1
Rostliny ve zdraví a nemoci
Farmaceutická fakulta MU
Ústav přírodních léčiv
prof. PharmDr. Karel Šmejkal, Ph.D.
Metody zkoumání
1
2
2
1. Správné botanické určení (v každé expedici musí být zkušený systematický botanik)
Všechny rostliny určené k experimentům musí být uloženy ve formě herbářových
položek
2. Makroskopická analýza drogy
Znalost morfologických znaků (tvar a stavba rostlinných orgánů typických pro čeledě,
rody)
listy –tvar a délka řapíku, tvar a tloušťka čepele, množství a tvar trichomů aj.,
stomata (průduchy) a stomatální index
kořeny – barva povrchu, vnitřku nebo lomu
charakteristický zápach, chuť – pro hořčiny kvantitativní hodnocení
květy – velikost, tvar, barva, stavba
METODOLOGIE FARMAKOGNOSIE
Ústav přírodních léčiv3
METODOLOGIE FARMAKOGNOSIE
3. Mikroskopická analysa drogy
pozoruje se anatomická stavba rostlinných orgánů, tvar jejich pletiv
typické znaky na povrchu – tvar pokožkových buněk, odění
řez drogou – jednoděložné, dvojděložné, Pteridophyta
drogy práškovité – Amyla, Lupulin, Faex medicinalis
drogy práškované – listy Solanaceae podle formy CaOx, pevné elementy stavební (cévy,
libriform, vyztužovací lišta, souvislý mechanický pás)
→ identifikace drogy a určení její matečné rostliny a čeledě
4. Chemická kontrola drogy
- důkaz obsahových látek
(metody fyzikální – fluorescence, mikrosublimace, chromatografie)
(m. biologické – hemolytická aktivita, aglutinační účinek, hořkost)
(m. chemické – barevné a srážecí reakce po předchozí extrakci dokazovaných
látek, histochemie)
- kvantitativní stanovení obsahových látek
metody určeny povahou stanovované látky
5. Studium tvorby účinných látek
- pomocí inkorporace radioaktivně značených látek – domnělých prekursorů
Ústav přírodních léčiv4
3
4
3
METODOLOGIE FARMAKOGNOSIE
6. Předběžné zkoušky biologické aktivity (výběr surovin pro další studium)
̶ účinek antibakteriální, antimykotický, antivirový, cytotoxický, antihypertenzní,
antiflogistický, spasmolytický, antioxidační, antidiabetický
̶ výběr na základě příbuznosti druhů a rodů, na základě lidového léčitelství,
náhodnou volbou – intuice
7. Separace a izolace obsahových látek z pokusného materiálu
̶ destilace, krystalizace, vytřepávání, chromatografie preparační
8. Detekce izolátů a zkouška jejich čistoty
̶ fyzikální: teplota tání, index lomu, optická otáčivost, CD, GC, HPLC
̶ chemická: tvorba barevných produktů se specifickými činidly, degradace
̶ biologická: hemolýza, aglutinace erytrocytů, stanovení hořkosti
9. Charakteristika a identifikace izolátů
̶ identifikace struktury důležitá pro testování biologické aktivity
Ústav přírodních léčiv5
Technologický pokrok
Extrakce
Izolace
Identifikace
High-throughput skríning
SFE
MWE
PWE
SPE
HPLC
SFC
HSCCC MS
NMR
Knihovny
Ústav přírodních léčiv6
5
6
4
Bioaktivitou řízená
izolace
Metabolomika
Přírodní zdroje Biodiverzita
Rostliny Živočichové Mořské organismy Mikroorganismy
Bioaktivní sloučeniny
Práce s extrakty
Ústav přírodních léčiv7
Ústav přírodních léčiv8
7
8
5
Ústav přírodních léčiv9
̶ Proč využívat různé preparativní techniky?
