Zánět, fagocyty, komplement (Milan Číž) Zánět Tělo je před poraněním/proniknutím mikroorganismu chráněno fyziologickými a fyzikálními bariérami. Kůže – keratinocyty, pot (promývání, mastné kyseliny) GI trakt – nízké pH v žaludku, mastné kyseliny, žlučové kyseliny, přirozená střevní mikroflóra Dýchací trubice – řasinky, mukózní pokryv Nosohltan a oko – mukózní pokryv, sliny, lysozym v slzách (hydrolýza peptidoglykanů) Zánět Pokud dojde k překonání těchto bariér → zánět, imunitní reakce. Definice: Souhrn imunitních a fyziologických reakcí na porušení integrity organismu, které vedou k lokalizaci poškození, ochraně poškozeného místa a k jeho zhojení. Vznik zánětu: • Antigenní podnět (infekční mikroorganismy) • Poranění chemickými nebo fyzikálními vlivy • Ischemie orgánů a tkání Klasické projevy lokálního zánětu: • Rubor = zčervenání • Tumor = otok • Dolor = bolestivost • Calor = zvýšení místní teploty Druhy zánětu: • Akutní – fyziologická obranná reakce; odezní bez následků a poraněná tkáň se kompletně zhojí • Chronický = obvykle patologický; tkáň je do určité míry nahrazována vazivem • Sterilní = bez přítomnosti mikroorganismů Zánět První signály k rozvoji zánětlivé reakce dávají: 1. Degranulované tkáňové žírné buňky 2. Fagocyty 3. Látky uvolněné z poškozených buněk a mezibuněčné hmoty Proces zánětlivé reakce Děje doprovázející zánět • Zvýšení permeability cév, prostup plasmatické tekutiny do extravaskulárního prostoru a otok. • U poranění jako první nastupuje hemokoagulace – zabránění úniku krve. Faktory uvolněné z poškozených buněk aktivují koagulaci. Hlavním principem je přeměna rozpustné bílkoviny fibrinogenu na nerozpustný fibrin. • Aktivace fibrinolytického systému – zabránění šíření srážení krve mimo místa poranění. Při fibrinolýze se z inaktivního plasminogenu vytváří enzym plazmin, který štěpí fibrin na řadu menších polypeptidů, a tím snižuje kompaktnost krevní sraženiny, eventuálně krevní sraženinu částečně rozpouští. • Aktivace kininového systému – aktivovaný koagulační faktor XII působí na prekalikrein, vzniká kalikrein, následně bradykinin, který zvyšuje permeabilitu kapilár. • Zvýšená exprese adhezívních molekul na endoteliu – zachycování fagocytů, později lymfocytů. Koagulační kaskáda • Aktivace komplementového systému. • Aktivace fagocytů. • Ovlivnění místních nervových zakončení (bolest). • Zvýšená syntéza metabolitů kyseliny arachidonové (TX, LT, PG). • Změny regulace teploty (horečka). Je vyvolána stimulací hypotalamového centra prozánětlivými cytokiny. Následně je aktivován tkáňový metabolismus mobilizací osy hypotalamus-hypofýza-nadledviny (kůra nadledvin – steroidy, antistresový hormon kortizol). Zvýšená teplota sama zvyšuje metabolismus imunokompetentních buněk. Indukuje se exprese Hsp (Heat Shock Proteins). Ty fungují jako tzv. chaperony – váží se na nově syntetizované polypeptidové řetězce a na intracelulární denaturované proteiny a napomáhají jejich poskládání do nativních konformací. • Játra vychytávají stopové prvky důležité pro růst bakterií. • Cytokiny produkované v místě zánětu stimulují v játrech produkci proteinů akutní fáze (C-reaktivní protein, CRP; komplementové složky C3 a C4; sérový amyloid P, SAP). Děje doprovázející zánět Mechanismy obranného zánětu Fagocyty Historie I. Mečnikov – Fagocytóza a přirozená imunita – Nobelova cena 1908 • poprvé použit pojem fagocyt • fagocyty larev mořské hvězdice obklopily třísku; fagocytóza a digesce bakterií makrofágy a PMNS • původ z řeckých slov phagein – jíst, cytos – buňka http://fb.ru/article/214500/kratkaya- biografiya-ili-ilicha-mechnikova-istoriya- jizni-otkryitiya-dostijeniya-i-osobennosti- deyatelnosti Polymorfonukleární leukocyty (PMNs) • 40-65% všech leukocytů (3-5 x 103 /µl krve) • krátce žijící, v nadbytku v krvi, chybí ve zdravé tkáni • charakteristické jádro • granula a CD66 membránový marker • první obranná linie v boji proti patogenním mikroorganismům • chemotaxe • fagocytóza, intracelulární zabíjení • generování RMK a RMD • degranulace • zánět, poškození tkání Polymorfonukleární leukocyty (PMNs) • Primární granula – azurofilní – charakteristické pro mladé neutrofily – neutrální proteasy - cathepsin G, elastasa, proteinasa 3 – lysozym, defensiny, fosfolipasa A2, myeloperoxidasa • Sekundární granula – specifické pro zralé neutrofily – lysozym, NADPH oxidasa, laktoferin, elastasa, kolagenasa • Terciární granula – gelatinasová – na předním konci migrujících fagocytů – gelatinasa (destrukce membrán) • Sekreční váčky – reservoár membránových komponent Eosinofily Jejich úloha v organismu je nyní rozsáhle diskutována a přehodnocována. Původně – obrana proti parazitům (červům) • NADPH oxidasa (podobně jako u neutrofilů) • Eosinofilní peroxidasa • Hlavní bazický protein a další proteiny z granulí eozinofilů Monocyty / Makrofágy • fagocytóza, zabíjení • obnova tkání • prezentace antigenu pro specifickou im. odpověď • charakteristické jádro a CD14 membránový marker • adherují na plast a sklo • aktivují se působením cytokinů • samy cytokiny produkují • likvidují i maligní a pozměněné vlastní struktury Aktivace fagocytů v zánětu • SOS signály – N-fMLP – PGs, LTs, PAF – Komplement – Prozánětlivé cytokiny • Odpověď fagocytů – chemotaxe – adherence – diapedéza – aktivace – fagocytóza a zabití Klidový stav1. Klidový stav 2. Rolování 3. Aktivace 4. Adheze 5. Migrace Krev Tkáň Endotel Fagocyt Rolování Adheze Transendoteliální migrace Selektiny Chemokiny Integriny Integrin (neaktivní) Integrin (aktivní) Receptory na fagocytech • komplementové receptory • Fc receptory • Toll-like receptory • chemotaktické receptory (fMLP) • manózové receptory rozeznávající cukerné struktury na povrchu bakterií a některých virů • scavengerové receptory – rozeznávají acetylované LDL Pseudopodia Cytoplazma Mikrob Plazmatická membrána Lysosom Fagolysosom Fagosom Reziduální tělísko Trávící enzymy Natrávený mikrob Nestravitelný materiál Chemotaxe a adherence Ingesce Tvorba fagosomu Fůze fagosomu a lysosomu, tvorba fagolysosomu Digesce Tvorba reziduálního tělíska Exocytóza Zabíječské mechanismy fagocytů Mechanismus Specifické produkty Acidifikace Toxické RMK Toxické RMD Antimikrobiální peptidy Enzymy Další pH = 3,5 – 4,0 (bakteriostatické, baktericidní) Superoxidový aniont, peroxid vodíku, singletový kyslík, hydroxylový radikál, chlornany Oxid dusnatý Defensiny, kationické proteiny Lysozym, kyselé hydrolasy Laktoferin, protein vázající vitamin B12 Aktivace NADPH oxidasy Buněčná membrána Cytosol Protonový kanál Tvorba neutrofilních extracelulárních pastí (NETs) Citrulinace histonů