Obsah přednášky 1. Univerzální mechanismy vývoje organismů 2. Základní procesy tvorby embrya 3. Řízení ontogenetického vývoje 4. Jak se studují vývojové procesy 5. Indukční signály 6. Homeotické geny 7. Využití vývojových procesů ➢ Život organismů začíná jako jediná buňka – fertilizované vajíčko ➢ Během vývoje se tato buňka opakovaně dělí, vzniká mnoho různých buněk jejichž konečná podoba je velmi složitá a přesná ➢ Vývojové schéma je určeno geny ➢ Jak geny řídí ontogenezi je předmětem studia vývojové biologie Úvod ➢ Principiálně každá buňka obsahuje kompletní genetickou informaci ➢ Buňky se neliší svou genetickou informací, ale tím, že exprimují odlišné sady genů ➢ Tato selektivní exprese genů kontroluje 4 základní procesy tvorby embrya 1) Buněčná proliferace = vznik jedné buňky z mnoha proliferace 1) Buněčná proliferace = vznik jedné buňky z mnoha 2) Buněčná specializace = vytváření buněk s různými charakteristikami podle místa, kde se nacházejí specializace 1) Buněčná proliferace = vznik jedné buňky z mnoha 2) Buněčná specializace = vytváření buněk s různými charakteristikami podle místa, kde se nacházejí 3) Buněčná interakce = koordinace vlastností buňky v závislosti na jejím okolí interakce 1) Buněčná proliferace = vznik jedné buňky z mnoha 2) Buněčná specializace = vytváření buněk s různými charakteristikami podle místa, kde se nacházejí 3) Buněčná interakce = koordinace vlastností buňky v závislosti na jejím okolí 4) Pohyb buňky = přeuspořádání buněk a tvorba strukturovaných tkání a orgánů pohyb proliferace specializace interakce pohyb ➢ Na zemi je více než 10 milionů druhů živočichů, které jsou nesmírně variabilní ➢ Červi, blechy, ptáci, gigantičtí kalmaři i lidé, ti všichni vznikají podle stejných vývojových plánů ➢ Na těchto plánech se podílí podobné, evolučně příbuzné proteiny ➢ Tyto proteiny (homologické proteiny) mohou fungovat napříč všemi druhy normální vývoj mozku myši po ztrátě regulačního proteinu po náhradě homologických regulačním proteinem ➢ Protein Eyeless kontroluje vývoj u Drosophila ➢ Ektopická exprese může způsobit vývoj oka např. místo nohy exprese holologického Pax6 z chobotnice normální oko ➢ U rostlin vznikla mnohobuněčnost nezávisle na živočišné říši ➢ Mají jednotný vývojový rámec, ale odlišný od živočichů Podobnosti v genech kontrolujících ontogenetický vývoj svědčí o existenci společného předka, který tyto geny už měl Tento společný předek měl pravděpodobně ➢ epidermální buňky = ochranná vnější vrstva ➢ buňky trávicího traktu = příjem potravy ➢ svalové buňky = pohyb ➢ neurony a senzory = kontrola pohybu Tělo organizované do těchto struktur ➢ Kůže pokrývající povrch těla a oddělující ho od okolí ➢ Ústa určená k příjmu potravy ➢ Trávicí trubice určená ke zpracování potravy ➢ Svaly, nervy a další tkáně uložené v prostoru mezi vnější kůží a vnitřní trávicí trubicí Tyto základní struktury označujeme? Tyto základní struktury označujeme? ➢ ektoderm ➢ entoderm ➢ mezoderm Prekurzor epidermis a nervového systému Říká se mu také vnější zárodečný list Vzniká z něj ➢ většina epitelů, pokožka a její deriváty (vlasy, nehty) ➢ výstelka začátku a konce zažívací trubice ➢ dále například čichové buňky, mozeček, tyčinky a čípky a dřeň nadledvinek ➢ specifickým