Preparativní techniky
Získání standardů
pro kvantifikaciStudie bioaktivity Další důvody
Identifikace pomocí
spektroskopických
metod
Vědecké důvody
Farmaceutický
průmysl
Průmyslové
důvody
Ústav přírodních léčiv10
9
10
6
1. EXTRAKCE: (série rozpouštědel různé polarity – eluotropní řada) „similia similibus solventur“
Fickovy zákony
pevné látky kapalinou
jednorázová (macerace, digesce)
opakovaná
kontinuální (perkolace, Soxhlet)
kapaliny kapalinou (perforace)
vytřepávání v dělící nálevce
SPE – extrakce tuhou fází na kolonce
SFE – superkritická fluidní extrakce – superkritická kapalina (120 atm - scCO2)
promytí eluce
Ústav přírodních léčiv11
Eluotropní řada
Volba vhodného rozpouštědla
Naconezapomenout
Ústav přírodních léčiv12
11
12
7
2. DESTILACE
• za normálního tlaku, sníženého tlaku (s varnými kaménky)
• Hickmanova baňka (límcovka - lobelin)
• s kolonou (rektifikace)
• s vodní parou
• s vodou
propan
benzín
petrolej
nafta
topné
oleje
mazací
olejeÚstav přírodních léčiv13
SEPARACE A IZOLACE PŘÍRODNÍCH LÁTEK
3. SUBLIMACE (puriny, chinony)
4. KRYSTALIZACE – umění vyžadující
zkušenost a zručnost
(Příklad: máme-li ze směsi vykrystalizovat látku lipofilní, je vhodné
použít pro krystalizaci polární rozpouštědlo, protože z něj bude pro
malou rozpustnost krystalizovat nejméně polární látka, ostatní
zůstanou v matečném louhu)
5. SRÁŽENÍ
změna polarity rozpouštědla, změna pH (čištění alkaloidů)
vysolování např. solemi těžkých kovů (Pb a třísloviny)
6. FILTRACE, DIALÝZA
droga
kádinka s
vodou
sublimát
Ústav přírodních léčiv14
13
14
8
Preparativní techniky
̶ Rychlost
̶ Čistota
̶ Výtěžek
̶ Ekonomika procesu
Čistý materiál v
dostatečném
množství
Úplná extrakce
Extrakce kapaliny kapalinou
Chromatografie
Získat co největší
množství.
Čistota dostatečná pro
další zpracování
Eliminace neaktivních
látek
Efektivní
chromatografická
separace
Dobrý výtěžek
Ústav přírodních léčiv15
Extrakce kapaliny kapalinou – typické schéma
Úplná extrakce voda/ethanol
Odstranění rozpouštědla pomocí
vakua/lyophilizace
Surový extrakt
Rozpuštěný v methanolu → dělící
nálevka → 10 % vody
Hexan/petroletherový
podíl
Methanol/vodný podíl
Odstranění methonolu methanol →
dělící nálevka → voda a CHCl3
Chloroformový podíl Vodný podíl
Ethylacetát
Ethylacetátový podíl Vodný podíl
̶ Výhody
̶ kapacita (low/large
scale)
̶ Žádné ireversibilní jevy
̶ Jednoduchost
̶ Levné
̶ Nevýhody
̶ Tvorba emulsí
̶ Omezený počet rozpouštědel
̶ Nelze zjednodušeně
automatizovat
Ústav přírodních léčiv16
15
16
9
min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 25
Norm.
0
500
1000
1500
2000
DAD1 E, Sig=280,16 Ref =700,100 (C:\HPCHEM\1\DATA\PAUL\ETOHEXTR\04010500.D)
2.308
4.124
5.278
5.873
6.484
6.9177.049
7.194
7.358
7.5427.646
7.802
8.048
8.293
8.585
8.867
9.031
9.215
9.443
9.581
9.995
10.132
10.416
10.692
10.903
11.106
11.324
11.502
11.737
11.974
12.252
12.40412.519
12.695
12.892
13.043
13.243
13.48113.59313.719
13.932
14.09614.232
14.55814.663
14.830
15.01915.125
15.33715.444
15.59115.686
15.866
16.00816.132
16.313
16.455
16.595
16.72916.813
16.993
17.17917.31017.439
17.601
17.750
18.047
18.263
18.528
18.781
18.939
19.283
19.425
19.563
19.765
20.235
20.475
20.854
21.093
21.436
21.802
22.163
22.645
22.870
23.068
23.275
23.583
23.795
24.093
24.34024.435
24.590
24.868
25.155
25.296
25.671
25.91526.033
DAD1 E, Sig=280,16 Ref =700,100 (C:\HPCHEM\1\DATA\PAUL\ETOHEXTR\19110418.D)
4.1444.225
5.068
5.232
5.6065.735
5.8945.995
6.1866.274
6.441
6.6766.8106.920
7.283
7.6047.6877.818
7.970
8.1738.292
8.441
8.600
8.772
8.9939.086
9.461
9.680
9.849
10.227
10.388
11.124
17.819
19.438
19.663
19.899
20.356
20.996
21.586
DAD1 E, Sig=280,16 Ref =700,100 (C:\HPCHEM\1\DATA\PAUL\ETOHEXTR\19110414.D)
2.324
3.655
4.100
4.267
4.8364.9265.0415.163
5.307
5.581
5.766
6.014
6.2066.292
6.552
6.818
6.974
7.274
7.6087.671
7.811
7.972
8.1628.288
8.4558.591
8.769
8.9989.097
9.247
9.4629.5669.656
9.853
10.04010.10510.232
10.40210.529
10.689
10.93211.03311.132
