Polymerázová řetězová reakce v reálné čase Složitá vědecká konstrukce, nebo technologie s širokým využitím v praxi? Metody molekulární biologie pro farmaceuty Doc. RNDr. Jan Hošek, Ph.D. hosek@maH.muni.cz Ústav molekulární farmacie FaF MU Fáze PCR amplifikace ^ 95 deg ^ +Primere I DNA Synthesis V I 95 deg V +Primers I I I DNA Synthesis I I 3.500 3.000 2500 -I 2.000 I 1.500 1.000 0.500 -0.500 -hm WHhNHrHlHHWHIf I I I 1 I I I I I I I I II Plateau phase 11,111111111 I 26 28 30 32 34 36 38 40 Kinetika PCR > Teoreticky se množství produktu během každého PCR cyklu zdvojí. > Ve skutečnosti se zdvojování produktu během každého cyklu pouze blíží 100%. iooooo - E IO0OC 10 Exponential Range J—l_l_I_I_L 1 J_I_I_I—L 20 Cycle Number 30 Real Time PCR základní principy metody > Principem metody je vizualizace nárůstu amplifikačního produktu pomocí měření nárůstu fluorescence v průběhu PCR. > Výstupní intenzita fluorescence je přímo úměrná koncentraci templátu. > Korelace mezi množstvím PCR produktu a intenzitou fluorescence je využita k výpočtu množství templátu přítomného na počátku PCR. Real Time přístroje Výhody Real Time PCR > stejná nebo vyšší citlivost bez manipulace se vzorky - snížení rizika kontaminace > není třeba provádět elektroforézu > automatizace procesu pro klinické využití > kvantifikace templátu - množství patogena, hladina mRNA > rozmanité typy sond - více lokusů v jedné reakci (multiplex) Důležité komponenty pro Real Time PCR > Fluorofory > Zhášeče > Sonda Fluorofory > Velká část fluoroforů jsou heterocyklické polyaromatické uhlovodíky > Jejich konečná fluorescence (emise) závisí na schopnosti molekuly fluoroforů absorbovat a emitovat fotony > Emise fluoroforů je silně závislá na teplotě Princip fluorescence Absorbce světla o definované vlnové délce molekulou fluoroforu Přechod molekuly do excitovaného stavu s vyšší energii Návrat molekuly do základního stavu následovaného emisí světelného záření o jiné vlnové délce 1.0 9 °'6 □ UL I 0.4 1 0.2 0.0 Excitatbn I I L I 1 I ■ I J I I I I Emission i i i .i i i i i t i i i i i i 300 350 400 450 500 550 600 650 700 Wavelength Zhášeče > Molekuly schopné absorbovat nebo disipovat energii z excitovaného fluoroforu > Zhášeč přijímá energii z fluoroforu a absorbuje nebo disipuje ji mechanismem „Proximálního zhášení" nebo „FRET" Proximální zhášení Proximal quenching > Založeno na krátké vzdálenosti mezi fluoroforem a zhášečem, která mezi nimi dovoluje efektivní přenos energie, již zhášeč převádí na teplo a tím „zháší" excitovaný fluorofor. Proximální zhášení Proximal quenching FRET Fluorescence resonance energy transfer > Donorová molekula (excitovaná externím světelným zdrojem) předává část své energie na akceptorovou molekulu, která vyzáří světlo o jiné vlnové délce. > Účinnost tohoto procesu je mimo jiné silně závislá na vzdálenosti molekuly donoru a akceptoru ( účine 100Á, cca 30 bp v lineárním formátu sond). FRET Fluorescence resonance energy transfer Sonda Krátký oligonukleotid s podobnými vlastnostmi jako PCR primer (vazba na DNA řetězec stejným způsobem jako PCR primer) Umožňuje vázat fluorofor a zhášeč v efektivní vzdálenosti od sebe a tím zajistit proces zhášení fluoroforu do doby detekce Spojení fluoroforů, sondy a zhášeče FA M TTC ATG CTT GGA CCG CAT CTG ATT CCT - | Z* 5' 3 HQ1 TTC ATG CTT GGA CCG - - TTC ATG CTT GGA CCG Nejčastěji používané kombinace fluorofor/proximální zhášeč ve vazbě se sondou 6-FAM (518) 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 Wavelength (nm) Metody Real Time PCR i. Nespecifické metody: založené na nespecifické vazbě fluoroforů do vznikající molekuly dsDNA ii. Specifické metody: založené na specifické vazbě sondy označené fluoroforem Nespecifické metody - DNA interkalátory - > Fluoroforse interkaluje, „váže" do vznikajícího řetězce DNA v průběhu PCR > Vazba v malém žlábku molekuly DNA Formáty nespecifických systémů > Quencher-Labeled Primer I > Quencher-Labeled Primer II > LUX™ Primers > Amplifluor™ > SYBR Green I Princip použití SYBR™ Green I Důležitá