typem ektodermu je neuroektoderm, z něhož vzniká nervová soustava a neurální lišta Prekurzor trávicí trubice a jejích „přívěsků“ – slinivka břišní, játra, plíce Vzniká z něj ➢ epitel trávicí soustavy (vyjma části úst, hltanu a řiti) ➢ buňky lemující všechny žlázy, které jsou otevřeny do trávicí soustavy (játra, slinivka břišní) ➢ epitel Eustachovy trubice, část středního ucha ➢ epitel průdušnice, průdušky a plicních alveol ➢ povrch močového měchýře a části močové trubice Říká se mu také vnitřní zárodečný list Vyplňuje prostor mezi ektodermem a entodermem Prekurzor svalů, pojivových tkání a řady dalších orgánů a tkání Říká se mu také střední zárodečný list Vzniká většinou z entodermu ➢ svaly, kostra, oběhová soustava, vylučovací soustava, pohlavní soustava ➢ v podstatě však také orgány vzniklé ze stěn tzv. coelomu (dutina v mezodermu) - např. část cévní soustavy a dále struna hřbetní Mezoderm vytváří objemově největší část těla Univerzální proces vývoje živočichů, kterým je obrovská oplodněná vaječná buňka přeměňována sérií štěpení na malé buňky až ke vzniku struktury s trávicí trubicí Gastrulaci předchází vznik blastuly = dutá koule epiteliálních buněk uzavírající dutinu Gastrulace začíná, když se buňky začínají uvolňovat do dutiny, kde vytvoří střevo a další vnitřní tkáně začátek invaginace entodermu migrující buňky mesodermu budoucí ústa trávicí trubice budoucí skelet budoucí anus ventrální strana ➢ Skupina buněk putuje z epitelu do dutiny a mění se v mezoderm začátek invaginace entodermu migrující buňky mesodermu budoucí ústa trávicí trubice budoucí skelet budoucí anus ventrální strana ➢ Tyto buňky se pak plazivým pohybem přemísťují po vnitřní stěně blastuly začátek invaginace entodermu migrující buňky mesodermu budoucí ústa trávicí trubice budoucí skelet budoucí anus ventrální strana ➢ Mezitím pokračuje zastrkování ektodermu dovnitř blastuly a z ektodermu vzniká entoderm začátek invaginace entodermu migrující buňky mesodermu budoucí ústa trávicí trubice budoucí skelet budoucí anus ventrální strana ➢ Invaginace entodermu pokračuje a vytváří se dlouhá střevní trubice začátek invaginace entodermu migrující buňky mesodermu budoucí ústa trávicí trubice budoucí skelet budoucí anus ventrální strana ➢ Konec střevní trubice se dotkne stěny blastuly v místě, kde se později otevřou ústa začátek invaginace entodermu migrující buňky mesodermu budoucí ústa trávicí trubice budoucí skelet budoucí anus ventrální strana ➢ Ústa vznikají v místě styku ektodermu a entodermu ústa anus mesoderm ektoderm entoderm Živočichové mají podobné geny, přesto jsou jejich těla tak odlišná – jak je to možné? ➢ na proteom můžeme pohlížet jako na kostky dětské stavebnice ➢ z těchto kostek lze postavit různé struktury ➢ instrukce o tom, které komponenty pospojovat jsou neseny geny !!! A TO GENY REGULAČNÍMI !!! ➢ některé komponenty je možno kombinovat jen s některými Regulační geny jsou zapínány sekvenčním způsobem – zapnutí/vypnutí genů závisí na přijímání signálů zvenčí i z vnitřního prostředí buněk ➢ pravidla přechodu z jednoho stadia do druhého podle toho, jak buňky proliferují a rozpoznávají svoji pozici v embryu s ohledem na okolí ➢ zapínání nových sad genů podle aktivit proteinů, které již obsahují z