1  Základy fytochemie a farmakognozie P4 2024/2025 Chromatografické metody TLC, sloupcová chromatografie, HPLC, plynová chromatografie Princip chromatografie Distribuce látek mezi dvě fáze: Mobilní fáze- pohyblivá Stacionární fáze- pevná Separace založená na způsobu, kterým se látka mezi obě fáze rozděluje. Distribuční koeficient: Látky v konstantní, dynamické rovnováze mezi oběma fázemi. Pro danou látku platí: pozice v systému je daná interakcí látky se stacionární fází a soutěží interakcí s mobilní fází. fázemob fázestac D c c K . .  Stacionární fáze: • Pevná • Kapalná Mobilní fáze: • Kapalná • Plynná Klasifikace chromatografických metod Podle uspořádání: • Sloupcová chromatografie- od kapilárních analytických metod po preparativní velké sloupce • Plošná chromatografie- různé formy TLC Podle módu separace: • Adsorpční • Rozdělovací • Podle náboje: Iontově výměnná Iontově párová • Na základě velikosti částic • Biologicky afinitní Co lze vyčíst z chromatogramu 1. Identifikace  Retenční čas- každá látka charakteristický retenční čas v daném souboru podmínek.  Dvě látky stejné tR pravděpodobně stejné látky.  Metoda současného nástřiku.  Ověření pomocí detekční metody. 2. Fyzikálně- chemická povaha látky  Nepolární látky pomalá eluce na reverzní fázi rychlá eluce na normální fázi  Polární látky pomalá eluce na normální fázi rychlá eluce na reverzní fázi 3. Množství  Pro danou látku je oblast pod křivkou chromatografického píku přímo úměrná množství látky.  Standard o známé koncentraci kalibrační křivka.  Odhad koncentrace podle výšky píku. ̶ Kvantitativní analýza ̶ metoda vnitřní normalizace ̶ základní podmínkou je, aby všechny složky analyzované směsi byly eluovány ̶ detektor musí poskytovat lineární, stejně velkou odezvu pro stejné koncentrace všech analyzovaných látek ̶ procentuální složení směsi se pak určí ze změřených ploch všech elučních křivek (analytických signálů, píků) ̶ metoda je velmi jednoduchá, je však problematická, pokud jsou odezvy detektoru pro různé analyty odlišné ̶ metoda absolutní kalibrace ̶ metoda je založena na dávkování známých množství vzorku a standardu za stejných experimentálních podmínek ̶ vyhodnocení se provádí podle kalibrační křivky nebo přímým srovnáním ploch získaných analytických signálů (píků) ̶ musím znát alespoň dva nástřiky do kolony (vzorek + standard) ̶ metoda vnitřního standardu ̶ ze standardu a čisté stanovované komponenty se připraví směsi s různým hmotnostním složením a provede se analýza ̶ sestrojí se kalibrační graf, ve kterém se vynáší poměr ploch píků Avz/Ast proti poměru hmotností mvz/mst ̶ při určování neznámého vzorku se tento vzorek přidá ke známému množství standardu a vyhodnotí se poměr ploch píků vnitřního standardu a stanovované složky ̶ ze známé hmotnosti vnitřního standardu se určí hmotnost stanovované složky ̶ není potřeba přesně znát množství nastřikovaných vzorků ̶ nevýhodou je obtížné hledání vhodné standardní látky ̶ metoda standardního přídavku ̶ metoda je založena na přídavku definovaného množství stanovované látky ke vzorku ̶ provádějí se dvě analýzy, první s původním vzorkem, druhá se vzorkem po přidání daného množství stanovované látky ̶ zvětšení plochy píku je přímo úměrné přidanému množství analytu Selektivita 3 sady molekulárních interakcí Mobilní fáze Látka Stacionární fáze Chromatografie na normálních a obrácených fázích ̶ Použité stacionární fáze mají nepolární charakter ̶ Jako mobilní fáze se používá voda s přídavkem polárních organických rozpouštědel (alkoholy, acetonitril, dioxan, tetrahydrofuran, aceton) ̶ Selektivita je výrazně ovlivňována vlastnostmi mobilní fáze ̶ Eluční síla mobilní fáze roste s její klesající polaritou ̶ Chromatografie na obrácených fázích je vhodná pro dělení látek v homologických řadách ̶ Použití obrácených fází v HPLC dnes převládá ̶ Označení “obrácené fáze” se používá z historických důvodů ̶ Interakce analytů se stacionární fází je založena na procesu adsorpce ̶ Distribuční konstanta zde závisí na celé řadě proměnných (objem monomolekulární vrstvy rozpouštědla, aktivita adsorbentu, eluční síla rozpouštědla) ̶ Je žádoucí, aby docházelo pouze k fyzikální adsorpci, nikoliv k chemické interakci ̶ Mezi nejběžnější adsorbenty patří silikagel či aluminiumoxid ̶ Uplatnění nacházejí také uhlíkaté organické sorbenty ̶ Jako mobilní fáze se často používá nepolární uhlovodík + polární modifikátor Silikagel Gel kyseliny křemičité Adsorbční chromatografie Normální fáze Polární charakter- přítomnost –OH skupin. Silikagel