Buněčný cytoskelet Obsah přednášky 1. Chemická a fyzikální struktura buněčného skeletu 2. Střední filamenta, mikrotubuly, centrozóm, aktiniová vlákna 3. Samosestavování a dynamická struktura cytoskeletárních filament 4. Regulace tvorby cytoskeletárních struktur 5. Molekulární motory prof. MUDr. Oldřich Nečas, DrSc. Nečas, O et al.: Cytoskelet. Academia, 1991 Přínos brněnských vědců Cytoskelet je ......... systém proteinových vláken a tubulů, jejichž hlavní funkcí je transport látek a buněčných komponent, opora buňky a účast na jejím dělení Je to soustava vláken situovaná v cytoplasmě a jádře Cytoskelet – fibrilární struktury Zafixovaná a značená buňka z buněčné kultury Pohled na fibrilární struktury Mikrotubuly (zeleně) Aktinová filamenta (červeně) DNA v jádře (modře) Mikrotubuly (určují pozici membránou ohraničených organel a řídí transport v jádře) Mikrofilamenta, aktinová filamenta (určují tvar buněčných povrchů a pohyb buňky) Střední, intermediární filamenta (poskytují mechanickou oporu) Hlavní typy struktur v cytoskeletu ? Cytoskelet – dynamický nebo rigidní? Cytoskelet je dynamický systém proteinových vláken a tubulů, jejichž hlavní funkcí je transport látek a buněčných komponent, opora buňky a účast na jejím dělení. Je to soustava vláken situovaná v cytoplasmě a jádře Cytoskelet – fibrilární struktury Cytoskelet Je reorganizován v průběhu rychlých změn, např. při dělení buňky Pohybující se fibroblast s vyznačeným polarizovaným dynamickým aktinovým cytoskeletem (červeně). Polarizace je podporována mikrotubuly cytoskeletu (zeleně). Chromozómy jsou vyznačeny hnědě. Rychlé změny cytoskeletu Rychlé změny ve struktuře cytoskeletu pozorované během vývoje časného embrya Drosophila Rychlé změny cytoskeletu Aktinová filamenta (červeně) Mikrotubuly (zeleně) Shluk bakterií (bílá šipka) je pohlcován neutrofilem Neutrofil pronásledující bakterie Podle toho, jak se bakterie pohybuje, neutrofil rychle přestavuje svoji hustou aktinovou síť na předním okraji (červeně) tak, aby se mohl tlačit směrem k místu, kde se bakterie nacházejí Čas 0 s 1 s 2 s 3 s http://www.osel.cz/8250-eugenika-na-bunecne-urovni-seriovi-vrazi-v- primem-prenosu.html Likvidace nádorových buněk Sekreční granule cytotoxické T-buňky připravující smrtelnou dávku jedu (červeně). Aktinová vlákna (zeleně) je přesunují na frontovou linii, místa odkud zahájí útok na modře zbarvenou rakovinu Svazky aktinových vláken musí udržovat stabilní organizaci po celý život živočicha, zůstávají jednotlivá vlákna pozoruhodně dynamická, neustále se přeměňují a nahrazují průměrně každých 48 hodin Cytoskelet tvoří také stabilní struktury ➢ Stabilní struktury jsou typické pro takové buňky, které dosáhly stabilní, diferencované morfologie ➢ Typickým příkladem jsou neurony nebo buňky epitelů Polarizace umožňuje buňkách odlišit, co je ➢ nahoře a dole ➢ vpředu a vzadu Cytoskelet je zodpovědný za buněčnou polaritu Polarizace je druhou vlastností cytoskeletu vedle vytváření stabilních specializovaných povrchových buněčných struktur Polarizované buňky epitelu udržují funkce mezi ➢ Apikální části povrchu = přijímá potravu ➢ Bazolaterálním povrchem = přenáší potravu přes plasmatickou membránu do krevního řečiště Všechny složky cytoskeletu kooperují a vytvářejí charakteristické tvary specializovaných buněk Cytoskelet v polarizovaném epitelu V apikální části se vytvářejí řasinky, které zvyšují buněčný povrch (tvořený aktinovými filamenty, červeně) Zespodu se k řasinkách připojují aktinová filamenta vytvářející mezibuněčné spoje Střední filamenta (modře) jsou napojena na další struktury Cytoskelet v polarizovaném epitelu V apikální části se