11.284
11.481
11.907
12.182
12.550
12.773
12.932
13.203
13.35613.447
13.761
13.985
14.184
14.376
14.837
15.040
15.205
15.414
16.088
16.275
16.663
17.114
17.594
19.383
19.598
19.847
20.310
20.667
20.964
21.213
21.363
21.553
22.025
22.280
22.784
23.062
23.205
23.804
DAD1 E, Sig=280,16 Ref =700,100 (C:\HPCHEM\1\DATA\PAUL\ETOHEXTR\19110411.D)
7.287
10.770
10.97511.071
11.482
11.786
12.19012.32212.447
12.628
12.773
12.941
13.168
13.377
13.607
13.779
13.994
14.139
14.320
14.553
14.692
14.875
15.072
15.238
15.500
15.69215.765
15.956
16.12016.237
16.403
16.590
16.85416.945
17.133
17.485
17.69717.825
18.167
18.310
18.485
18.666
18.82018.907
19.060
19.425
19.643
19.881
20.33520.394
20.690
20.984
21.236
21.607
22.039
22.296
22.798
23.07723.195
23.827
24.009
24.220
24.407
24.680
24.844
25.042
25.301
25.526
25.879
26.082
Ethylacetátový
podíl
Butanolový podíl
n-Hexanový podíl
MeOH podíl
Typický příklad srovnání různých frakcí s rozdílnou polaritou
Ústav přírodních léčiv17
Sloupcová chromatografie
Ústav přírodních léčiv18
17
18
10
Stálý průtok, pokud možno bez přerušení
Frakcionace podle objemu, času, detekční metody
Vsádka vzorku:
1. kapalný
2. pevný
Důležitá síla vrstvy a množství vzorku
Stacionární fáze:
Silika gel
Alumina
Polyamid
̶ Výhody
̶ Kapacita (low/large scale)
̶ Jednoduchost
̶ Levné
̶ Jednoduchý setup
̶ Získání jednoduchých směsí
̶ Nevýhody
̶ Není možno jednoduše
automatizovat
̶ Omezený počet vhodných
rozpouštědel
̶ Ireversibilní adsorpce
̶ Omezené rozlišení
Ústav přírodních léčiv19
mobilní fáze, různá
polarita
vzorek
stacionární
fáze
kolona
oddělené složky
směsi
separace
19
20
11
Sloupcová chromatografie
Volba vhodných rozpouštědel
Založeno na TLC
Kombinace 2-3 rozpouštědel
Modifikace acido-bazických poměrů
Vhodný Rf
1/3 výšky desky
Dostatečné
rozlišení
Ústav přírodních léčiv21
140 cm
60 g of sample
200 fractions
150 ml/fraction
3 × 100 cm
3 × 35 g of sample
300 fractions
120 ml/fraction
2 × 100 cm, 1 × 140 cm
2 × 40 g, 1 × 50 of
sample
300 fractions
120 ml/fractionÚstav přírodních léčiv22
21
22
12
Ústav přírodních léčiv23
Flash chromatography
• Advantages
– Capacity
(low/large scale)
– Simplicity
– Cheap
– Simple set up
– Obtaining simple
mixtures or pure
compounds
Ústav přírodních léčiv24
23
24
13
Flash chromatografie
Ústav přírodních léčiv25
Preparativní HPLC
• High performance liquid chromatography
• High pressure liquid chromatography
• Highly problematic leaking chromatography
• Relativně velké operační tlaky v systému
• Relativně velké průtoky mobilní fáze
• Relativně malá velikost částic stacionární fáze
• Extrémně vysoké rozlišení
• Velmi rychlý proces
• Mnoho způsobů kontroly separace – detekce látek
• Možnost up-scale procesuÚstav přírodních léčiv26
25
26
14
Ústav přírodních léčiv27
Reservoir of mobile phase
Degasser
Mixer
Pump and dumper
Purge valve
Waste
Injector
Column in column block (thermostat)
Detector Fraction collector
Waste
Schéma HPLC
Ústav přírodních léčiv28
27
28
15
Reservoir of mobile phase
Degasser
Mixer
Pump and dumper
Purge valve
Waste
Injector
Column in column block (thermostat)
Detector Fraction collector
Waste
Scheme of HPLC
Ústav přírodních léčiv29
Reservoir of mobile phase
Degasser
Mixer
Pump and dumper
Purge valve
Waste
Injector
Column in column block (thermostat)
Detector Fraction collector
Waste
Scheme of HPLC
Ústav přírodních léčiv30
29
30
16
https://www.scas.co.jp/en/insrtuments-products-synthesis/hplc-column/
Ústav přírodních léčiv31
Analytical
Scale
Semipreparative
Scale
Preparative
Scale
Pilot Separation
Rozsah
množství
mg ]
1-15 7-70 30-300 64-640 180-
1800
400-
4000
700-
7000
600-
16000
2800-
28000
4.6 0,8-
2.0
9.4 4-10
21.2 18-42
30 34-85
50 94-236
75 212-931
100 378-945
150 800-
2100
200 1100-
3375
Vnitřníprůměrkolonymm]
Typické průtoky, rozměry kolon a separovaná množství
Adapted from: Principals and practical aspects of preparative liquid chromatography. H. Schulenberg-Schell, Andreas Tei.
