Transplantační imunita Protinádorová imunita Lukáš Kubala kubalal@ibp.cz Transplantační imunita Rozdělení trasplantací podle příbuznosti příjemce Autologní transplantace (Autograft) • transplantace štěpu (graftu, transplantátu) identickému jedinci • např. transplantace kůže v rámci jednoho jedince, autotransfúze vlastní krve Isogenní nebo syngenní transplantace (Isograft nebo Syngraft) • transplantace štěpu jinému, avšak geneticky identickému jedinci • např. transplantace mezi jednovaječnými dvojčaty nebo jedinci imbredního kmene Alogenní transplantace (Alograft) • transplantace štěpu geneticky odlišnému jedinci stejného druhu Xenogenní transplantace (Xenograft) • transplantace štěpu mezi jedinci odlišného druhu Tolerance štěpu a odvržení štěpu Autologní a syngenní transplantace 100-- % přežívajících v _ v O stepu 50- MHCJ MHC; Štěp je tolerován 10 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) 20 0 Alogenní transplantace MHC' MHC Štěp je odvržen (prvotní odvržení) Dny po transplantaci Odvržení (rejekce) štěpu Klíčovou roli hrají T lymfocyty, které indukují komplexní imunitní odpověď na cizorodý štěp. Aloreaktivita T lymfocytů Schopnost T lymfocytů příjemce rozeznávat cizorodé buňky dárce na základě odlišné alelické formy MHC antigénu, případně jiných antigénu. Cizorodé MHC antigény jsou schopny aktivovat až 5% celkového počtu klonů T lymfocytů příjemce. U „bez-tymových" jedinců nedochází k indukci rejekce. Odstranění T lymfocytů z organismu navozuje toleranci ke štěpům. Přenos senzitivity ke štěpům z dárce do jedince, který se s daným štěpem nesetkal pomocí T lymfocytů. Přenos izolovaných T lymfocytů z již transplantovaného příjemce _do příjemce nového_ % přežívajících v _ v O stepu Urychlené odvržení (sekundární odvržení) Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) 0 ~~10 20 Dny po transplantaci Odvržení štěpu závisí na shodě povrchových antigénu (tzv. histokompatibilitě) Antigény hlavního histokompatibilního komplexu (MHC antigény) = antigenní struktury klíčové pro indukci odvržení štěpu Myši - antigény komplexu H-2 kódované geny na chromozómu 17; rozlišujeme geny MHC třídy I (K, D, L) a MHC třídy II (I) Člověk - antigény komplexu HLA kódované geny na chromozómu 6; rozlišujeme geny MHC třídy I (A, B, C) a MHC třídy II (DP, DQ, DR); každý gen má celou řadu alel Antigény minoritních histokompatibilních komplexů - také schopny indukce odvržení štěpu, ale méně významné Odvržení štěpu závisí na histokompatibilitě Syngenní transplantace a MHCa a MHCa 100- % přežívajících v _ v O stepu 50H 0 Štěp je tolerován i i i i i i i i 010 60 Alogenní transplantace - rozdíl v MHC MHC Rychlé odvržení \ i i i i—i i i i i i i 120 0 10 60 TT Alogenní transplantace - rozdíl v minoritních antigenech a MHCa a MHCa 120 0 10 Dny po transplantaci Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Rozpoznávání transplantačních antigénu Přímé rozpoznání Antigeny štěpu jsou rozpoznány přímo na povrchu APC pocházejících ze štěpu. Nepřímé rozpoznání Antigen štěpu je zpracován v APC příjemce a následně prezentován na jejich povrchu. APC = antigen prezentující buňka Dendritické buňky ze štěpu migrují do lymf. orgánů příjemce. Zde indukují aktivaci a klonální proliferaci imunokompet. buněk. Lymfocyty infiltrují štěp. Dochází k odvržení štěpu. Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Antigény erytrocytu Hlavní systémy: A a B antigény a antigen Rh A a B antigény • v krvi proti nim kolují přirozené protilátky IgM, které způsobují aglutinaci a hemolýzu erytrocytu nesoucích cizorodý antigén A nebo B • exprimovány také na površích jiných typů buněk, např. endoteliálních, a mají tedy význam pro indukci odvržení jakýchkoli vaskularizovaných transplantovaných orgánů -> indukce až hyperakutní rejekce Group A Group B Group AB Group 0 Red blood cell type é: # Antibodies in Plasma Anti-B Anti-A None Anti-B and Anti-A Antigens in Red Blood Cell T A antigen T B antigen T? A and B antigens None m © https://nutritionactivist.wordpress.com/2016/12/24/blood-types/ Antigén Rh • Rh+jedinci nesou antigén • Rh" jedinci antigén nemají a nemají ani protilátky proti Rh (jsou to třídy IgG), ty vznikají až po imunizaci antigenem Testy histokompatibility Sérologická detekce Používá se kolekce antisér nebo monoklonálních protilátek reagujících specificky s odlišnými alelami HLA genů. V testu tyto protilátky v přítomnosti komplementu indukují lyži testovaných lymfocytů nesoucích danou alelu příslušného HLA genu. Výsledkem je stanovení MHC I a MHC II alel dárce a příjemce - sérologické typy. Genotypizace Stanovují se specifické alely HLA genů dárce a příjemce, které se následně porovnávají. Směsná lymfocytární reakce Směsná lymfocytární reakce Leukocyty dárce jsou ovlivněny tak, aby nemohly proliferovat. Přidají se lymfocyty příjemce. Žádné změny počtu leukocytu = histokompatibilita Indukce proliferace lymfocytů příjemce Indukce usmrcování buněk dárce Proliferace lymfocytů je závislá především Cytotoxicita je závislá především na na rozdílech v MHC II alelách. rozdílech v MHC I alelách. Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Intenzita odvržení štěpu - Prvotní odvržení vs sekundární (opakované) odvržení alogenního štěpu - Charakteristika odvržení štěpu na základě klinického průběhu • akutní rejekce • hyperakutní rejekce • chronická rejekce Intenzita odvržení štěpu - paměťové buňky Prvotní odvržení alogenního štěpu Postupné rozpoznání cizorodých antigenních struktur T lymfocyty, jejich aktivace, klonální proliferace a následná indukce imunitní odpovědi. Sekundární (opakované) odvržení alogenního štěpu ze stejného dárce Rychlejší díky paměťovým buňkám (pro rejekci důležité zejména T lymfocyty), které okamžitě indukují silnou imunitní odpověď. Alogenní transplantace MHC MHC Štěp je odvržen (prvotní odvržení) 10 Opakovaná alogenní transplantace (stejný příjemce i dárce) MHC! Urychlené odvržení (sekundární odvržení) % přežívajících v _ v O stepu 20 0 10 20 Dny po transplantaci Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Charakteristika odvržení štěpu na základě klinického průběhu imunitní odpovědi Akutní rejekce Pozdější fáze prvotní nebo časná fáze opakované reakce na transplantovaný štěp. > Cytototoxické T lymfocyty lyžují buňky štěpu. > Pomocné T lymfocyty produkují cytokiny (zejména IL-2, TNF-(3 a IFN-y) stimulující migraci fagocytů a dalších cytotoxických lymfocytů a stimulující jejich cytotoxické působení. > B lymfocyty stimulované pomocnými T lymfocytů produkují protilátky specifické proti antigenům štěpu. Transplantovaný orgán ztrácí funkčnost, tkáň je silně infiltrovaná lymfocyty a makrofágy, dochází k otoku orgánu díky rozsáhlé zánětlivé reakci. Charakteristika odvržení štěpu na základě klinického průběhu imunitní odpovědi Hyperakutní rejekce Příjemce má už před transplantací vytvořeny protilátky proti antigenům štěpu Nekompatibilní antigenní struktury na endoteliáních buňkách příjemce Masivní indukce srážení krve blokující průtok krve cévami Ab a složky Endoteliální komplementu buňky příjemce Nekrotická tkáň Krevní sraženiny Zničene cévy Opakovaná transplantace mezi stejným dárcem a recipientem Xenotransplantace Neshoda v antigenech AB systému antigen na eytrocytech Charakteristika odvržení štěpu na základě klinického průběhu imunitní odpovědi Chronická rejekce Opakovaně se objevuje měsíce a roky po úspěšné transplantaci, kdy orgán vykonává svoji funkci. Je způsobena jak protilátkami, tak cytotoxickými lymfocyty. Je charakterizována pozvolnou ztrátou funkce transplantovaného orgánu. Primárně se jedná a chronický zánět malých artérií vedoucí k vzniku zánětlivých lézí, fibróze a postupnému selhání