vytvářejí řasinky, které zvyšují buněčný povrch (tvořený aktinovými filamenty, červeně) Zespodu se k řasinkách připojují aktinová filamenta vytvářející mezibuněčné spoje Střední filamenta (modře) jsou napojena na další struktury Mikrotubuly (zeleně) poskytují globální koordinační systém Strukturní opora eukaryotické buňky ➢ mechanickou pevnost buňky ➢ tvar buňky ➢ vnitřní uspořádání organel Zajišťuje pohyb buňky Reguluje pohyb buňky Funkce cytoskeletu 1) Složky cytoskeletu se nacházejí v buňce volně 2) Tvoří ale i organely nebo alespoň jejich části 3) Podílí se i na stavbě eukaryotického bičíku, centriol, dělicího vřeténka aj. 4) Mikrotubuly volně prostupují celou buňku 5) Mikrofilamenta tvoří hustou síť těsně pod povrchem Kde se nachází cytoskelet? Mikrotubuly (určují pozici membránou ohraničených organel a řídí transport v jádře) Mikrofilamenta, aktinová filamenta (určují tvar buněčných povrchů a pohyb buňky) Střední, intermediární filamenta (poskytují mechanickou oporu) Hlavní typy struktur v cytoskeletu Topografie filament mikrotubulystřední filamenta mikrofilamenta Struktury cytoskeletu se vytvářejí z menších proteinových podjednotek Vytváření proteinových vláken z mnohem menších podjednotek umožňuje regulovat skládání a rozpad vláken za účelem přestavby cytoskeletu Cytoskelet během změn Vytváření filament z malých proteinových podjednotek malé rozpustné podjednotky velké polymerní vlákno Reorganizace cytoskeletu Rychlé reorganizace cytoskeletu v buňce jako odpověď na vnější signál Signál, např. zdroj potravy Rozložení filament a rychlá difůze podjednotek Znovusložení filament v novém místě Mikrotubuly ➢ dlouhé duté trubičky o průměru 25 nm tvořené proteinem tubulinem α a β ➢ tubulin α a β se skládá do heterodimerů, z nichž se skládají protofilamenta ➢ v každé trubičce je 13 souběžných protofilament Mikrotubuly α tubulin β tubulin protofilamentum heterodimery Helikální struktura mikrotubulu Struktura mikrotubulů ➢ mikrotubuly jsou dlouhé a rovné ➢ mají jeden z konců připojený k tzv. centrozómu Funkce mikrotubulů ➢ orientovány do centrozómu (mínus konec), vybíhají k buněčnému povrchu (plus konec) ➢ zajišťují pohyb organel a určují polohu membránou obklopených organel ➢ řídí jaderný transport ➢ napomáhají formování tvaru buňky a slouží jako podpůrná kostra buňky Mikroskopie mikrotubulů Růst a rozpad mikrotubulů Dimery nesoucí GTP se váží pevněji Hydrolýza GTP v oblasti čepičky sníží stabilitu polymeru Dimery s GDP mohou být rychle uvolňovány a mikrotubulus se zkracuje Růst a rozpad mikrotubulů Je regulován hydrolýzou GTP růst rozpad GTP čepička méně stabilní oblast s GDP ➢ kolchicin je tzv. „mitotický jed“ 1) Inhibuje polymeraci tubulinových protomerů → brání vzniku mitotického vřeténka → zastavuje mitózu v metafázi 2) Zastavuje buněčné pohyby → zpomaluje pohyb lymfocytů → léčení akutních záchvatů dny ➢ Podobně působí vinblastin a vinkristin z Vinca rosea (barvínek) ➢ Naproti tomu taxany z Taxus brefifolia (tis) urychlují tvorbu tubulů, stabilizují je a brání depolymerizaci Mikrotubuly a kolchicin Aktinová filamenta ➢ vlákna o průměru cca 7-9 nm ➢ tvořené aktinem ➢ mechanicky podpůrná funkce ➢ spolu s myosinem tvoří kontraktilní aparát ➢ zodpovědný za mnoho typů vnitrobuněčných pohybů ➢ proudění cytoplasmy ➢ tvorba buněčných výběžků a invaginací buňky ➢ na vyšší úrovni organizace jsou aktin a myosin složky svalových buněk Aktinová filamenta Struktura aktinových filament Struktura aktinových filament Filamenta odolávají teplotnímu poškození Jednotlivé protofilamentum je teplotně nestabilní Filamenta odolávají teplotnímu poškození Jednotlivé protofilamentum je