Protilátky Struktura Ig: lehké a těžké řetězce pantová oblast Struktura Ig: lehké a těžké řetězce Lehké řetězce: • ,  (65 : 35 u člověka) • 23 kDa • 215 aminokyselin Struktura Ig: lehké a těžké řetězce Těžké řetězce: • 5 izotypových tříd • Různá molekulová hmotnost • 4 domény (IgG, IgD, IgA) nebo 5 domén (IgM, IgE) • 440 - 450 aminokyselin Struktura Ig: flexibilita Struktura Ig: proteolytické štěpení pepsin papain Struktura Ig: hypervariabilní úseky CDR = oblasti určující komplementárnost FR = kostrová oblast Fc L H FR FR HV (CDR) HV (CDR) Struktura Ig: hypervariabilní úseky těžký řetězec lehký řetězec Struktura Ig: vazebné místo pro antigen Vazebné místo pro antigen Antigen Epitop Struktura Ig: vazebné místo pro antigen epitop Struktura Ig: izotypové třídy Struktura Ig: izotypové třídy přeskupování gen. segmentů, hypermutace izotypový přesmyk germinální centra žádné Ig Struktura Ig: izotypové třídy IgM J Struktura Ig: izotypové třídy IgA SC Struktura Ig: izotypové třídy Těžký řetězec Mw (kDa) Hladina v séru (mg/ml) Životnost v séru (dny) Ig Struktura Ig: izotypy, allotypy, idiotypy Izotyp Allotyp Idiotyp Struktura Ig: idiotypy I. Ab II. Ab () II. Ab () Struktura Ig: idiotypy negativní regulace pozitivní regulace IgG IgG • hlavní část sérových Ig • podstatná část protilátkových aktivit (opsonizace, neutralizace, aktivace komplementu) • opakovaná imunizace • přenos přes placentu od matky k plodu • hlavní protiinfekční ochrana novorozenců IgM IgM • první Ig ve fylogenezi • vznikají po prvním kontaktu s Ag • hlavně korpuskulární Ag • membránový BCR IgA IgA • sekreční IgA (sliny, slzy, nosní sekret, pot, kolostrum, plicní sekret, urogenitální a gastrointestinální trakt) • ochrana sliznic a tělních povrchů • sekreční komponenta ~ extracelulární část polymerního Ig receptoru (pIgR) • sérový IgA IgD IgD • cytoplazmatická membrána B lymfocytů • slabá protilátková aktivita • citlivý k proteolýze - hodnoty v séru velmi nízké IgE IgE • nejnižší koncentrace v séru • nejkratší biologický poločas rozpadu • Fce receptory na mastocytech a bazofilech • alergické reakce časného typu • původní biologická funkce – ochrana proti parazitům? IgE plasmatická buňka FceRI IgE žírná buňka multivalentní alergen IgE cross-linking degranulace lokální zánět histamin Tvorba Ig: zrání B lymfocytů pro-B buňka pre-B buňka B buňka plazmatická buňka zralý BCR (IgM) sekretované protilátky (IgG) m + yL Tvorba Ig: přeskupení genových segmentů pro Ig V 1-50 D 1-25 J 1-6 C m d g3 g1 1 g2 g4 e 2 V C D J C V D J V D J Cm mRNA těžkého řetězce 7 23 9 7 12 99 12 7 9 23 7 Tvorba Ig: izotypový přesmyk rekombinasa excise Tvorba vlásenky DNA mRNA protilátka AID (aktivací indukovaná cytidin deaminasa) Alelická exkluze • platí pro těžké i lehké řetězce • jakmile proběhne úspěšná přestavba genů pro Ig řetězce na jednom chromozomu, zastaví se další pokusy na druhém chromozomu • každý B-lymfocyt produkuje současně jen jeden typ těžkého a jeden typ lehkého řetězce Klonální restrikce • každý B-lymfocyt exprimuje pouze protilátky specifické pro jeden epitop a pokud se dále dělí, nepodstupuje další V/J nebo V/D/J přeskupování • B-lymfocyt a jeho potomstvo jsou identičtí ve své antigenní specifitě a v izotypu  nebo  řetězce Funkce protilátek • Protilátky mohou být přímo protektivní, pokud inhibují vazbu mikroorganizmu nebo toxinu na odpovídající buněčný receptor. • Protilátky nepůsobí v izolaci, ale úzce spolupracují s jinými složkami imunitního systému. • neutralizace • opsonizace • aktivace komplementu Funkce protilátek aktivace B lymfocytů antigenem a TH