Dekondenzace chromatinu Mikrobiální patogeny Kr. destičky NADPH oxidasa Antimikrobiální peptidy Histony Proteasy Správná funkce fagocytů je pro organismus nezbytná Deficience ve funkcích fagocytů = těžký průběh banálních infekcí Příklad: CGD – defektní NADPH oxidasa Naopak hyperaktivace fagocytů – problémy poškození okolních buněk a tkání reaktivními metabolity a proteolytickými enzymy Komplement Komplement: historie Objeven v r. 1894 – 1899 Jules Bordet (1870-1961) Pracoval v Mečnikově laboratoři (Pasteurův ústav v Paříži) Serum z morčat imunizovaných proti choleře ve zkumavkách aglutinovalo Vibria cholerae (průkaz specifických protilátek k antigenu). Po vazbě na Ag byly senzitizovány další molekuly (došlo k bakteriolýze) nazvané Bordetem alexin, nyní komplement. Komplement se váže na Ag-Ab komplex – to je podstatou komplement fixační reakce. Tato reakce se dodnes používá v diagnostice infekčních nemocí. Komplement fixační test sérum s protilátkami sérum bez protilátek Ag se váže s protilátkami Ag nenavázaný komplement se váže s Ag/Ab nenavázaný komplement ovčí erytrocyty + Ab žádná lýze lýze erytrocytů komplementem ovčí erytrocyty + Ab • je složen z různých plasmatických proteinů (30) • ty mezi sebou reagují • opsonizují patogen • indukují zánětlivou odpověď Komplementový systém • C-aktivace: alterace C proteinů a jejich interakce s další složkou (komponentou) • C-fixace: komplementová utilizace komplexů Ag-Ab • Hemolytická aktivita: C lyzuje erytrocyty potažené protilátkou • C-inaktivace: denaturace teplem Komplement - základní pojmy Nomenklatura: • C1komplex(qrs), C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 • faktory B, D, H a I, properdin (P) • manózu vázající lektin (MBL), MBL asociované serinové proteasy (MASP-1 MASP-2) Proteiny komplementového systému Aktivační produkty komplementových proteinů (nomenklatura) Aktivované složky jsou obvykle „overlined“: např. C1qrs Po enzymatickém štěpení se větší štěp obvykle váže na aktivační komplex nebo membránu a menší peptid je uvolněn do okolí. Písmeno “b” je obvykle používáno pro větší peptid a písmeno “a” pro menší peptid, např. C3b/C3a, C4b/C4a, C5b/C5a) Několik komplementových proteinů jsou proteasy, které samotné jsou aktivovány proteolytickým štěpením. Tyto enzymy jsou nazývány zymogeny. Obecný biochemický princip kaskády komplementové aktivace Cesty komplementové aktivace Komplementová kaskáda může být aktivována jedním ze tří způsobů: Klasická cesta – iniciována vazbou C1q • Vazbou na komplex Ab-Ag • Vazbou na povrchové komponenty bakterií (proteiny, polyanionické struktury) • Vazbou na C-reaktivní protein (protein akutní fáze, který se váže na fosfocholinová rezidua bakteriálních polysacharidů) Lektinová cesta – iniciována vazbou MBL (mannose-binding lectin) = sérový protein, jehož koncentrace vzrůstá v průběhu akutní fáze imunitní odpovědi, na povrchové struktury bakterií a virů, které obsahují manózu Alternativní cesta – iniciována vazbou spontánně aktivovaného C3 na povrch patogenů Cesty aktivace komplementu Klasická cesta Alternativní cesta LYTICKÁ cesta Lektinová cesta Aktivace C3 generování C5 konvertasy aktivace C5 závislá na protilátkách nezávislé na protilátkách 35 Figure 2-19 Klasická cesta Lektinová cesta Alternativní cesta Komplex Ag/Ab