teplotně nestabilní štěpení uprostřed poruší jednu vazbu odstranění z jednoho konce poruší jednu vazbu Filamenta odolávají teplotnímu poškození Více protofilament pohromadě je teplotně stabilní protofilamenta štěpení uprostřed poruší 5 podélných vazeb štěpení z jednoho konce poruší 1 podélnou a 2 postranní vazby Molekulární motory ➢ transportují náklady podél mikrotubulů ➢ řídí pohyb organel, váčků ➢ funkce spojena s hydrolýzou ATP ➢ kinesiny a cytoplasmatické dyneiny Molekulární motory Kinezin Pohyb směrem k plus konci mikrotubulu, tj. od centrosomu k periferii buňky Dinein Pohyb směrem k minus mikrotubulu, tj. k centrozómu Kineziny a dineiny mikrotubulus Kinezin (dimer) ATP organela Kineziny mikrotubulus Kinezin (dimer) ATP organela Kineziny http://www.biomach.org/Molecular_Devices/Biological_Motors/Ion_Channels_ and_Nanopores/SEC_YEG.jpg Fáze translokace Kinesin Explanation http://www.youtube.com/watch?v=lLxlBB9ZBj4 Animace Kinesin.avi + 16.7 Kinesin.mov ➢ Jeden kinezin (tygr) působí silou 7pN, jeden dynein (lev) jen 6 pN Kdo je silnější? Diehl, M.R. (2012): Science 338: 626-627 ➢ Kineziny ale svoji činnost koordinují méně než dyneiny, respektive dyneiny mají vyšší afinitu k cílovým sekvencím ➢ Lokalizace RNA v cytoplasmě rozhoduje o polarizaci buňky a následně i tkání, protože … … RNA reguluje genovou expresi, a to znamená, že … … nerovnoměrná distribuce RNA vede k prostorově závislé expresi genů Dyneiny a kineziny transportují RNA Gagnon et al. (2013): Directional Transport Is Mediated by a DyneinDependent Step in an RNA Localization Pathway, PLOS Biology 11(4): e1001551 ➢ Dyneiny zajišťují jednosměrný transport RNA k cílovým oblastem ➢ Kineziny transportují RNA oběma směry v blízkosti místa účinku ➢ Studováno na oocytech žab Ukázka lokalizace regulační RNA rovnoměrná exprese β-globinu nerovnoměrná exprese VLE RNA Střední filamenta ➢ vlákna lanového charakteru o průměru 10-15 nm ➢ tvořená multimery fibrilárních proteinů ➢ velikost a složení odlišná u různých typů buněk i mezi stejnými typy buněk u různých organismů ➢ přítomny v místech, kde buňka odolává tlaku (axony nervových buněk, kožní buňky) ➢ cytoplasmatická síť obklopující jádro ➢ pod jadernou membránou – zesílení jádra Střední filamenta Struktura středních filament Animace 1) Vismetin – pojivové tkáně, svaly, fibroblasty a epitely (cévy) 2) Desmin – svalové buňky 3) Neurofilamenta – axony neuronů 4) Gliové fibrilární kyselé proteiny – gliové buňky 5) Keratiny (cytokeratiny) – epitely, 30 podtypů (vlasy, peří, drápy, kůže, střevní výstelka) Dělí se podle základní proteinové podjednotky Typy středních filament Střední filamenta a travičství Příběh arsenu ➢ Keratin je nerozpustný ve vodě a má vláknitou strukturu, jednotlivé monomery mívají délku 400–644 aminokyselin, ale větví se do polymerů o velkých rozměrech. ➢ Konečný tvar molekuly - terciární strukturu zajišťují disulfidické můstky. Lidské vlasy obsahují přibližně 14% cysteinů. Keratin, cytoskelet a arsen I ➢ Keratin je nerozpustný ve vodě a má vláknitou strukturu, jednotlivé monomery mívají délku 400–644 aminokyselin, ale větví se do polymerů o velkých rozměrech. ➢ Konečný tvar molekuly - terciární strukturu zajišťují disulfidické můstky. Lidské vlasy obsahují přibližně 14% cysteinů. Keratin, cytoskelet a arsen I Keratin, cytoskelet a arsen II ➢ Arsen AsIII má vysokou afinitu k atomům síry a váže se pevně k disulfidickým můstkům ➢ Arsen ve vlasech nebo nehtech můžeme nalézt i po velmi dlouhé době As2O3 + S S S S As Dynamika arsenu ve vlasech ➢ Oxid arsenitý As2O3 při otravě cirkuluje v krvi a ukládá se ve vlasovém folikulu, odkud je „vychytáván“ vlasovým