lymfycyty produkce protilátek neutralizace opsonizace aktivace C prevence adherence bakterií usnadněná fagocytóza usnadněná fagocytóza, lýze bakterií Funkce protilátek bakterie v plazmě Specifické protilátky neutralizace opsonizace aktivace C bakteriální toxiny extracelulární bakterie ingesce makrofágy ingesce makrofágy lýze a ingesce komplement Funkce protilátek IgM IgG vazba C1q vazba C1q C1q C1r C1s Funkce protilátek: ADCC (buňkami zprostředkovaná cytotoxicita závislá na protilátkách) Vazba protilátky na antigen Vazba FcR na Fc fragment protilátky NK NK Cross-linking FcR, aktivace NK bunňky Apoptóza Funkce protilátek: izotypové třídy Ig Aktivace komplementu (klasická) Aktivace komplementu (alternativní) Přenos přes placentu Vazba na FcR Vazba na bazofily a žírné buňky Reaktivita s proteinem A Reakce antigen-protilátka: základní pojmy • Afinita - síla reakce mezi jednotlivou antigenní determinantou a jednotlivým vazebným místem protilátky. • Avidita – je celková síla vazby mezi antigenem s mnoha antigenními determinantami a multivalentními protilátkami. • Specificita – schopnost jednotlivé protilátky a jejího vazebného místa reagovat pouze s jednou určitou antigenní determinantou • Křížová reaktivita – schopnost jednotlivé protilátky reagovat s více než jednou antigenní determinantou Reakce antigen-protilátka: specificita ☑ ☒ Reakce antigen-protilátka: křížová reaktivita Ag 1 Ab Ag 2 Ab Ag 3 Ab Primární a sekundární protilátková odpověď Ig I. II. Dny lag-fáze anti-A anti-B Primární a sekundární protilátková odpověď týdny 1 2 Ig Primární protilátková odpověď • 3-4 dny po imunizaci • lokalizace – sekundární lymfatické orgány • typ odpovědi – IgM izotyp, nízká afinita k antigenu, účinné v blokádě rozšiřování antigenu • imunokomplexy Ab+Ag uchovávané v lymfatických uzlinách na FDC (velmi dlouho, možná roky!) – primární lymfoidní folikuly • FDC opět stimulují B lymfocyty (klonální expanze buněk primárně stimulovaných Ag) Sekundární protilátková odpověď • podmínky: rozpoznání antigenů na FDC v primárních lymfatických folikulech, signály z Th lymfocytů • nové dělení a diferenciace B lymfocytů, mutace V genového segmentu pro H, L řetězce • pouze B lymfocyty s velmi silnou afinitou přežijí, buňky s afinitou slabou (neproduktivní mutace) zahynou • rostoucí výběr a soutěž buněk, protože klesá množství antigenu (na FDC) • intenzívní proliferace a hynutí • lokalizováno v sekundárních lymfoidních folikulech v germinálních centrech • afinita o 4-6 řádů vyšší než u IgM primární odpovědi Regulace protilátkové odpovědi negativní zpětná vazba anti-idiotypová síť suprese pomoc rozpoznání idiotypu stimulace IgG IgM APC Antigen Protilátky Katabolismus Monoklonální protilátky • protilátky produkované jediným klonem B-lymfocytů • uměle vytvořených hybridizací B-lymfocytů s určitou antigenní specifitou (= vytvářejí Ig se stejnou antigenní specifitou) a nádorových buněk (= jsou „nesmrtelné“) • nádorové buňky HGPRT- (hypoxantin-guanin fosforibosyltransferasa) • kultivace v HAT-mediu (hypoxanthin, aminopterin a thymidin) • využití monoklonálních protilátek • diagnostika (např. průtoková cytometrie, ELISA) • léčba (anti-IgE, anti-TNF-, anti-CD3) 1 2 3 4 Monoklonální protilátky epitopy antigen imunizace sérum polyklonální antisérum monoklonální protilátky lymfocyty nádorové buňky (HGPRT-) fúze (propylenglykol) hybridomy klonální expanse selekce určitého klonu Ag Ab-1 Ab-2 Ab-3 Ab-4 Monoklonální protilátky myší (0 % lidské) chimerické (65 % lidské) humanizované (> 90 % lidské) lidské (100 % lidské) vysoká Imunogenicita nízká