PCR Po lym e rázová řetězová reakce - Průlom v práci s nukleovou kyselinou - Metody molekulární biologie pro farmaceuty Doc. RNDr. Jan Hošek, Ph.D. hosek@mail.muni.cz Ústav molekulární farmacie FaF MU Kdo za to může ? Kary Mu Mis 1985 Nobelova cena v roce 1993 'Kvy Mufcj. pcrtupi thf »wnfcn himan rat In min ttie Nefce) Prtír m C-f misitf (ha-. wTttttti] a chatty, ramWng. tunnf icowttottc U« tmígli tf« wondertard (Ml H nWnd." -TM WAiHlHCTO* P0S1 The origin of PCR by Kary Mullis • "Sometimes a good idea comes to you when you are not looking for it. Through an improbable combination of coincidences, naivete, and luck mistakes, such a revelation came to me one Friday night in April, 1983, as I gripped the steering wheel of my car and snaked along a moonlit mountain road into northern California's redwood country." Sci. Am. 1990 262:56-61, 64-5. Princip PCR Parametry PCR Technické provedení PCR Varianty PCR v praxi Polyme rázová řetězová reakce (polymerase chain reaction - PCR) umožňuje selektivní zmnožení (amplifikaci) určité oblasti DNA v podmínkách in vitro; a to procesem, který připomíná replikaci DNA in vivo DNA primer | | | | | nově syntetizovaný řetěz * 3 jjjjj, DNA templát Princip PCR Parametry PCR Technické provedení PCR - Zásadní předpoklady správné polymerace - Přítomnost tem plátu Polymerace je možná pouze podle známé matrice - templátu - Přítomnost primem nelze začít z nuly Komplementarita K polymeraci nukleotidů dochází vždy podle komplementární dvojice primer/templát Varianty PCR v praxi Směr polymerace Připojování nukleotidů je vždy ve směru 5' -> 3' Princip PCR Cyklické změny teplot reakční směsi Denaturace Princip PCR - komponenty in vitro reakce - /-\ Thermus aquaticus, Thermococcus, Thermophilus, Pyrococcus TAQ pufr MgCl2 I _ T DNA primery MIM MIM .............................. ssDNA Denaturace 92-96°c Průběh polymerace -1. PCR cyklus - 1. denaturace (92-96°C) i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i . | | | | i i i i i i i i i i i i i i i OSUNA 2. annealing (45-72°C) primární produkty 3. extenze (72°C) i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i > Průběh polymerace - 2. PCR cyklus - I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I i......................... I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I sekundární produkty .................... 1111111111 11111111111111 ŕ .............................. Průběh polymerace - 3. PCR cyklus - .................... I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ......................... amplikony I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ■ ■ ■ 1................ Průběh polymerace - Další cykly - iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiniiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... Počet amplikonů vzrůstá geometricky PCR - cycles wanted gene template DNA number ol double strands with the right length : The first 4 cycles of PCR in detail Andy Vicntractc 20011 - Primární produkt Sekundární produkt Amplikon 12 Průběh polymerace - Nárůst množství a typu produktů polymerace- Cyklus < ď £■ Primární Sekundární Amplikony Celkem (proX=1) 0 0 0 0 1 Parametry 2 0 0 2 2 2 2 0 4 3 2 4 2 8 4 2 6 8 16 5 2 8 22 32 Obecne r 2x x(2n-2) (2n-2n)x (2n)x X = počet matric na počátku, n = počet cyklů Průběh polymerace - Výtěžek reakce versus počet cyklů - Cyklus č. Primární Sekundární Amplikony Celkem 10 2 18 1 004 1 024 'pCR^ 2 38 10 485 438 1 0242 30 2 58 ~ 1.1 x109 1 0243 40 2 78 ~ 1.1 x 1012 1 0244 50 2 98 ~ 1.1 x 1015 1 0245 Princip PCR - Závěr - Parametry PCR > Každý amplikon je složen ze dvou řetězců = dvě matrice, které se v dalším cyklu zase zdvojí > Počet amplikonů extrémně vzrůstá oproti počtu primárních a sekundárních produktů Technické provedení PCR > Po několika cyklech už amplikony v reakčních produktech naprosto dominují Varianty PCR v praxi > Primární a sekundární produkty tvoří jen minoritní složku ve výsledných produktech PCR Parametry PCR Parametry PCR Technické provedení PCR Varianty PCR v praxi Kvalita průběhu a výsledek PCR je ovlivněn