1 Protein-DNA interakce Protein-DNA interakce F1MG1_Metody molekulární biologie PDB id: 5KKQ, Hashimoto Mgr. Denis Šubert Mgr. Marie Brázdová, Ph.D. https://www.researchgate.net/f igure/Mutant-p53-proteins- carry-out-novel-oncogenic- interactions-A-Signaling-in-the- p53_fig2_277087873 MB-2023-analýza proteinů a interakcí1 Protein-DNA interakce 2 Protein-DNA interakce —Screening interakčních partnerů —Lokalizace interakce v rámci chromatinu —Sekvenční strukturní preference —Funkce proteinů (TRF, Helikázy, Chromatinové, DNA-repair) • K studiu interakcí mezi proteiny a nukleovými kyselinami použita široká škála metod biofyzikální chemie. • zvláště dobré pro stanovení síly (afinity) interakcí • Vysoká afinita, μM – nM: mají tendenci zahrnovat sekvenční interakce, • Nízká afinita, mM – μM: proteiny mají tendenci rozpoznávat aspekty "celkové" struktury, tj. MB-2023-analýza proteinů a interakcí Vazba DNA-protein motivy 3 Protein-DNA interakce Vodíkové můstky: —Adenin - Gln/ Asn —Guanin - Arg Solné můstky: —Fosfátový zbytek – Arg/ Lys Prostřednictvímkoordinovaněvázaných kovů —Motiv Zinkového prstu – Zn2+ Gln/Asn tvoří specifické vazby H-bond s N-6 H-7 H Adeninu Arg tvoří specifické vazby s párem Cytosin-Guanin MB-2023-analýza proteinů a interakcí Nejčastejší DNA-vazebné motivy HTH Zinc-Finger Leucinový zip Vazba Velký žlábek Velký žlábek Velký žlábek Složení Helix-otáčka-Helix ß-sheet-ß-sheet-Helix Helix-Helix Struktura 4 Protein-DNA interakceMB-2023-analýza proteinů a interakcí MB-2023-analýza proteinů a interakcí 5 Metody pro studium DNA-proteinových interakcí —- Chip seq —Pull down assay —EMSA —FRET —ITC —Ko-krystalizace —NMR —Kvasinkový dvouhybridní systém —Genová exprese ̶ SELEX ̶ databáze (interaktom a komplexy …) ̶ genetické metody MB-2023-analýza proteinů a interakcí 6 DNA-protein interakce 7 (např. ChIP = Chromatin Immunoprecipitation) Detekce DNA/RNA vazebných míst ChIP (chromatinová imunoprecipitace) MB-2023-analýza proteinů a interakcí Image credit: Song, C., Zhang, S., and Huang, H. (2015). Choosing a suitable method for the identification of replication origins in microbial genomes. Front. Microbiol. Chromatin imunoprecipitace (ChIP) je technika, která určuje, zda protein zájmu interaguje s konkrétní sekvenci DNA. Tato technika se často používá ke studiu repertoáru míst na DNA, které jsou vázány konkrétními transkripčními faktory nebo histonovými proteiny, a k pohledu na přesná genomická umístění různých modifikací histonu (včetně acetylace, fosforylace nebo methylace). ChIP- seq sekvenování fragmentů ChIP-cloning clonování ChIP on ChIP - čipová technologie MB-2023-analýza proteinů a interakcí8 SELEX elute clone & sequence C.Tuerk, L. Gold Systematic evolution of high-affinity RNA ligands of bacteriophage T4 DNA polymerase in vitro. Science 249:505-510 (1990). Random oligonucleotide pool Affinity matrix Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX), also referred to as in vitro selection or in vitro evolution, is a combinatorial chemistry technique in molecular biology for producing oligonucleotides of either single-stranded DNA or RNA that specifically bind to a target ligand or ligands. These single-stranded DNA or RNA are commonly referred to as aptamers.[1][2][3] Although SELEX has emerged as the most commonly used name for the procedure, some researchers have referred to it as SAAB (selected and amplified binding site) and CASTing (cyclic amplification and selection of targets)[4][5] SELEX was first introduced in 1990. In 2015 a special issue was published in the Journal of Molecular Evolution in the honor of quarter century of the SELEX discovery.