Množství je selektováno na základě množství stacionární fáze: typicky 0,1-1 %.
Ústav přírodních léčiv32
31
32
17
DAD - morusin
nm225 250 275 300 325 350 375 400 425
mAU
0
100
200
300
400
500
600
*DAD1,19.533(688mAU,Apx)Ref=18.933&20.306ofMA1806200000006.D
4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 22,0 23,0 24,0 25,0 26,0 27,0 28,0 29,0 30,0
M A2-III-C-33-39 UV_VIS_1
min
,720
- 2,98016 - 3,36017 - 3,487
18 - 3,760
19 - 3,980
20 - 4,187
21 - 4,373
22 - 4,607
23 - 4,99324 - 5,260
25 - 5,580
26 - 5,827
27 - 6,213
28 - 6,480
29 - 6,660
30 - 7,040
31 - 7,400
32 - 8,08033 - 8,320
34 - 8,800
35 - 9,05336 - 9,24737 - 9,467
38 - 9,89339 - 10,200
40 - 10,893
41 - 11,353
42 - 11,920
43 - 12,253
44 - 12,547
45 - 12,873
46 - 13,233
47 - 13,693
48 - 14,613
49 - 15,42050 - 15,80751 - 16,267
52 - 17,420
53 - 18,080
54 - 18,57355 - 18,893
56 - 19,42057 - 19,77358 - 20,207
59 - 20,62760 - 21,06761 - 21,46062 - 21,85363 - 22,20764 - 22,500
65 - 28,78066 - 28,83367 - 29,407
WVL:254 nm
F1(1-1)
F2(2-2)
F3(3-3)
F4(4-4)
F5(5-5)
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 22,0 23,0 24,0
-1 000
-500
0
500
1 000
1 500
2 000
2 500
3 000
3 500
4 000
4 500
5 000
5 500
6 000 M A2-III-C -33-39 #7 M A2-III-C -33-39
mAU
1 - Peak 1 - 0,0332 - 0,0803 - 0,1204 - 0,2135 - 0,3606 - 0,4807 - 0,6538 - 0,7079 - 0,81310 - 0,94711 - 1,08012 - 1,16713 - 1,20714 - 1,23315 - 1,26716 - 1,29317 - 1,34718 - 1,38719 - 1,41320 - 1,527
21 - 1,79322 - 1,85323 - 1,99324 - 2,11325 - 2,27326 - 2,713
27 - 2,980
28 - 3,487
29 - 3,647
30 - 3,760
31 - 3,98732 - 4,107
33 - 4,373
34 - 4,593
35 - 4,99336 - 5,253
37 - 5,553
38 - 5,82739 - 6,267
40 - 6,46741 - 6,660
42 - 7,153
43 - 7,587
44 - 8,07345 - 8,327
46 - 8,820
47 - 9,240
48 - 9,453
49 - 9,90050 - 10,200
51 - 10,62052 - 10,893
53 - 11,360
54 - 11,920
55 - 12,247
56 - 12,52757 - 12,873
58 - 13,227
59 - 13,687
60 - 14,613
61 - 15,09362 - 15,40763 - 15,80064 - 16,253
65 - 16,960
66 - 17,413
67 - 18,073
68 - 18,567
69 - 18,907
70 - 19,40071 - 19,76072 - 20,207
73 - 20,62774 - 21,05375 - 21,45376 - 21,84777 - 22,20778 - 22,500
F1(1-1)
F2(2-2)
F3(3-3)
F4(4-4)
F5(5-5)
Broad bandwidth
Narrow bandwidth
Ústav přírodních léčiv33
Tungsten lamp
Deuterium lamp
Flow cell
Diode array
Optical grid
Adapted from: Principals and practical aspects of preparative liquid chromatography. H. Schulenberg-Schell, Andreas Tei.
