinku či vlastnosti (například zda má daná látka senzibilizační účinky, či nemá) ▪ kvantitativní přístup read-across pak tento účinek kvantifikuje (například zjištění hodnoty EC50) 2. READ ACROSS – VARIANTY POUŽITÍ ▪ přístup read-across může být uplatněn jakýmkoliv ze čtyř následujících způsobů z hlediska počtu výchozích a cílových látek: ▪ jedna na jednu (jedna výchozí látka k odhadu vlastností jedné cílové látky) ▪ více na jednu (dvě nebo více výchozích látek k odhadu vlastností jedné cílové látky) ▪ jedna na více (jedna výchozí látka k odhadu vlastností více cílových látek) ▪ více na více (dvě nebo více výchozích látek k odhadu vlastností více cílových látek) 3. SDRUŽOVÁNÍ LÁTEK ▪ příloha XI k nařízení REACH umožňuje hodnotit vlastnosti chemických látek pomocí sdružování (např. do chemických „kategorií“) ▪ chemickou kategorii představuje skupina chemických látek, jejichž fyzikálně-chemické, toxikologické a ekotoxikologické vlastnosti jsou s největší pravděpodobností velmi podobné nebo sledují určitý pravidelný vzor v důsledku strukturální podobnosti ▪ na základě toho lze u látek sdružených v dané kategorii určit jejich fyzikálně-chemické vlastnosti, osud v životním prostředí, účinky na životní prostředí a účinky na lidské zdraví 3. SDRUŽOVÁNÍ LÁTEK 3. SDRUŽOVÁNÍ LÁTEK ▪ podobnosti chemických látek mohou být založeny na: ▪ společné funkční skupině (např. aldehydová, epoxidová, esterová, atd.) vztahující se ke specifické aktivitě ▪ společných prekurzorech nebo společných rozkladných produktech (např. přístup společné metabolické dráhy při zkoumání příbuzných látek jako například kyselin/esterů/solí) ▪ postupné a stálé změně v celé kategorii (např. kategorie látek s rostoucí změnou v délce řetězce a výslednou změnou ve vlastnostech těchto látek) Pokud stávající dostupné experimentální výsledky potvrzují, že chemické látky v dané kategorii vykazují shodné nebo předvídatelné vlastnosti, pak lze pro posouzení vlastností chemikálií využít interpolace (nebo v odůvodněných případech i extrapolace) namísto provádění dodatečných laboratorních zkoušek. 4. ANALÝZA TRENDU ▪ analýza trendu může být použita, pokud jednotlivé látky v dané kategorii vykazují pravidelné předvídatelné zvýšení nebo snížení účinku (například konstantní pokles hodnoty LD50 s rostoucí změnou v délce řetězce) ▪ interpolací či extrapolací lze pak predikovat vlastnosti látek v dané kategorii, jež jsou seřazeny podle hodnoty parametru, která determinuje daný účinek (například rozdělovací koeficient oktanolvoda v případě ekotoxicity) ▪ ve statistické terminologii je metoda analýzy trendu lineární regresní analýzou (respektive obvykle spíše multilineární regresní analýzou) a následnou interpolací či extrapolací ▪ obecně platí, že interpolace je vždy preferována před extrapolací, kterou lze využít jen ve velmi důsledně odůvodněných případech, neboť u extrapolace je vyšší riziko náhlé změny ve sledovaném trendu a tudíž riziko významné odchylky predikce 4. ANALÝZA TRENDU ▪ interpolace může být prováděna s vysokou mírou spolehlivosti, zejména pokud je řada známých experimentálních hodnot monotónní (všechny vykazují zvýšení nebo snížení) ▪ důsledná interpretace a zdůvodnění a patřičná obezřetnost při predikci je zapotřebí v případě, že jedna nebo více hodnot jsou vyloučeny z trendu DOPLNĚNÍ DAT VYUŽITÍ V PRAXI ▪ Predikce ekotoxicity LC50/96h pro Pimephales promelas (analýza trendu) ▪ dobře použitelná pro homologické řady chemických látek (např. alkoholy, acetáty), nevhodná pro skupiny látek obsahující isomery (např. m-xylen, oxylen, p-xylen) VYUŽITÍ V PRAXI VYUŽITÍ V PRAXI VYUŽITÍ V PRAXI VYUŽITÍ V PRAXI VYUŽITÍ V PRAXI Mgr. et Mgr. Alžběta Kružicová TOXIKOLOGIE POTRAVIN ANEB CO NEJÍST BÍLÉ JEDY ▪ mléko ▪ mouka ▪ cukr ▪ sůl ▪ tuk CUKR ▪ LD50 potkan 27,7 g/kg živé hmotnosti ▪ člověk: 1939 g ▪ obezita, metabolický syndrom, cukrovka ▪ Cocacola 27 kostek/l ▪ Kofola 20 ▪ Tonic 22 ▪ Jupík pomeranč 28 UMĚLÁ SLADIDLA? ▪ Aspartam ▪ 200krát sladší než cukr, teplotně nestálý (+ acesulfam K) ▪ 50% fenylalaninu, 40% kyseliny aspartagové a 10% metanolu ▪ nadbytek fenylalaninu narušuje normální hladinu serotoninu