Povrch patogena Manóza na povrchu patogena Povrch patogena C3 konvertáza Terminální složky Mediátory zánětu CR fagocytů MAC Lýza patogena / buněk Opsonizace Odstranění Ag/Ab Aktivace klasické cesty C1q je komplex se 6 hlavičkami = vazebné místo C1q je asociováno po 2 molekulách C1r a C1s Vazba na povrch znamená v konečném důsledku aktivaci C1r, následně C1s a štěpení C4. Aktivace lektinové cesty MBL (mannose binding lectin) připomíná C1 komplex. S 6 hlavičkami s afinitou pro cukerné struktury povrchu patogenů je asociováno po 2 molekulách MBLassociated serine protease (MASP-1 a MASP-2). Vazba na povrch znamená aktivaci MASP a štěpení C4. Aktivace klasické (i lektinové) cesty C4 → C4a + C4b C1s C2 → C2a + C2b C1s C3 → C3a + C3b C4b2b 1 molekula C4b2b štěpí až 1000 molekul C3 Pokud je na povrchu vlastních buněk, je rychle inaktivován – vznik iC3b Pokud je C3bBb na povrchu patogena – nejsou přítomny regulující proteiny Potom se váže faktor P – properdin, který stabilizuje C3bBb konvertázovou aktivitu C3bBb je ekvivalentem C4b2b klasické cesty C3 konvertáza Lytická fáze aktivace komplementu 40 Figure 2-30 C4b2b3b z klasické (resp. lektinové) cesty nebo jeho ekvivalent C3b2Bb z alternativní cesty jsou C5 konvertasy C4b2b3b a C3b2Bb = C5 konvertasy C5 se váže na C3b C5 je štěpena C2b nebo Bb 41 Figure 2-35 Video (The Immune response – Complement Systém) vazba C6 a C7 na C5b vazba C5b67 na membránu vazba C8 vazba a polymerizace C9 1 – 16 molekul C9 lýza membrány – z vrchu lýza membrány – z boku schéma póru patogen Výsledek aktivace komplementu aktivace komplementu klasická cesta lektinová cesta alternativní cesta komplexy Ag/Ab vazba lektinu na povrch patogena povrch patogena aktivace zánětlivých buněk opsonizace patogena zabití patogena 43 Figure 2-20 Vazba na Ag/Ab Vazba na manózu Aktivační enzymy Proteiny vázající se na membránu a opsoniny Mediátory zánětu Proteiny atakující membránu Komplementové receptory Proteiny regulující komplement Funkční třídy proteinů komplementového systému Funkční třídy proteinů komplementového systému 44 Figure 2-31 receptor specificita funkce buněčný typ stimulace fagocytózy stimulace fagocytózy aktivace G proteinu anafylatoxin aktivace G proteinu anafylatoxin součást koreceptoru B-lymfocytů stimulace fagocytózy B-lymfocyty FDC Makrofágy, monocyty, neutrofily, FDC Makrofágy, monocyty, neutrofily, DC endotel., žírné b, fagocyty endotel., žírné b, fagocyty Makrofágy, monocyty, neutrofily, FDC, erytrocyty, B-lymfocyty Biologické efekty produktů komplementové aktivace • C3a (anafylatoxin) - degranulace žírných buněk; zvýšená vaskulární permeabilita; anafylaxe • C3b (opsonin) - opsonizace; aktivace fagocytů • C4a – anafylaxe • C5a - anafylaxe jako u C3, ale intenzivnější; atraktant a aktivátor neutrofilů, vyvolává agregaci neutrofilů, stimulaci oxidativního metabolismu a uvolnění leukotrienů, degranulaci žírných buněk • MAC – cytolýza Opsonizace a fagocytóza opsonizace navázání fagocytóza komplement bakterie C3b iC3b C4b CR fagocyt Komplement – shrnutí účinků • užitečné: • opsonizace a usnadnění fagocytózy • chemoatrakce a aktivace fagocytů • lýza bakterií a infikovaných buněk • regulace protilátkové odpovědi • clearance immuních komplexů • clearance apoptických buněk • škodlivé: • zánět, anafylaxe