předchozí vývojové fáze Program buněčného vývoje jsou embryonální stadium 1 embryonální stadium 1 buňky v organismu A čas čas embryonální stadium 2 embryonální stadium 2 buňky v příbuzném organismu B regulační oblasti regulační protein gen 1 gen 2 gen 3 gen 1 gen 2 gen 3 gen 1 gen 2 gen 3 gen 1 gen 2 gen 3 ➢ stejné proteiny exprimované v prvním stadiu ➢ různé proteiny exprimované ve druhém stadiu Rozdíly mezi druhy jsou samozřejmě dány variacemi jednotlivých proteinů (kódovány strukturními geny) I když budeme mít stejnou sadu strukturních genů, způsobí jejich časově a prostorově oddělená exprese vznik odlišných tkání a tělních struktur (za to můžou regulační geny) !!! ALE !!! Stačí nám znalost strukturních genů k odhadu, co z těch sekvencí vznikne? Studuje buněčné dělení, růst a pohyb buněk při přeměně oplozeného vajíčka do mnohobuněčného organismu ➢ Základy této disciplíny byly položeny už v 19. století ➢ Experimentální embryologie = analyzuje vývoj v termínech interakce buněk a tkání ➢ Vývojová genetika = popisuje vývoj jako interakci genů Moderní embryologie spojuje oba přístupy A, D = barvení 20 hod. po inkubaci (bezstrukturní hmota), vyznačen nodus B, E = po dalších 6 hod. nastává pohyb buněk, nodus se posunuje dozadu C, F = po dalších 8 hod. je vidět tělní plán, nodus se dále posunuje dozadu ➢ odstraňovány ➢ přemísťovány ➢ transplantovány ➢ rostou izolovaně Buňky a tkáně jsou z embrya Cílem je zjistit, jak jedna buňka či tkáň ovlivňují druhou Když je časné embryo rozděleno na dvě, ještě z něj mohou diferencovat dva plnohodnotné organismy Neúplné rozdělení vede ke vzniku siamského dvojčete Malý kus tkáně transplantovaný do nového místa může reorganizovat celou strukturu vyvíjejícího se těla Vzniká siamské dvojče Experimentální embryolog využívá organismů s velkými vajíčky Ptáci kuřecí embrya Obojživelníci Xenopus laevis Využívá mutanty, kteří se vyvíjejí abnormálně ➢ Rodiče jsou ovlivněni chemickými mutageny nebo ionizujícím zářením – mutace v zárodečných buňkách ➢ Geny z vývojových abnormalit se klonují a sekvenují Vhodné jsou malé organismy s krátkou generační dobou Drosophila melanogaster Caenorhabditis elegans Danio rerio Mus musculus … je daná „dávno“ předtím, než jsou viditelné nějaké změny = buňka má svůj osud? ➢ buňka, která se vyvine do daného typu bez ohledu na změnu vnějších signálů se označuje jako determinovaná, hovoříme též o buněčné paměti ➢ na druhou stranu buňky nedeterminované, biochemicky totožné, se vyvíjejí jiným směrem, v závislosti na pozici v tělesné struktuře Provádí se transplantací buňky do jiných vnějších podmínek před viditelnou změnou po viditelné změně normální nedeterminovaná determinovaná Existuje však široké spektrum mezistavů mezi oběma popsanými extrémy – je možný vývojový zvrat Buňky jsou prostorově determinovány – udržují si znalost pozice, kde se nacházely před transplantací zárodek nohy zárodek křídla křídlo blok mezodermu, ze kterého se vytvoří stehno zárodek stehenní tkáně naroubovaný na špičku zárodku křídla horní část křídla a předloktí prsty s drápy na koncích ➢ nohy i křídla se skládají z masa, kostí, kůže, … ➢ rozdíly nejsou v typu tkáně, ale ve způsobu, jakým jsou uspořádány Poziční efekt Čím je dána buněčná paměť? Co