otázka: Je vazba molekuly SYBR Green do vznikající molekuly DNA reversibilní nebo ireversibilní děj a proč tomu tak je? Detekce rozdílů v sekvenci DNA pomocí SYBR Green I - modelový příklad - Úsek A o délce 200 bp ohraničený primery CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTG ACTCCACCTTTGAGAGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCC ACAACCTTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTAT CTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACT ACTGCCTC Úsek Ai s inzercí 5 bp o délce 205 bp ohraničený primery CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTG ACTCCACCTTTGAGAG^C4C7ACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGA ATTCCACAACCTTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCC TGTATCTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCC GACTACTGCCTC Výsledek detekce pomocí SYBR Green I Základní data 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 Počet PCR cyklů Vyhodnocení detekce pomocí SYBR Green I - Meltingová analýza Fl uo re scénce http: / / www.gene-quantification. de / hrm, html Výhody a nevýhody použití nespecifických systémů Výhody > Cenové „nenáročná" > Není nutná analýza sekvence pro návrh sond Nevýhody > Vazba do ssDNA > Problematická analýza primer/dimer struktur > Problematická kvantifikace Specifické metody - Značené DNA sondy - Metoda založená na hybridizaci primerů a sondy specifické pro hledaný úsek DNA Popsány 2 hlavní typy sond: - Lineární sondy - Strukturní sondy Formáty specifických systémů Lineární sondy > ResonSense® Probes > Angler® Probes > HyBeacons™ > Light-up Probes > Hydrolysis (TaqMan®) Probes > Lanthanide Probes > Hybridization Probes (FRET) > Eclipse™ > Displacement Hybridization/Complex Probe Strukturní sondy > Molecular Beacons > Scorpions™ > Cyclicons™ > Nanoparticle Probes > Conjugated Polymers/Peptide Nucleic Acid Probes Lineární sondy Hydrolysis (TaqMan®) Probes 111111111111111111111111111111 ............................ 11111 .............................. Linear probes Hydrolysis (TaqManf®) Probes 9 Fluorophore Q Quencher Excitation Forward primer TaqMan probe Quenching 3' 5' 3' 5' Excitation Emission ^ A, £ o u Ö Ö a; Alelově specifické TaqMan sondy V reakci jsou 2 sondy nesoucí 2 různé fluorofory Každá sonda se váže pouze k jedné alele Fluorescence Fluorescence OOOO O h- Ni OJ \» \» \» \» \» \» \» \» Postup kvantifikace pomocí Real Time PCR s využitím Ta q M a n sondy 1. Stanovení Ct (Treshold cyklus) 2. Vytvoření kalibrační křivky 3. Kvantifikace neznámého vzorku pomocí vložené kalibrační řady Stanovení C t Treshold cyclus Vzorek -Ct 4 n > Ct - číselná hodnota udávající PCR cyklus ve kterém je přístrojem detekována první změna fluorescence v amplifikovaném vzorku > Číselnou hodnotu Ct určuje přístroj automaticky 2 8 14 20 26 32 38 44 50 Počet PCR cyklů Vytvoření kalibrační křivky Real picture of calibration ( Plot Settings "\ Plot Type ARnvs Cycle v Graph Type: Log v Color: Well Amplification Plot 0.01 § 0.001 0.0001 0.00001 0.000001 0.0000001 Legend SO 32 3* 36 38 40 42 A B I I C I D I I E F f Plot Settinys\ Target All 37.5 37.0 36,5 36,0 35,5 35.0 34,5 34,0 33.5 33,0 32,5 32.0 31,5 31,0 30,5 30,0 26'.5 23,0 28,5 28,0 27,5 27,0 2H,5 26,0 25,5 25.0 Plot Color Default W " Standard C urve 10 a so 1« ÜB 1»3 Quantity Tarnet: Target 1 Slope: -3,568 Y-lnter: 39,671 R2- 0,9E Etf%: 90,675 - Legend 1 Stand; rd | Unknown | Unknown (Flagged) Kvantifikace neznámého vzorku pomocí vložené kalibrační řady 38 36 34 = 32 o - 30 28 26 24 22 ■ 20 Standard 10exp4 Standard 10exp3 Standard 10exp2 Standard 10expl Vzorek 1 Vzorek 2 ~~\—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 Počet PCR cyklů Vzorek Typ vzorku Ct Koncentrace (kopií/ul) 1 Neznámý 25,64 3,50E+03 2 Neznámý 29,23 2,50E+02 K1 Standard 23,97 1.00E+04 K3 Standard 27,16 1.00E+03 K3 Standard 30,68 1.00E+02 K4 Standard 33,53 1.00E+01 lOexpl 10exp2 10exp3 Koncentrace 10exp4 Lineární sondy Hybridization Probes (FRET) - 111111111111111111111111111111 jjjj. jjjjjj. FITC j 