[6] MB-2023-analýza proteinů a interakcí9 10 Imunoprecipitace-protein -DNA (DNA), pull down - metoda izolace specifických proteinů z směsí (lyzátů, purifikovaných…) prostřednictvím protilátek - protilátky jsou v komplexu se svými antigeny odděleny od ostatních molekul pomocí proteinů A nebo G (zdroj bakterie), které vážou imunoglobuliny a současně jsou imobilizovány na pevném podkladu (KULIČKY, „beads“) - proteiny A a G se vážou na oblast Fc těžkých řetězců - oblast Fab je stále k dispozici pro vazbu antigenu - precipitace DNA MB-2023-analýza proteinů a interakcí MB-2023-analýza proteinů a interakcí11 Imunoprecipitace proteinu –na DNA - imobilizace - metoda izolace specifických proteinů z směsí (lyzátů, purifikovaných…) prostřednictvím DNA-navázána na kuličky - precipitace proteinu - Detekce WB MB-2023-analýza proteinů a interakcí12 Různé systémy afinitních značek a jejich interakčních partnerů využívané pro purifikaci proteinů Protein-DNA Footprinting MB-2023-analýza proteinů a interakcí 13 - Slouží k identifikaci cílové oblasti interakce v rámci DNA sekvence ̶Je nutné značení jednoho řetězce DNA (Radioaktivně/ fluorescenčně) ̶Využívá enzym DNasu I nebo chemické štěpení (piperidin) ̶Oblasti kde dochází k interakci jsou chráněny před štěpením – chybějící proužky (bandy) předpoklad: DNA vázaná bílkovinou bude chráněna před chemickým štěpením v místě vazby. Izolujte fragment DNA, který obsahuje vazebné místo, a "označte„. Vázat protein na DNA v jedné zkumavce; udržet další jako "nahé DNA" kontrolu Oba vzorky ošetřete chemickým nebo enzymatickým činidlem. Oddělte fragmenty gelovou elektroforézou a vizualizovat pásy na rentgenovém filmu nebo obrazové desce "Footprinting" je technika k identifikaci DNA-vazebného místa Footprinting Results of RNA Polymerase Bound to Promoter MB-2023-analýza proteinů a interakcí 14 Chemické štěpení: AG:Kyselina mravenčí CT:Hydrazin C:Hydrazin+NaCl G:Dimethylsulfát Následné působení piperidinu DNA/RNA footprinting MB-2023-analýza proteinů a interakcí15 Kvasinkové dvouhybridní systémy Y2H ̶ metoda molekulární biologie běžně používaná pro studium interakcí mezi proteiny. ̶ Fungování Y2H je umožněno tím, že transkripční faktory mají modulární strukturu a tyto moduly-domény mohou fungovat odděleně, případně ve fúzi s jiným proteinem. ̶ V nejběžnější podobě Y2H je takto rozdělen kvasinkový transkripční faktor Gal4. Jeho DNA vazebná doména je fúzována s jedním proteinem (bait – „návnada“), obvykle známým, jehož vazebné partnery bude Y2H vyhledávat, zatímco aktivační doména Gal4 je fúzována s proteinem (prey – „kořist“), který je potenciální vazebný partner zkoumaného proteinu. ̶ Interakce mezi „návnadou“ a „kořistí“ obnoví původní funkci Gal4, který následně transaktivuje příslušné reportérové geny. Vzhledem ke své univerzalitě a jednoduchosti může být Y2H použit k rychlé analýze rozsáhlých cDNA knihoven kódujících proteiny ve fúzi s Gal4 DNA vazebnou doménou. Výsledky Y2H ovšem musí být ověřovány dalšími metodami, protože jsou obvykle zatíženy značnou chybou, ať už falešně negativními, nebo falešně pozitivními výsledky. ̶ Kvasinkový dvouhybridový systém, jeho možná použití, variace a omezení byly nedávno velmi podrobně popsány (Brückner et al. 2009). Reporterový gen: lacZ (B-galaktosidasa) Luciferaza GFP MB-2023-analýza proteinů a interakcí16 V nejběžnější podobě Y2H je takto rozdělen kvasinkový transkripční faktor Gal4. Jeho DNA vazebná doména (BD) je fúzována s jedním proteinem (bait – „návnada“), obvykle známým, jehož vazebné partnery bude Y2H vyhledávat, zatímco aktivační doména (AD) Gal4 je fúzována s proteinem (prey – „kořist“), který je potenciální vazebný partner zkoumaného proteinu. https://cs.wikipedia.org/wiki/Dvouhybridový_systém Aplikace/Využití: - protein-protein interakce - DNA-protein interakce - Analýza genové exprese- regulace - reporterový test (DNA vazebné elementy, DNA regulační elementy) Geny nebo markery reportéra poskytují vhodný prostředek identifikovat a analyzovat regulační prvky genů. Systém reportérů měří transkripční činnost (interakce cisprvků na předkladatele s předkladatelem trans-působící faktory). MB-2023-analýza proteinů a interakcí17 http://photobiology.info/Ohmiya.html Dual-Luciferase® Reporter (DLR™) Assay The Dual-Luciferase® Reporter (DLR™) Assay System(a–c) provides an efficient means of performing dual-reporter assays. In the DLR™ Assay, the activities of firefly (Photinus pyralis) and Renilla (Renilla reniformis, also known as sea pansy) luciferases are measured sequentially from a single sample. The