folikulem ➢ Jak se mění koncentrace AsIII v krvi, mění se i jeho ukládání ve vlasech/nehtech ➢ Průměrná doba života vlasu činí 900 dní, tedy 2,5 roku; rychlost růstu vlasu je 1 cm/měsíc ➢ Rentgenově fluorescenční analýza umožňuje rozlišit méně než 1 mm ➢ Vývoj otravy lze sledovat s přesností na dny (kdy a kolik jedu bylo podáno) Znáte příklady travičských afér z historie? Více si přečtěte v knize Petr Klusoň: Jedová stopa, Academia Praha, 2015 Centrozóm – dělící (mitotické) tělísko ➢ organela živočišných buněk a buněk nižších rostlin ➢ vyskytuje se v blízkosti jádra ➢ seskupení mikrotubulů a asociovaných proteinů ➢ účastní se separace chromozómů při dělení jádra ➢ podmiňuje orientaci chromozómů a pohyb jejich rozdělených částí k pólům dělícího vřeténka ➢ při zrání vaječné buňky zaniká ➢ do zygoty je centrozóm přenášen spermií Co je centrozóm ➢ centriola - středové tělísko ➢ centrosféra - hustá bezstrukturní síť kolem centrioly ➢ astrosféra - řídká vlákna cytoplazmy vybíhající z centrosféry dvojice centriol centrosféra astrosféra Struktura centrozómu centrozóm dvojice centriol centrioly mikrotubuly 9 sad trojic mikrotubulů Detaily struktury centrozómu V každé centriole je 9 mikrotubulárních tripletů dvojice centriol triplet mikrotubulů Struktura centrioly centrozóm (centrioly) chromozómy vlákna mikrotubulů dělící vřeténko http://www.nature.com/nrm/journal/v2/n9/slideshow/nrm0901_688a_F1.html Další informace na Centriola při mitóze Původní článek http://www.osel.cz/8311-jsou-centrioly-nositelkami- informace.html Jsou centrioly nositeli informace? Balestra FR, von Tobel L, Gonczy P. Paternally contributed centrioles exhibit exceptional persistence in C. elegans embryos. Cell Research 24 April 2015. DOI: 10.1038/cr.2015.49 9 párů mikrotubulů (protein tubulin) + protein dynein Bičík eukaryotické buňky Mikrotubuly Pohybový aparát prokaryot Bakteriální bičík Animace ➢ cytoskelet byl považován za výsadu eukaryotických buněk ➢ ani elektronovým mikroskopem nebylo možno nic najít LEDEN 2009 Salje et al. objevili filamenta bakteriálního cytoskeletu odpovědná za segregaci DNA Použili metodu kryo-elektronové mikroskopie !! Mají prokaryota cytoskelet? J. Salje et al., Science 323, 509 -512 (2009) Přímé pozorování svazků filament u E. coli cytosol Fotografie průhledných struktur transmisním EM J. Salje et al., Science 323, 509 -512 (2009) pohled podél podélné osy filamenta ParM filamenta ParM Fotografie průhledných struktur J. Salje et al., Science 323, 509 -512 (2009) detail filamenta kryotomogram Detaily 1/2 J. Salje et al., Science 323, 509 -512 (2009) filamentum v in vitro systému kryotomogram intaktní buňky filamenta ParM cytosol Detaily 2/2 Filamenta v procesu segregace plasmidové DNA J. Salje et al., Science 323, 509 -512 (2009) nukleoid plasmid nukleoid plasmid nukleoid plasmid Filamenta leží na periferii nukleoidu J. Salje et al., Science 323, 509 -512 (2009) ➢ svazky filament ParM, které zajišťují rozchod plasmidu leží na periferii nukleoidu ➢ zde jsou molekuly plasmidu zachyceny a následně rozdělovány do dceřiných buněk Model segregace plasmidové DNA pili u E. coli flagela u r. Salmonella → pili (fimbrie), flagela (bičíky) Mikrotubuly prokaryot Kdo je rychlejší – makro nebo mikroorganismus? Organismus Km/h Délek těla/s Gepard 111 Člověk 37,5 Bakterie 0,00015 Rychlost pohybu organismů Bdellovibrio je 1-2 μm dlouhá bakterie, která napadá periplasmatický prostor gram- bakterií Když Bdellovibrio napadá Pseudomonas phaseolicola Rychlost průniku do bakterie je až 100 násobkem velikosti parazita Jestliže je velikost člověka 1,8 m, jakou rychlostí by se takový člověk pohyboval?