orgánu. Problém je zavčas chronickou rejekci detekovat a opětovně nasadit silnou imunosupresivní léčbu podobně jako krátce po transplantaci. Reakce štěpu proti hostiteli (graft-versus-host disease) Cytotoxické lymfocyty hostitele napadají buňky štěpu. r Cytotoxické lymfocyty štěpu napadají buňky hostitele. Reakce štěpu proti hostiteli. Odstranění imunokompetentních buněk ze štěpu. Reakce hostitele proti štěpu. Žádná reakce. Obnovení imunokompetentních buněk z kmenových buněk štěpu. Reakce štěpu proti hostiteli se objevuje v případech, kdy transplantovaný orgán (např. kostní dřeň) obsahuje imunokompetentní buňky, které atakují buňky hostitele. Uplatňují se jak pomocné, tak cytotoxické T lymfocyty. Obranou je snížení počtu imunokompetentních buněk ve štěpu a co nejvyšší stupeň histokompatibility. Avšak potenciální výhoda imunokompetentních buněk ve štěpu je, že atakují i leukemické buňky hostitele - snížení relapsů. Imunosupresivní terapie 1. Kortikosteroidní terapie 2. Inhibitory kalcineurinu 3. Purinové analogy a inhibitory syntézy purinů 4. Antagonisté receptoru pro interleukin 2 5. Terapeutické protilátky Kortikosteroidní terapie Prednison Stero id n í receptory jsou v plasmě v komplexech s heat-shock proteiny (Hsp). Stero idy prostupují buněčnou membránou, váží se na receptory Komplex steroid:receptor a uvolňují Hsp. vstupuje do jádra. Steroidní receptor se váže na promotory vybraných genů a inhibuje či iniciuje jejich transkripci. Msteroid receptor Hsp90 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Efekty kortikosteroidní terapie Ovlivnění Fyziologický efekt Snížení exprese prozánětlivých cytokinů Redukce celkové zánětlivé odpovědi Snížení exprese inducibilní syntázy oxidu dusnatého Redukce oxidativního poškození a dalších patologických účinků nadměrné produkce NO Snížení exprese fosfolipázy A2 a cyklooxygenázy 2 Snížení tvorby prozánětlivých prostaglandinů a leukotrienů Snížení exprese adhesivních molekul Redukce migrace leukocytu přes endotel do tkání Zvýšení aktivity endonukleáz Indukce apoptózy u lymfocytů a eozinofilů Inhibitory kalcineurinu Malé organické molekuly makrolidové laktony původně izolované z bakterií a hub. V cytoplasmě vytváří komplexy s proteiny imunofiliny, které se dále váží na cytoplasmatickou fosfatázu kalcineurin, kterou tím inhibují. To způsobuje inhibici specifických transkripčních faktorů lymfocytů zajišťujících indukci exprese prozánětlivých cytokinů. Zástupci: Cyklosporin A, Tacrolimus (FK506) Účinky • redukce exprese a produkce cytokinů T lymfocyty (např. IL-2, IL-3, IL-4) • redukce proliferace T a B lymfocytů • inhibice cytotoxických mechanismů lymfocytů a neutrofilních granulocytů • indukce apoptózy aktivovaných B lymfocytů Video Purinové analogy a inhibitory syntézy purinů Cytotoxické látky interferující se syntézou a metabolismem DNA a RNA. Primárně byly objeveny a použity pro léčbu nádorových onemocnění. Nezabraňují aktivaci lymfocytů přímo, ale inhibují proliferaci a funkce lymfocytů. Mají silné vedlejší toxické účinky. Např. Azathioprin Antagonisté receptoru interleukinu-2 Blokují povrchový receptor pro interleukin-2 a tím inhibují aktivaci lymfocytů tímto cytokinem. Terapeutické protilátky Polyklonální protilátka Polyklonální protilátky • anti-lymfocytární globulín (anti-tymocytární globulín; ATG)-získaný buď z králíků (Thymoglobulin) nebo koní (ATGAM) imunizovaných lidskými lymfocyty • velice účinně redukují počet cirkulujících lymfocytů • mají silné vedlejší účinky díky reakci hostitele proti cizorodému imunoglobulinu Monoklonální protilátky • zaměřené specificky na antigenní konkrétní antigenní struktury (např. IL2RA, CD3, CD52, a další) • Geneticky modifikované s cílem minimalizovat vedlejší účinky mají Chimérické monoklonální protilátky Humanizované monoklonální protilátky Plně humánní