firefly luciferase reporter is measured first by adding Luciferase Assay Reagent II (LAR II) to generate a stabilized luminescent signal. After quantifying the firefly luminescence, this reaction is quenched, and the Renilla luciferase reaction is simultaneously initiated by adding Stop & Glo® Reagent to the same tube. MB-2023-analýza proteinů a interakcí18 Luciferase Reporter Assay ̶ The Dual-Luciferase® Reporter (DLR™) Assay System(a–c) provides an efficient means of performing dual-reporter assays. In the DLR™ Assay, the activities of firefly (Photinus pyralis) and Renilla (Renilla reniformis, also known as sea pansy) luciferases are measured sequentially from a single sample. The firefly luciferase reporter is measured first by adding Luciferase Assay Reagent II (LAR II) to generate a stabilized luminescent signal. After quantifying the firefly luminescence, this reaction is quenched, and the Renilla luciferase reaction is simultaneously initiated by adding Stop & Glo® Reagent to the same tube. MB-2023-analýza proteinů a interakcí19 FRET Förster/fluorescence resonance energy transfer Förster/fluorescence resonance energy transferFRET MB-2023-analýza proteinů a interakcí 20 je mechanismus nezářivého přenosu energie mezi dvěma molekulami prostřednictvím dipól-dipólové interakce. Molekula, z níž se energie přenáší, se nazývá donor (dárce), kdežto molekula, která energii přijímá, se nazývá akceptor (příjemce). Účinnost tohoto mechanismu je nepřímo úměrná šesté mocnině vzdálenosti mezi donorem a akceptorem, k jevu tedy prakticky dochází jen tehdy, jsou-li obě molekuly v těsné blízkosti. Z intenzity FRET (kterou lze určit různými metodami analýzy fluorescence vzorku) lze proto získat informaci o míře interakce mezi donorem a akceptorem. To je velmi cenné především při studiu živých buněk Primary Conditions for FRET •Donor and acceptor molecules must be in close proximity (typically 10–100 Å). •The absorption spectrum of the acceptor must overlap the fluorescence emission spectrum of the donor (Figure 1). •Donor and acceptor transition dipole orientations must be approximately parallel. MB-2023-analýza proteinů a interakcí21 MB-2023-analýza proteinů a interakcí22 MB-2023-analýza proteinů a interakcí23 ̶ Stanovení afinity interakce protein- DNA ̶ Interakce probíhá in vitro ̶ Nutnost značení DNA (Radioaktivita/ fluorescence) ̶ Separace gelovou elektroforézou (PA, Agarose) ̶ Sledujeme zbrzdění (shift) migrace komplexu DNA-protein v elektrickém poli ̶ Migrace molekuly (komplexu) v elektrickém poli je závislá na její velikosti a náboji EMSA (“Gel Shift” Assay) • Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) or “gel shift” can provide information about protein-NA interactions MB-2023-analýza proteinů a interakcí [Protein] DNA + protein +Ab DNA + protein + Ab M DNA DNA alone Poměrně přímočará technika, ale poskytuje pouze přesvědčivá data pro interakce s vysokou afinitou (typicky <μM) TEST 24 p53CD p53b p53 (ng) 250 500 1000 125 250 500 I p53CON p53CD+CON p53CON TAT triplex p53b+CON 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 250 500 1000 125 250 500 I p53CD p53b TAT triplex p53b+TAT p53CD p53b p53 (ng) 250 500 1000 125 250 500 I p53CD p53b p53 (ng) 250 500 1000 125 250 500 I p53CD p53b p53 (ng) 250 500 1000 125 250 500 I p53 (ng) 250 500 1000 125 250 500 I p53CON p53CD+CON p53CON TAT triplex p53b+CON 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 250 500 1000 125 250 500 I p53CD p53b TAT triplex p53b+TAT CD x C-terminus MB-2023-analýza proteinů a interakcí25 MB-2023-analýza proteinů a interakcí26 MB-2023-analýza proteinů a interakcí27 MB-2023-analýza proteinů a interakcí28 Shrnutí : analýza genové exprese - studium transkripce (mRNA-northern přenos, RT-PCR, hybridizace IN SITU, primer extension) - srovnání transkriptomů (RT-PCR, siRNA, DNA microarrays, ..) - Analýza promotorů a interakcí protein-DNA (reporterové geny, lokalizace promotoru, identifikace promotorových regulačních oblastí-elementů, footprinting, EMSA..) - Analýza translace (proteiny-WB, chip, IP) MB-2023-analýza proteinů a interakcí29