5 Použití FRET analýzy pro detekci jednonukleotidové mutace (SNP) v úseku DNA - modelový příklad - Standardní alela o délce 200 bp CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTG ACTCCACCTTTGAGAGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCC ACAACCTTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTAT CTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACT ACTGCCTC Mutantní alela (s mutací v jediném nukleotidu) o délce 200 bp CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTG ACTCCACCTTTGAGAGCCACTACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGA ATTCCACAACCTTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCC TGTATCTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCC GACTACTGCCTC Návrh sond pro detekci SNP pomocí FRET GAGAGATCACTCAT-FITC RED-CCATGCAGTGGA GACTCCACCTTTGAGAGATCACTCAÍOTCCTCAGGCCATGCAGTGGA Princip analýzy SNP pomocí FRET sond Mutantní alela (dCTP) Tm= 55°C I I I I I I I I v/ TT ......... I I I I I I I I ......... RED I I I I I I I I I Standardní alela (dATP) Tm= 62°C I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ......... ......... RED Výsledek detekce SNP pomocí FRET Základní data Standardní alela (dATP) Mutantní alela (dCTP)_ 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 Počet PCR cyklů Vyhodnocení detekce SNP s použitím FRET pomocí meltingové analýzy 0 -Un- MIMI Homozygot pro mutantní alelu (dCTP) Homozygot pro standardní alelu (dATP) Heterozygot (dATP/dCTP) 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 Teplota Structure probes - molecular beacon Contains: ■ Loop with target complementary sequence ■ Stem which „closes" the hairpin ■ Reporter and quencher High sensitivity — protects probe during reaction ■ SNPs detection ■ Allelic discrimination Loop Sequence Stem Sequence J c 2 3' Quencher Loop Sequence 5' Reporter Amplified Target DNA Jf 1. Unbound beacon with 2. Bound beacon with | quenched fluorescence unquenched fluorescence ■ Bi-function molecules — contain primer and probe in one molecule ■ The signal is detected one cycle after probe binding Digital PCR Theorecically - One DNA molecule in one reaction well Molecules in wells follow Poisson distribution => „ cleaning" data by mathematical operations Result of the reaction is 1 or 0 (positive or negative) Preparation Distribution PCR reaction Readout gDNA, cDNA, RNA, plasma oooo Sample partitioned into many reactions OOOÖ cbo8 # Positive reactions © Negative reactions am OBI Absolute quantification http://www.lifetechnologies.com/ Digital PCR Wild type Mutant B © O © O O o OOQOO OÖOO0 0O0OO 00®Q® OOQOO OOOOO Source: (Sedláka & Keith, 2013).10 Využití qPCR pro ELISA 3' oligo 5' oligo 5PL regression u c QJ U C/J ED HF- Cycle number Analyte cone. Figure 1. How ProQuantum immunoassays work. B How docs it work? ProQuantum immunoassays utilize proximity ligation assay (PLA") technology to combine antigen-antibody binding for analyte detection with qPCR signal amplification and readout (Hgure 1). The assay is a two-step process: A. Analyte binding by paired antibodies conjugated to oligonucleotides Two antibody conjugates are provided in each kit: a 3' end oligonucleotide and a 5' end oligonucleotide, each conjugated to a target-specific antibody. When the antibody pair binds to two different epitopes of the protein, the 3' and 5' oligos come into close proximity. B. Ligation of the oligonucleotides by DNA ligase and amplification by Applied Biosystems" TaqMane q PCR Assay Only when the pair of antibodies binds to the analyte (A) can the associated oligos become bound to the complementary splint oligo and subseqently joined to each other with DNA ligase (B). Following the oligo ligation, 95°C heat inactivation denatures the ligase. antibodies, and other proteins, leaving 100-base strands in concentrations proportional to the level of antibody-analyte binding in the first stage. This 100-base DNA strand serves as the amplification template for 40 cycles of qPCR using TaqMan Assays, Děkuji za Vaši pozornost