v nervovém systému, což vede k depresím, emocionálním a psychotickým poruchám UMĚLÁ SLADIDLA? ▪ Aspartam ▪ Z 0,35 l sladkého nápoje vznikne 18 mg methanolu, přičemž maximální doporučená (bezpečná) denní dávka methanolu je podle FDA 7,1 až 8,4 mg na kilogram hmotnosti příjemce (tj. pro 60 kg člověka je to 426 až 504 mg) ▪ při metabolizaci přírodních sladkých nápojů vzniká metanol také: ▪ pomerančového džus 23 mg metanolu ▪ jablečný džus 29 mg ▪ grepový džus 65 mg ▪ rajčatová šťáva 107 mg ▪ při metabolizaci přírodních sladkých nápojů – na rozdíl od nápojů slazených aspartamem – vzniká ovšem současně i ethanol, který lidský organismus před škodlivými účinky methanolu chrání UMĚLÁ SLADIDLA ▪ Acesulfam draselný ▪ v kombinacích s dalšími umělými sladidly ▪ stimuluje sekreci inzulínu, i když nezvyšuje hladinu cukru v krvi ▪ spojován s leukémií, rakovinou prsu, rakovinou brzlíku a chronickými onemocněními dýchacích cest ▪ Kyselina asparagová ▪ excitotoxin ▪ Sukraloza ▪ atomy chloru ▪ syndrom dráždivého tračníku, ulcerózní kolitida, Crohnově nemoci SŮL ▪ doporučená denní dávka 5 g ▪ denní příjem ▪ smrtelná dávka pro člověka 150-280 g 16,5 g 6 kg soli ročně ▪ cereálie 250 mg/šálek ▪ zeleninové šťávy 479 mg/šálek ▪ mražená jídla 750 mg/porce ▪ kečup 167 mg/lžíce ▪ sójová omáčka 1024 mg/lžíce SŮL ▪ 150-280 g ▪ doporučená dávka 5 g ▪ denní příjem 16,5 g (6 kg soli ročně) MASO ▪ Nitráty (dusičnany) ▪ často se přidávají jako konzervační činidlo do masa a masných výrobků ▪ konzervace např. šunky ▪ reakce s proteiny – tvorba nitrosaminů ▪ kouř může obsahovat karcinogenní substance MASO ▪ Clostridium botulinum ▪ G+, anaerobní, sporulující tyčinka ▪ botulotoxin ▪ polypetid, 1,3–2,1 ng/kg i. v. ▪ stabilní do 60°C ▪ botulismus TĚHOTNÉ ▪ syrové maso ▪ uzený losos ▪ nepasterizované mléko a výrobky ▪ točená zmrzlina ▪ lahůdky ▪ sýry (plísňové, brynza) ▪ avokádo ▪ persin ▪ může poškodit srdce, plíce a jiné tkáně ▪ vysoký obsah tuku, což může způsobit žaludeční potíže, zvracení, v některých případech i zánět slinivky ▪ příznaky otravy patří dýchací potíže, zvětšení břicha a nadměrné hromadění tekutin v hrudníku ▪ množství, které může způsobit otravu, není přesně známo DOMÁCÍ ZVÍŘATA DOMÁCÍ ZVÍŘATA ▪ čokoláda ▪ záchvaty, bezvědomí a smrt ▪ tmavší čokoláda je nebezpečnější ▪ příznaky se nemusejí projevit i několik hodin, přičemž smrt psa může nastat i do 24 hodin ▪ již 650g mléčné čokolády nebo 90g čokolády na vaření může zabít psa vážícího 10 kg DOMÁCÍ ZVÍŘATA ▪ hrozinky ▪ mohou u psů způsobit selhání ledvin ▪ i malé dávky mohou být pro psa smrtelné ▪ fatální následky mohou nastat i v případech, kdy pes sní pár bobulí hroznů či rozinek opakovaně DOMÁCÍ ZVÍŘATA ▪ lilie ▪ první příznaky otravy se dostavují během 2-12 hodin ▪ může se vyskytnout nadměrný slinotok, zvracení nebo apatie ▪ poškození ledvin se začne projevovat nadměrným močením, které ale do 24 až 48 hodin postupně ustává, až se produkce moče zastaví ▪ kočka trpí nechutenstvím, zvracením, dehydratací, podchlazením a nastává smrt ▪ nejpozději do hodiny, vyvolat zvracení aby se zabránilo vstřebání toxinu, poté se kočce podává aktivní uhlí ZVĚŘ ▪ řepka ▪ akutní forma otravy z důvodu vysokého obsahu lehce stravitelných živin a nedostatku vlákniny ▪ dochází k vážným poruchám trávení – tympaniím, zánětům žaludku a střev ▪ přítomnosti vysokého obsahu dusičnanů, které po redukci na dusitany způsobují methemoglobinémii ▪ S-methylcystein sulfoxidu (SMCO) ▪ hemolytická anemie ZVĚŘ ▪ vodní květ ▪ cyanotoxiny (neuro, hepato a dermatotoxicita) ▪ anatoxin, mikrocystiny, nodulariny ▪ cholinergní agonista v synapsích parasympatiku a nervosvalových spojích ▪ výsledkem je paralýza svalů a úhyn na následky respiračního selhání ▪ dyspnoe, cyanózy, slabosti, generalizovaných tonickoklonických křečí, hypersalivace a úhynu udušením ZVĚŘ ZVĚŘ ▪ ethylenglykol ▪ zvracení, pak nastane metabolická acidóza a kardiovaskulární poruchy, nakonec akutní selhání ledvin ▪ hlavní příčinou toxicity není ethylenglykol samotný, nýbrž jeho metabolity ▪ nejpodstatnějšími metabolity způsobujícími toxicitu jsou kyseliny glykolová a šťavelová DĚKUJI ZA POZORNOST