1
Hodnocení toxicity in vitro
Toxikologie, Podzim 2024
ÚFTo FaF MUNI
Informace o duševním vlastnictví:
• Tento materiál je autorským dílem vytvořeným zaměstnanci Masarykovy univerzity.
• Studenti kurzu/předmětu mají právo pořídit si kopii materiálu pro potřeby vlastního studia.
• Jakékoliv další šíření prezentace nebo její části bez svolení Masarykovy univerzity je v rozporu se zákonem.
2
in silico in vitro in vivo
+ ex vivo modely
Příklad strategie testování – testy kožní dráždivosti a
leptavosti
a. in silico + pH
b. in vitro – modely lidské kůže
c. in vivo – pokusné zvíře (albinotický králík)
Výběr látky –
předpoklad efektu
Prvotní stanovení efektu
Výběr dávky
Alternativa k in vivo
Efekt na organismus
Pozn. ne všechny in vivo metody mají alternativu nebo předhůdce v in vitro
3
In vivo x in vitro modely
++ --
In vitro
Nižší náklady
Testování většího počtu látek v
krátkém časovém úseku
Dostatek biologického materiálu
Reprodukovatelnost
Použití lidských buněčných kultur
Možnost hodnocení orgánově
specifické toxicity (př. hepatotoxicita,
nefrotoxicita etc.)
Získaná data nevypovídají o
systémové regulaci
Pro náhradu in vivo modelu nutná
validace metod
Problém extrapolace dat
Nelze všechny buněčné typy
kultivovat in vitro
Kultivace za nefyziologických
podmínek (kultivační média, u
buněčných linií absence tkáňového
kontextu)
In vivo
Testování systémové regulace
Toxikokinetika
In vivo modely nelze eliminovat !!
Finanční, časová náročnost
Etické hledisko
Interindividuální rozdíly
4
In vitro modely
= živý systém zjednodušený ve srovnání s in vivo modelem
• modely na subcelulární úrovni
• buněčné kultury
• tkáňové kultury
• tkáňové řezy
• izolované orgány
• 2D vs. 3D modely
• Stem cells
• Bakterie, kvasinky, explantátové kultury etc.
5
Buněčné linie
= permanentní buněčné linie (imortalizované)
• Plně adaptovány na podmínky in vitro, neomezeně
se dělí
• Získávají se z nádorových buněk anebo selekcí z
primárních kultur pomocí fyzikálních či chemických
mutagenů
• Zdroje buněčných linií:
– ATCC (American Tissue and Cultures
Collection)
– ECACC (European Collection of Cell Cultures)
Typ zdroj Tkáň/buňky
HeLa člověk děložní hrdlo
CaCO-2 člověk tlusté střevo
THP-1 člověk leukocyty
MCF-7 člověk prsní tkáň
HEK293 člověk lediny
NIH-3T3 myš fibroblasty
6
Suspenzní x Adherentní
7
Kultivační podmínky
• !! sterilní podmínky !! riziko kontaminace
• Nákladné vybavení laboratoře
– inkubátor, flowbox etc.
8
Kultivační podmínky
• Kultivační plasty
• Kultivační média
9
Hodnocení toxicity s využitím buněčných linií
̶ Jediný buněčný typ
̶ Přesně definované homogenní vlastnosti za
dodržení kultivačních podmínek
̶ Možnost sledovat vliv toxikantu přímo na cílovou
strukturu – mechanistická toxikologie
̶ Výsledky odpovídají vlivu látky na samotné
buňky bez interakce s jinými orgány nebo
buněčnými typy !!
10
Působení toxikantu na buňku
= Cytotoxicita
• Odpověď buňky na působení
toxické látky
• Cytotoxický x Cytostatický efekt
– Změna morfologie (velké
buňky, mnohojaderné,
granulace povrchu etc.)
– Metabolické změny
– Útlum proliferace (změny v
průběhu buněčného cyklu etc.)
– Buněčná smrt (apoptóza,
autofagie, nekróza etc.)
11
Buněčná viabilita Dye-exclusion test
̶ Stanovení buněčné viability pomocí barvení buněk vitálními
barvivy
̶ Erythrosin B, tryptanová modř
̶ Živé neobarvené x mrtvé obarvené
̶ průnik barviva přes poškozenou membránu
̶ Hemocytometr (př. Bürkerova komůrka) + mikroskop
12
Buněčná viabilita
Další metody:
LDH analýza
– Porucha integrity membrány – uvolnění LDH – stanovení koncentrace LDH extracelulárně
v médiu
̶ Využití tetrazoliových solí a jejich enzymatické redukce – stanovení změny zbarvení
spektrofotometricky
13
Buněčná viabilita a proliferace
14
Buněčná viabilita a proliferace
̶ Tetrazoliové soli
̶ enzymatická redukce TS (změna barvy)
̶ intenzita změny zbarvení vzorku odpovídá míře jeho metabolické aktivity
̶ MTT; XTT; WST-1
15
Výsledné parametry
• Umožňují vzájemné srovnání efektu testovaných látek
• !! doba expozice, model etc.