sadou v zásadě predikovatelných Chemických parametrů Fyzikálních parametrů Chemické parametry PCR Parametry PCR Technické provedení PCR Varianty PCR v praxi 1) Množství Taq polymerázy 2) Reakční pufr 3) Množství dNTP 4) Primery 5) Objem PCR reakce 6) Kvalita DNA Množství Taq polymerázy Parametry PCR Technické provedení PCR Varianty PCR v praxi > 0,5-2,5 jednotky, což odpovídá 25-125 fmol enzymu. > v současné době je k dispozici řada různých Taq polymeráz a jejich směsí > vysoká termostabilita a přesnost začlenění správného nukleotidu do struktury DNA (tzv. fidelity) Reakční pufr Parametry PCR Technické provedení PCR Varianty PCR v praxi > Obsahuje kofaktor Taq polymeráz = ionty Mg2+ ve formě MgCI2 nebo MgS04 > Koncentrace Mg2+ se pohybuje v rozmezí 0,5-5,0 mM (1,5 mM) > lonty ovlivňují aktivitu enzymu, zvyšují Ta dvoušroubovicové DNA a tvoří rozpustné komplexy s nukleotidy, což je proces nutný k inkorporaci nukleotidů do DNA Influence of Mg2+ ions on PCR http://www.thermoscientificbio.com/ 20 Množství dNTP Parametry PCR Technické provedení PCR Varianty PCR v praxi > Do struktury DNA jsou v podmínkách in vitro účinně začleňovány při koncentracích kolem 10 |jM, což jsou ale hodnoty nižší, než ty, které se používají při PCR (100-200 pM) Nastavení vhodné koncentrace (množství) závisí na: > délce amplifikačních produktů > koncentraci Mg2+ > koncentraci primem > nastavení teplotního profilu reakce Primery Parametry PCR Technické provedení PCR Varianty PCR v praxi > zodpovědné za specifičnost PCR > délky 14 až 40 nukleotidů > obsah G+C od 40% do 75% > 3'- konce jednoho primeru by měly obsahovat takové sekvence nukleotidů, které nejsou komplementární k sekvencím druhého primeru - vznik dimerů > homogenní rozložení domén bohatých na G/C a A/T > 5'- konec primeru je méně citlivý k mutacím přítomným na templátové DNA > koncentrace v rozsahu 0,1 -1,0 |uM Primery Délka a specifičnost PCR produktu je dána pozicí primem na cílových sekvencích DNA-matrice 3 5 Návrh primerů - příklad Napište sekvenci primerů, které by mohly amplifikovat vyznačenou část daného úseku dsDNA - znáte sekvenci jen jednoho z řetězců - primery pište ve směru 5'- 3' 5- TGA TGC AAA GTT CGC TCA GGT ACG ATT CCC AAA TGT GGA GCT TAG TCG ATG ATG GGC AAA TCT GTG ATT ATC CGA CGT CCC ATG TGC GTC AAA TGC CGT AGG ACC CTA TTT TGA CGT CCT GCT GGT ACG CAT CAT CCC TGG TGA CGT CCT ACG TGC TGC GCT CGC ACG ATG CGT ACG AAC GCT CGT CGG - 3' Jak dlouhý bude vzniklý amplikon ? Návrh primerů - řešení příkladu Primer forward 5'- AAA GTT CGC TCA GGT ACG - 3' Primer reverse 5'- CGT ACG CAT CGT GCG AGC - 3' Amplikon bude mít délku 171 bp Objem PCR reakce Princip PCR ovlivňuje výsledek v míře menší než faktory uvedené doposud může mít vliv na citlivost reakce objemy reakčních směsí 20 až 100 pl PCR v kapilárách - reakční objemy až 10 pl 1 Varianty PCR v praxi Parametry PCR Technické provedení PCR > > > Kvalita DNA Princip PCR > jedním z rozhodujících faktorů kvalitního průběhu PCR > Čistota a kvalita DNA ovlivňuje zejména citlivost reakce > PCR je kompletně inhibována látkami jako jsou heparin, porfyriny a jim podobné sloučeniny a ionty HxP04n~. Parametry PCR Technické provedení PCR Varianty PCR v praxi Fyzikální parametry PCR Parametry PCR Technické provedení PCR Varianty PCR v praxi 1) Počáteční denaturace 2) Připojení primerů 3) Syntéza nukleotidových řetězců 4) Počet cyklů 5) Závěrečná extenze Počáteční denaturace Parametry PCR Technické provedení PCR Varianty PCR v praxi > jednorázové zahřátí PCR směsi na teplotu 94-96°C po dobu přibližně 3-5 minut > dokonalá denaturace genomové DNA a odbourání všech struktur, které by bránily připojení primem k cílovým sekvencím > následné připojení primem je velmi efektivní > nesmí být příliš dlouhá - poškození řetězců DNA a ničení Taq polymerázy Teplota připojení primerů Princip PCR > rozhodující pro specificitu PCR > vysoká teplota = primery se nepřipojí > nízká teplota = vznikají nespecifické produkty 1 Varianty PCR v praxi Parametry PCR Technické provedení PCR Vliv Ta na PCR Teplota připojení primerů Parametry