způsobuje poziční efekt? Může za to exprese genů, respektive regulační proteiny a intereferující RNAi Genovou expresi lze sledovat hybridizací in situ zárodek křídla zárodek nohy Příklad exprese genů Tbx5, Tbx4 a Pitx1 u kuřecího embrya ➢ V každém stádiu vývoje má buňka omezený počet možností, kam se vyvíjet ➢ Ty možnosti záleží na stavu, jakého v daném okamžiku buňka dosáhla ➢ Buňka se tedy v klíčových krocích vývoje musí rozhodnout, kam se bude vyvíjet ➢ Toto rozhodování dělá buňka několikrát, podél vývojové diferenciační dráhy tak vzniká řada různých buněčných typů Co rozhoduje o tom, jakým směrem se buňka v daném kroku vydá? ➢ signály z vnějšího prostředí ➢ signály ze sousedících buněk Rozhodují o směru buněčné diferenciace Indukční interakce Působící na krátkou vzdálenost (přenášené mezibuněčnými kontakty) indukční signál přesměrování buněk do nové vývojové dráhy Působící na dlouhou vzdálenost (přenášené molekulami, které prostupují extracelulární matrix) Další způsob buněčné diferenciace ➢ Sada významných molekul se během cytokineze rozdělí nerovnoměrně ➢ Rozdílný obsah těchto molekul pak svede dceřiné buňky na odlišné vývojové trajektorie I po symetrickém dělení se mohou dceřiné buňky vyvíjet odlišně díky odlišným indukčním signálům Využívá se, když je primární diferenciace vyvolaná indukčními signály nebo asymetrickým dělením slabá Buněčné dělení - nahodilý rozdíl vyvolá malou asymetrii Pozitivní zpětná vazba rozdíl zesiluje Látka X inhibuje produkci dalších molekul X v sousedních buňkách Fáze tzv. bistability zajistí diferencovaný vývoj buněk Relativně malý počet konzervativních rodin proteinů působí opakovaně v různých souvislostech ➢ Regulují genovou expresi na úrovni transkripce ➢ Různé typy buněk reagují na stejný signál různě ➢ Stejné buňky na různý signál reagují různě v různých časech Velké množství vývojových procesů je regulováno inhibitory a nikoli primárně signálními molekulami Indukční signál gradient indukčního signálu gradient indukčního signálu rovnoměrná distribuce IS gradient inhibitoru zdroj inhibitoru ➢ Vývoj organismu začíná z malého počtu buněk ➢ Jakmile se vytvoří dvě skupiny různých buněk, může jedna z nich spustit specializaci buněk sousedních ➢ Tyto buňky spustí diferenciaci dalších buněk, atd. C vzniká působením B na A D a E vznikají z A a B působením C A Kicheva et al. Science 2012;338:210-212 morfogen signální efektor geny ➢ Morfogen spouští signální dráhu ➢ Signální dráha spouští transkripci příslušných genů ➢ Procesy jsou časově posunuty ➢ Efekt morfogenu se zpožďuje s rostoucí vzdáleností od jeho zdroje ➢ To vede k diferenciaci (obr. C) ➢ Nodus obsahuje řasinkové buňky, které vytvářejí proudění (zleva doprava) mezibuněčné tekutiny Norris DP a Grimes DT (2012): Science 338: 206-207 ➢ Gradient substancí spouští asymetrickou expresi genů na periferii nodu (Nodal x Cerl2) ➢ Nodal reguluje gen Pitx2 – kóduje transkripční faktor, který řídí tvorbu orgánů Norris DP a Grimes DT (2012): Science 338: 206-207 J Frede, and P H Jones Science 2013;342:1183-1184 1) Proliferace bazální vrstvy buněk zajištěna autokrinní signalizací přes Wnt 2) Diferenciace zajištěna inhibicí Wnt proteinem Dkk A Zuniga, and R Zeller Science 2014;345:516-517 Vývoj prstů