• Hodnocení na základě tzv. dose-response curve
Inhibiční
koncentrace
Letální
koncentrace
Efektivní
koncentrace
Toxická
koncentrace
U 10 %
populace
IC10 LC10 EC10 TC10
U 50 %
populace
IC50 LC50 EC50 TC50
U 90 %
populace
IC90 LC90 EC90 TC90
16
Dose-response curve
17
Validované in vitro testy toxicity
Validované - normované
metody OECD (Organisation for
Economic Co-operation and
Development)
• Cytotoxicita
• Genotoxicita
• Oční dráždivost
• Fototoxicita
•Kardiotoxicita
•Nefrotoxicita
•Hepatotoxicita
•Endokrinní toxicita
•Respirační toxicita
•Reprodukční toxicita
•Ekotoxicita
18
Cytotoxicita
• In Vitro Oral Acute Toxicity Test (OECD 129)
Neutral Red Uptake (NRU) test with human/rodent cells (NHK/3T3 NRU assay)
- výsledná data predikují dávku pro testy systémové toxicity in vivo
• Biologické hodnocení zdravotnických prostředků
Dle evropské normy: Zkoušky na cytotoxicitu in vitro (ČSN EN ISO 10993-5, ČSN
EN ISO 10993-12)
Buněčná linie myších fibroblastů 3T3/ lidských epidermálních keratinocytů NHK
Inkorporace NR do lysozomů živých buněk – stanovení míry zbarvené
spektrofotometricky
19
Genotoxicita
Princip: zjišťování mutace – poškození DNA (změna genetického materiálu)
• OECD TG. 471 Mutagenita - test reverzních mutací u baktérií = Amesův test
• OECD TG. 473 Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro
• OECD TG. 487 Mutagenita - in vitro mikronukleus test v savčích buňkách
• OECD TG. 476 Mutagenita - test genových mutací v savčích buňkách in vitro
• OECD TG. 482 Poškození DNA reparace - neplánovaná syntéza DNA - savčí buňky in vitro
• OECD TG. 479 SCE - výměna sesterských chromatid in vitro
• ...
20
Amesův test
̶ Slouží ke stanovení mutagenního a karcinogenního potenciálu chemických sloučenin
̶ Několik kmenů bakterie Salmonella – mutace v genech účastnících se syntézy
aminokyseliny histidinu – vyžadují tedy externí zdroj histidinu
̶ Sleduje se schopnost testované látky způsobit reverzní mutaci a obnovit růst bakterie v
mediu bez přídavku histidinu
21
22
Mutagenita
In vitro mikronukleus test v savčích buňkách
̶ Test validován ECVAM (2006) jako alternativa k MNT testu in vivo
̶ Princip testu:
̶ expozice kultury savčích lymfocytů periferní krve testované látce » detekce mikrojader po
barvení pod mikroskopem
̶ Mikrojádro (micronucleus): fragment chromozómu (oddělený od jádra) v cytoplasmě
23
Oční dráždivost/leptavost
Testovací metody pro identifikaci látek leptavých a silně dráždivých pro oko – ex vivo
BCOP (Bovine Corneal Opacity and Permeability)
OECD TG. 437 Opacita a permeabilita hovězí rohovky
ICE (isolated chicken eye) test
OECD TG. 438 Izolované kuřecí oko
HET-CAM (Hen ́s Egg Test - Chorioallantoic Membrane)
Fertilizovaná vejce - aplikace látek na membránu - sledování změn: hemoragie,
lýza, koagulace, …
24
In vitro
Test kožní leptavosti: model lidské kůže
Validovaný kožní model:
̶ Episkin, Epiderm, SkinEthic....
̶ (rekonstruovaná epidermis - lidské keratinocyty - s funkční stratum corneum)
Princip:
̶ nanesení testované látky na povrch trojrozměrného modelu lidské kůže - MTT analýza–
detekce vlivu látky na buněčnou viabilitu
25
Testy fototoxicity
Zkouška fototoxicity 3T3 NRU in vitro
Fotoaktivní látka + světlo = toxicita
3T3 buněčná linie – myší embryonální fibroblasty
Cytotoxický efekt látky hodnocen v přítomnosti a
bez vystavení netoxické dávce UVA světla
26
Reprodukční toxicita
Embryonic Stem Cell test (EST test)
= hodnocení embryotoxického potenciálu testovaných látek
Průkaz se provádí stanovením inhibice
diferenciace embryonálních kmenových buněk
(ESC) a inhibice růstu ESC a 3T3 buněk
27
Děkuji za pozornost