monoklonální protilátky Monoklonální protilátka http://absoluteantibody.com/anti body-resources/antibody- overview/antibodies-as-tools/ Genetické modifikace terapeutických protilátek Geneticky modifikované monoklonální protilátky Část molekuly, která nekóduje oblasti vázající antigen, nahrazena úsekem lidského imunoglobulinu. Chimérické protilátky - myšího původu je Fab úsek imunoglobulinu Humanizované monoklonální protilátky - myšího původu jsou jen CDR oblasti (complementarity determining region), které reagují s antigenními epitopy Plně humánní monoklonální protilátky -lidská monoklonální protilátka 0)7^ čsfO&šd GyOCPcJ ^vvťy ® © Obr 2 Typy monoklonálnlch protilátek užívaných v tGraplí: (a) my&l monoklonální protilátka, P) chimérická monoklonální protilátka, (c) humanizovaná monoklonální protilátka, (d) lidská monoklonální protilátka. Sobotková M, Bartůňková J. Monoklonální protilátky a další biologická léčiva užívaná v imunosupresivní léčbě, fíemedia 2008; 18:356-364. Cíle terapeutických protilátek Cílené na antigény na imunitních buňkách Indukují buněčnou smrt zprostředkovanou aktivací komplementu, ADCC, fagocytózou, nebo apoptózou Anti-thymocytární globulín (ATG) Muromonab-CD3 - myší monoklonální anti-CD3 protilátka proti T lymfocytům (negativní reakce - nepoužívá se) Alemtuzumab - humanizovaná protilátka proti CD52 způsobující depleci T i B-lymfocytů Rituximab - chimérická protilátka proti CD20 způsobující depleci B-lymfocytů Narušující cytokinové signálování a kostimulaci mezi T a B lymfocyty Basiliximab - chimérická protilátka proti řetězci a receptoru pro IL-2. Interferuje s aktivací T lymfocytů IL-2. Daklizumab - je humanizovaná lidská proti řetězci a receptoru pro IL-2. Interferující s aktivaci komplementové kaskády Ekulizumab - humanizovaná protilátka proti C5a složce komplementu, Zajímavost: Infliximab, první terapeutická protilátka proti TNF-a úspěšně používaná u pacientů, objevil československý biolog Jan Vilček love anc science JAN VILCEK Terapeutické protilátky Neovlivněný příjemce Primární rejekce Anti-CD3 protilátka Čas Bez rejekce -m > 3 >N Q. CD >Q, Ä" +■" U. >(/) □ Čas Opakovaná transplantace I? Opakovaná transplantace Rychlá sekundární _rejekce_ Čas Bez rejekce Čas Anti-CD3 protilátka Prodleva až anti-CD3 zmizí s cirkulace -\7- První transplantace Primární rejekce Čas Protinádorová imunita Organismy se za normálních okolností brání proti proliferaci nádorových buněk a tvorbě nádorů různými mechanismy imunitního systému. Nádorové buňky jsou rozpoznávány na základě antigénu (antigény specifické pro nádory a antigény asociované s nádory), které vyvolávají indukci protinádorové imunitní odpovědi. Antigény specifické pro nádory Abnormální post-translační modifikace proteinů Změna struktury proteinů mění jejich antigenní vlastnosti. Např. abnormální formy glykoproteinů - snížená glykosylace mucinů produkovaných nádorovými buňkami u nádorů prsu a pankreatu. Antigény kódované virovými onkogeny Jsou to proteiny kódované genomy virů indukujících nádorovou transformaci. Většinou jsou klíčové pro deregulaci proliferace infikovaných buněk. Často jsou lokalizovány v jádře a málo exprimované na povrchu buněk MHC receptory. Antigény vznikající klonální amplifikací V případě lymfomů nekontrolovaná amplifikace určitého klonu T nebo B lymfocytů, vznik extrémního množství daného idiotypu TCR nebo BCR, případně cirkulujících monoklonálních protilátek. Antigény specifické pro nádory vznikající mutací či přeskupením genů Mechanismy - bodová mutace nebo přeskupení genů - vedoucí ke vzniku nových specifických nádorových antigénu. Normální buňka prezentující vlastní antigény MHC molekulami. Bodová mutace v proteinu nebo peptidu vede ke vzniku nových antigenních struktur -> cizorodý antigen. Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Antigény asociované s nádory Normální buňka prezentující vlastní antigény MHC molekulami. Změna genové aktivace (např. onkofetální antigény) Obnova exprese genů normálně exprimo-vaných pouze u nediferencovaných buněk má za následek vznik antigénu cizorodých pro imunitní systém dospělého. Nadměrná exprese Ag (např. HER antigen) Nadměrná exprese určitých proteinů v nádorových buňkách mění hustotu daného peptidu na povrchu buněk a jejich následné rozpoznání buňkami imunitního systému. Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Efektorové mechanismy protinádorové imunity 1. Lyže nádorových buněk protilátkami ve spolupráci s komplementem. 2. Opsonizace nádorových buněk a následná destrukce fagocyty. 3. Produkce cytokinů (INF-y a TNF-a) indukující zvýšení MHC I a MHC II a aktivaci imunokompetentních buněk. 4. Protilátkami zprostředkovaná ztráta adheze mezi nádorovými buňkami. 5. Přímá destrukce nádorových buněk cytotoxickými CD8+ lymfocyty. 6. Protilátkami zprostředkovaná buněčná cytotoxicita. 7. Destrukce nádorových buněk NK lymfocyty (zejména u nádorů neexprimujících MHC I antigény). Efektorové mechanismy protinádorové imunity Mechanismy, kterými nádory unikají rozpoznání imunitním systémem Nízká imunogenicita Rozeznání nádorového antigénu jako vlastního Modulace struktury antigénu Indukce imunosuprese Vytvoření mechanické bariéry TCR Žádné • MHCantigen ligandy • adhesivní molekuly • pomocné receptory Nádorové Ag prezentovány bez přítomnosti kostimulačních receptoru navozují toleranci k těmto antigenům. Protilátky proti nádorovým Ag indukují jejich endocytózu a degradaci -> snížení jejich exprese. Produkce imunosupresivních cytokinů a jiných imunosupresivních látek nádorovými buňkami. Faktory sekretované nádorovými buňkami vytváří fyzickou bariéru. Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Imunoterapie v protinádorové léčbě Léčebné postupy založené na indukci protinádorové imunity nebo na využití imunitních mechanismů k cílenému směřování léčiv do místa nádoru. Aktivní vakcinace • Vakcinace proti viru indukujícímu vznik určitého nádoru. • Vakcinace syntetickými analogy vybraných nádorových antigénu, lyzáty nádorových buněk, nebo celými inaktivovanými nádorovými buňkami. • Antigény, které mají stejnou strukturu ve více typech nádorů (např. jsou společné pro různé typy melanomů), jsou dobrým cílem pro imunoterapii. Pasivní imunizace • Přímá aplikace protilátek proti nádorovým antigenům. Imunoterapie v protinádorové léčbě Nespecifická stimulace zánětu Indukce intenzivního zánětu v místě výskytu nádoru - např. pomocí suspenze inaktivované mykobakteriální směsi. Stimulace LAK a TIL LAK (lymphokine activated killers) - izolované periferní T lymfocyty a NK buňky. TIL (tumor infiltrating lymphocytes) - lymfocyty izolované z nádoru pacienta. Stimulují se in vitro a pak se vrátí do organismu. Cílem je aktivace utlumených cytotoxických buněk proti nádorovým antigenům. Transfer efektorových buněk Vlastní izolované dendritické buňky inkubované in vitro s nádorovým antigenem se po aktivaci vrátí do organismu. Monoklonální protilátky v protinádorové léčbě Neznačené monoklonální protilátky. Protilátky se váži na nádorové buňky a indukují protilátkami zprostředkovanou cytotoxicitu. Malá účinnost. Monoklonální protilátky s navázaným toxinem nebo enzymem. -^7- Protilátky s toxinem jsou inter-nalyzovány a toxin usmrcuje nádorovou buňku. Enzym lokálně metabolizuje pro-cytotoxickou látku na cytotoxickou. Monoklonální protilátky s navázaným radioisotopem. -^7- Radioaktivita usmrcuje nádorové buňky. Využívá se i pro zobrazování lokalizace nádoru. Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Příklad protilátek proti nádorovým antigenům: Humanizovaná monoklonální protilátka anti-Her-2 Trastuzumab (Herceptin). Velmi úspěšný v léčbě Her-2 pozitivních nádorů prsu.