PCR Technické provedení PCR Varianty PCR v praxi Tm (melting temperature) teplota, při které se bude zhruba 50% primerů v reakci vázat k templátu Tm = (počet G+C) x 4 + (počet A+T ) x 2 Ta (annealing temperature) teplota, při které bude docházek k vazbě většiny primerů v reakci k templátu Ta = Tm - (3-5°C) Výpočet Ta - příklad Princip PCR Jakou Tm a Ta maji tyto primery? Primer forward 5'- aaa gtt cgc tca ggt acg - 3' Primer reverse 5'- cgt acg cat cgt gcg agc - 3' 1 Varianty PCR v praxi Parametry PCR Technické provedení PCR Výpočet Ta - příklad Parametry PCR Technické provedení PCR Varianty PCR v praxi Primer forward 5'- aaa gtt cgc tca ggt acg - 3' Tm = 54°C, Ta = 50°C Primer reverse 5' - cgt acg cat cgt gcg agc - 3' Tm = 60°C, Ta = 56°C Ideální annealingová teplota této dvojice oligonukleotidů v experimentu bude 50°C Syntéza nukleotidových řetězců Princip PCR probíhá při 72°C pro fragmenty o velikosti do 500bp se doporučuje ne delší než 20s pro fragmenty do 1,2 kbp asi 40s rychlost Taq polymerázy činí 150 připojených nukleotidů/sekundu Varianty PCR v praxi Parametry ^> PCR Technické provedení PCR > > Počet cyklů Parametry PCR Technické provedení PCR Varianty PCR v praxi > analytická PCR - ne více než 40 > nejčastěji 25-35 cyklů > vyšší počet cyklů vznik nespecifických artefaktů > vyčerpávání komponent reakce > degradace polymerázy i DNA Například při vyčerpání primem se zbývající nukleotidy účastní syntézy nespecifických produktů, které vznikají po vzájemném annealingu již vzniklých amplikonů a výsledkem jsou delší amplifikační produkty vytvářející „šmouhy" na elektroforetickém gelu Cycle number "Plateau Effect" in PCR Amplification 0 20 30 40 cycle number http://www.mcb.uct.ac.za/ Závěrečná extenze Princip PCR slouží k dokonalému dosyntetizování všech produktů probíhá po dobu 5-15 min. při 72°C poté je možné produkty amplifikace uschovat a následně analyzovat 1 Varianty PCR v praxi Parametry PCR Technické provedení PCR > > > Parametry PCR Technické provedení PCR - termocyklery - Technické provedení PCR Varianty PCR v praxi Mikroprocesorem kontrolované zařízení, které obsahuje kovové reakční bloky vyhřívané a chlazené polovodiči (Peltierova pumpa), vodou, vzduchem nebo mikrovlnami Termocyklery dokáží automaticky rychle měnit teplotu v reakčních blocích mezi třemi základními teplotami PCR cyklu Thermocycler evolution Varianty PCR v praxi Princip PCR PCR-REA, PRA, PCR-RFLP nested PCR multiplex PCR kompetitivnf PCR RT-PCR real-time PCR Varianty PCR v praxi Parametry PCR Technické provedení PCR > > > > > > PCR-REA, PRA, PCR-RFLP i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 111 j-im...................... amplifikace i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i reštrikční štěpení I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ............. .....ppp, ......... ......... PCR-REA, PRA, PCR-RFLP - example Uncut Detection of polymorphism G908R in NOD2 gene Cut by restriction endonuclease 1 \ Heterozygot N Homozygot 2 Homozygot 1 43 Nested PCR Uspořádání nested PCR one tube One tube nested PCR Tm = 65°C 20 cyklů PCR Ta = 62°C 30 cyklů PCR Ta = 52°C citlivost specifičnost Nested PCR/PCR IVP gag HTLV-2 PCR System Titration Dilution of Positive HTLV-2 DNA Control First 10'5 10'6 10'7 10s 109 1010101110121013 Second io5 io8 io710'8 10'9 1010101110121013 Wisconsin Viral Research Group, Ltd. The Lab: Nested PCR Testing for HHV-6 and EBV Multiplex PCR Amplifikace několika lokusů současně v jedné PCR reakci Multiplex PCR Strategy for the detection and differentiation of Mycobacterium avium species in isolates and heavily infected tissues Morávkova M, Hlozek P, Beran V, Pavlik I, Preziuso S, Cuteri V, Bartos M Kompetitivní PCR Cílová DNA Kompetitivní PCR Pozitivní Negativní Inhibice Amplifikace cílové DNA Amplifikace Interního standardu Kompetitivni PCR GeneProof, Mycobacterium tuberculosis PCR Kit Reverzně transkripční PCR e. 5 Virová ssRNA I 3^ RNA dependentní DNA X polymeráza Hybrid cDNA/virová ssRNA cDNA Denaturace 3' i l cDNA Amplifikace N DNA dependentní DNA polymeráza