na ruce malíček palec 1) Vytvoření anteroposterior osy působením gradientu faktoru SHH 2) Růst základu prstů 3) Interakce tří faktorů Transkripční faktor základy prstů mezera ➢ S postupem vývoje se tělo stává složitějším a složitějším ➢ Složitého stavu lze však dosáhnout jednoduchými mechanismy = jednoduchými vývojovými mechanismy U všech druhů na všech úrovních organizace shledáváme, že složité struktury vznikají opakováním několika základních vývojových schémat Existuje relativně omezený počet diferencovaných buněk s drobnými variacemi podle umístění v těle (svalová buňka, fibroblast, …) Tyto buňky jsou organizovány do omezeného počtu typů tkání s variacemi podle umístění (svaly, šlachy, …) Tyto tkáně tvoří orgány – stejná struktura, různé varianty (zuby, prsty) Jaký je základní konstrukční mechanismus našich těl? Jakým způsobem je tento modifikován, aby vzniklo tolik různých variant? ➢ Mutant Antennapendia = namísto tykadel se na hlavě tvoří končetiny ➢ Bithorax = má druhý pár křídel namísto halter Mutované formy těchto genů mění tělní struktury podle pozice, kde se nacházejí Celá sada homeotických genů determinuje segmentární strukturu hmyzích těl ➢ Všechny jsou příbuzné a patří do multigenové rodiny ➢ Leží ve dvou genových clusterech – Bithorax a Antenaapendia komplex U hmyzu existuje 8 sad homeotických genů Geny komplexu Bithorax kontrolují rozdíly mezi abdominálními a hrudními segmenty Geny komplexu Antennapendia kontrolují rozdíly mezi hrudními a hlavovými segmenty ➢ Jsou to dvě poloviny jediné entity, označované jako Hox komplex ➢ Oddělily se v průběhu evoluce ➢ Pracují koordinovaným způsobem a uplatňují se při vytváření základního tělního plánu od hlavy až po ocasní struktury Komplexy Bithorax a Antennapendia se vyskytují u všech vyšších mnohobuněčných organismů, včetně člověka ➢ Mají 60 aminokyselin dlouhou konzervativní DNA vazebnou doménu ➢ Tato doména se váže na DNA sekvenci označovanou homeobox Homeotické geny kódují transkripční faktory Vazbou DNA vazebné domény na homeobox „strukturního“ genu se aktivují další regulátory, které byly přítomny v buňce již z předchozích fází ontogeneze a dojde buď k AKTIVACI nebo REPRESI tohoto genu Molekulární děje v každém tělním segmentu jsou tak individualizovány ➢ Homeotické geny jsou rozptýleny mezi segmenty regulačních sekvencí, které interagují s řadou vnitrobuněčných signálů, jež spouštějí nebo umlčují transkripci příslušných homeotických genů I exprese homeotických genů je regulována Transkripce homeotických genů je aktivována sekvenčně s ohledem na jejich pozici v genovém clusteru Existují stovky dalších genů s homeoboxy, ale jejich uspořádání je jiné než u Hox komplexu Tyto geny modulují aktivitu Hox komplexu U myší 4 komplexy – HoxA, HoxB, HoxC, HoxD ➢ Leží na 4 různých chromozómech ➢ Vznikly opakovanými duplikacemi u společného předka červů, hmyzu a obratlovců ➢ Některé geny se dále duplikovaly, jiné se ztratily nebo přijaly jinou funkci … jsou exprimovány podél základní tělní osy – od hlavy k ocasu ➢ Embryo označeno reportérovým genem lacZ ➢ HoxB2 je chromozómu umístěn dříve než HoxB4, exprimuje se proto více směrem k hlavě ➢ Normálně se vyvíjející embryo (končetiny neukázány) ➢ Zvýšená exprese HoxA10 vede k vývoji