33
34
18
2
7 12
11
14
2/1 2/2
7/1
11/
5
MeOH part of M. alba extract
Semipreparative RP-HPLC
Semipreparative RP-HPLC
Semipreparative RP-HPLC
Semipreparative RP-HPLC
4
Preparative chromatography on reversed phase
Supelcosil ABZ+Plus, gradient of 0.2% HCOOH and ACN
Semipreparative RP-HPLC
4/1
12/
1
12/
2
35
36
19
37
min20 22 24 26 28
Norm.
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2a 2/1 2/2 4 5/3
6/3
6/46/5
11/17/1 9/3
10/4
10/8 11/5
11/2
12/1 12/2 14
min21.4 21.6 21.8 22 22.2 22.4 22.6
Norm.
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
min25 25.2 25.4 25.6 25.8
Norm.
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
Detailed depiction of preparative HPLC
Remove sorbent to
supress side effects
Cut corner of TLC plate to supress side effects
Start line above the level
of mobile phase
Paper for saturation of chamber
with mobile phase vapours
a
b
Thin layer chromatography
37
38
20
Preparative TLC
40
min24 25 26 27 28
Norm.
0
50
100
150
200
250
300
350
DAD1 E, Sig=280,16 Ref=700,100 (E:\MA-LATKY\08020524.D)
min21 22 23 24 25 26 27 28 29
Norm.
0
200
400
600
800
1000
1200
DAD1 E, Sig=280,16 Ref=700,100 (E:\MA-LATKY\08020525.D)
min20 22 24 26 28
Norm.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
DAD1 E, Sig=280,16 Ref=700,100 (E:\MA-LATKY\08020526.D)
min22 23 24 25 26
Norm.
0
50
100
150
200
DAD1 C, Sig=350,4 Ref=700,100 (E:\MA-LATKY\08020527.D)
DAD1 E, Sig=280,16 Ref=700,100 (E:\MA-LATKY\08020527.D)
min22 23 24 25 26 27 28
Norm.
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
DAD1 E, Sig=280,16 Ref=700,100 (E:\MA-LATKY\08020528.D)
Preparative Thin layer chromatography contra preparative
HPLC
39
40
21
Preparativní TLC
• Výhody
– Kapacita (low/large scale)
– Jednoduchost
– Jednoduché nastavení separace
– Získání velmi jednoduchých směsí nebo čistých
látek
CHARAKTERISTIKA A IDENTIFIKACE
Metody identifikace chemické struktury
̶ Hmotnostní spektrometrie
metoda pro určování hmot volných molekul a jejich částí, jež je třeba k tomu účelu převést na kladné nebo
záporné ionty.
̶ Absorpční spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblasti (sleduje změny které vznikají interakcí s
elektromagnetickým monochromatickým zářením); UV 180-400 nm; VIS 400-750 nm;
̶ Absorpční spektrofotometrie v infračervené oblasti
Záznam spekter v oblasti od 4000 cm-1 do 650 cm-1 (2,5 μm až 15 μm)
269.1
431.1
-MS2(433.0), 11.1min #370
0
2
4
4x10
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
162 Da
C-O-C
41
42
22
Metody identifikace chemické struktury
̶ Ramanova spektrometrie – sledují se změny ve vibračních stavech molekuly, vyvolané interakcí látky s fotony (laser),
záznam spekter v oblasti od 4000 cm-1 do 13 000 cm-1
̶ Nukleární magnetická rezonanční spektrometrie 1H, 13C NMR – zkoumá interakce atomových jader s nenulovým spinem
s magnetickým polem,
sleduje rozdělení energií
jaderného spinu
v magnetickém poli a
přechody mezi
jednotlivými spinovými
stavy vyvolané zářením
̶ ORD – optická rotační disperze – závislost optické otáčivosti na vlnové délce
̶ CD – cirkulární dichroismus – rozdíl absorbance vlevo a vpravo cirkulárně polarizovaného světla
̶ RTG – rentgen strukturní analýza
metoda studující interakce
krystalických vzorků s rentgenovým zářením
Parametry Potřebná množství látky
% jistoty μg mg g
RTG TOTÁLNÍ SYNTÉZA
90 NOESY, COESY DEGRADACE
PŘÍPRAVA DERIVÁTŮ
70 HRMS
ORD
13C NMR CD
50 1H NMR
Raman
30
MS UV IR
HPLC
GC
10
TLC
43
44