žeber v místech, kde se už normálně netvoří ➢ Totipotence u rostlin ➢ Transplantace živočišných jader ➢ Kmenové buňky U rostlin více než u živočichů je totipotence jistá záležitost ➢ Využití jediné somatické buňky k přípravě jednoho nebo více geneticky shodných organismů se nazývá? KLONOVÁNÍ ➢ tímto způsobem vzniklý jedinec se nazývá KLON ➢ Z každé živé rostlinné buňky lze získat celou rostlinu Vegetativní rozmnožování rostlin ➢ řízkování ➢ odkopky regenerace žížal, mořských hvězdic 1952 – Briggs a King ➢ přenos jader mezi vajíčky žab ➢ dárcem buňky časného embrya ➢ klony dorostly jen do stádia pulce 60. a 70. léta 20. století – Gurdon = Nobelova cena 2012! ➢ dárcem buňky z vnitřností pulce ➢ vypěstoval dospělé žáby Umělá příprava dvojčat, trojčat, … 1. adoptivní matka 2. adoptivní matka 3. adoptivní matka Existují přirozené klony? Klonování není nic nepřirozeného Naklonován byl už i člověk ! Jednovaječná dvojčata jsou klon ! „normální“ vývoj buňka se nerozdělí jednovaječná dvojčata ❖ Ve stádiu osmi buněk se začíná exprimovat E-kadherin Do kdy je možné bezpečně rozdělit embryo? 8 8 8 8 8 8 Jaký je maximální počet přirozených klonů u savce? U pásovce devítipásého - jednovaječná osmerčata ➢ metody rozdělení embrya i transplantace jader využívány ke klonování myší, krav, prasat, králíků a ovcí ➢ další pokusy byly neúspěšné, u vyšších obratlovců se jedinci nedožili dospělosti PROBLÉM SPECIALIZACE SAVČÍCH BUNĚK? 1996, Ian Wilmut, Roslin Institute, Edinburg, Skotsko ➢ buňky z mléčné žlázy dospělé ovce ➢ přenos do enukleovaného vajíčka ➢ elektrické pulsy ➢ 300 neúspěšných pokusů Je možné reprogramovat jádro živočišné buňky klon odstranění DNA z vajíčkafůze transformace tělní buňka s DNA ➢ 1997 naklonovaná kráva ➢ 1997 ovce s lidským genem – srážecí faktor IX ➢ 1998 telata s lidským sérovým albuminem ➢ transgenní myši, pes, opice ➢ 2007 – Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR, Liběchov u Prahy – objev funkce jadérka Nastala éra geneticky modifikovaných organismů Snažíme se aplikovat poznatky na zlepšení lidského zdraví A nejen to! Jsou nespecializované ➢ samy se „bez omezení“ množí ➢ za odpovídajících podmínek diferencují do specializovaných buněk jednoho nebo více typů Kmenové buňky, které mohou dát vznik mnoha buněčným typům se říká multipotentní nebo pluripotentní ➢ Kmenové buňky kostní dřeně – diferencují do všech stádií a typů krevních buněk ➢ Mohou být aktivovány a využity k produkci určitého druhu nervových buněk ➢ Popsány v roce 1997 http://www.sciencedaily.com/releases/2008/06/080606110925.htm Odkazy na vědecké články http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9487008 Takové buňky jsou „nesmrtelné“ ➢ užívají telomerázu k udržování konců telomér ➢ jsou diferencovatelné do kteréhokoli typu buňky ➢ Oprava poškozených nebo nemocných orgánů ➢ Např. poskytnutí pankreatických buněk produkujících inzulín diabetikům ➢ Transplantace mozkových buněk lidem s Parkinsonovou nebo Huntingtonovou chorobou !!! ETIKA a POLITIKA !!! Shrnutí přednášky 1. Univerzální mechanismy vývoje organismů 2. Základní procesy tvorby embrya 3. Řízení ontogenetického vývoje 4. Jak se studují vývojové procesy 5. Indukční signály 6. Homeotické geny 7. Využití vývojových procesů