má slabě kyselé vlastnosti (lze jej použít při pH = 2 až 8) Za norm. podmínek- separace látek lišících se polárními funkčními skupinami. Rozdíly v nepolárních funkcích- nedochází k účinné separaci. Modifikovaný silikagel Silikagel + uhlíkový řetězec C2, C8, C18 Rozdělovací chromatografie Nepolární charakter Reverzní fáze Změny v nepolární části molekuly látky ovlivní separaci. Omezený rozsah pracovního pH Tenkovrstvá chromatografie ̶ Jedna z nejjednodušších metod chromatografie ̶ Planární uspořádání ̶ Otevřený systém ̶ Homogenní vrstva sorbentu se chová jako kapilára ̶ Obvykle silikagel ̶ Adsorpční chromatografie ̶ Detekce látek ̶ Nedestruktivní – viditelné nebo UV světlo ̶ Destruktivní – detekční činidla ̶ Porovnání se standardem Tenkovrstvá chromatografie kanabinoidů Fast Blue B detekce Tenkovrstvá chromatografie kanabinoidů Typy kapalinové chromatografie ̶ Klasická sloupcová chromatografie Nejstarší, nejjednodušší. Obvykle normální fáze (silikagel, aluminiumoxid). Velká velikost částic (60-200 μm) První krok separace. Velká množství vzorku. Nanášení vzorku: Kapalný vzorek (dobrá rozpustnost v mob. fázi) Pevný vzorek (špatná rozpustnost, adsorpce na silikagel 1:1) ̶ Flash chromatografie ̶ Stejný princip jako klasika. ̶ Tlak nad mobilní fází (vzduch, N2). ̶ Vyšší tlak vyšší rychlost menší částice sorbentu 40-60 μm. ̶ Rychlejší a/nebo lepší separace. ̶ Nízkotlaká a střednětlaká chromatografie (LPLC a MPLC) ̶ LPLC Hybrid flash chromatografie a HPLC. Mobilní fáze je tlakována na 1-6 atm. Jednoduchá pumpa. Částice podobné velikosti jako flash chromatografie. Různé rozměry sloupců, různé typy sorbentů. ̶ MPLC Sofistikovanější aparát. Menší částice 10-40 μm. Tlak 3-50 atm. Flash chromatografie ̶ Flash chromatografie ̶ Různé systémy ̶ Variabilní rozměry kolon ̶ Různá kapacita ̶ Detekce – obvykle ELSD a UV/Vis ̶ Často kombinace stroje s HPLC Flash chromatografieLPLC 18 Flash chromatografie Zásobník mobilní fáze Injekční ventil Pumpa Chromatografická kolona Detektor Požadavky na HPLC: 1.Kolony plněné velmi jemnými částicemi sorbentu 2.Vysoké průtoky mobilní fáze Řešení: Použití - vysokotlakých čerpadel - kontinuálních detektorů - dávkovacích systémů - nových chromatografických sorbentů Rychlost Účinnost Automatizovatelnost Snadná kvantifikovatelnost výsledků Reprodukovatelnost HPLC Zařízení pro HPLC obsahuje Základní součásti: ̶ rezervoár mobilní fáze ̶ odplynovač (degasér) ̶ čerpadlo, pumpu ̶ dávkovač vzorku ̶ kolonu s chromatografickým materiálem ̶ detektor ̶ jímač frakcí HPLC pumpy̶ střídavé pístové pumpy 35-400 μL, 3-4, střídavá práce fázově o 80-120°, měníme objem pístové komory i rychlost –charakteristickým znakem je zde pulsní tok mobilní fáze –čerpaná kapalina je vytlačována pístem nebo membránou –hlava čerpadla je opatřena dvěma ventily - sacím a výtlačným ̶ stříkačkové pumpy 250-500 mL, píst o konstantním objemu ̶ tlak na píst je vyvoláván mechanicky použitím elektromotoru ̶ pracovní objem čerpadel je 100 až 500 ml ̶ hlavní výhodou je konstantní průtok a nepulsující tlak ̶ vysoká stabilita základní linie detektoru ̶ cena čerpadel je velmi vysoká z důvodu přesného opracování jednotlivých dílů ̶ stabilní průtok se ustavuje pomalu - za 15 až 60 minut ̶ čerpadlo se musí po několika hodinách práce plnit mobilní fází ̶ použitá mobilní fáze musí být odvzdušněna ̶ čerpadlo je vhodné pro práci s vysokými ̶ pumpy tvořící konstantní tlak proudem plynu z tlakové láhve, malý tlak plynu je schopen vytvořit velký tlak v kapalině ̶ pneumatická čerpadla ̶ zdrojem energie je stlačený plyn ̶ plyn je zaveden přímo nad hladinu kapaliny nebo je od ní oddělen pomocí pístu ̶ při kontaktu plynu s kapalinou se plyn částečně v kapalině rozpouští ̶ výhodnější je oddělit plyn od kapaliny prostřednictvím pístu či membrány ̶ čerpadla jsou obvykle bezpulsní, velmi jednoduchá a levná ̶ 1 složková ̶ Vícesložková ̶ izokratická eluce x gradientová eluce ̶ Gradientová eluce ̶ změna poměru složek mobilní fáze ̶ krátí čas analýzy ̶ zlepšuje rozdělení složitějších směsí zvyšuje citlivost ̶ kroková x kontinuální ̶ při dávkování vzorku je nutné překonat velký pracovní tlak uvnitř kolony ̶ nelze použít jednoduché dávkovače známé z plynové chromatografie ̶ nejčastěji se v HPLC používá 6-cestný injekční ventil s vyměnitelnou smyčkou ̶ používané dávkovací ventily dosahují vysoké reprodukovatelnosti nástřiku Dávkování vzorku v kapalinové chromatografii ̶ chromatografickou kolonu volíme podle požadavků na analýzu a podle použité techniky ̶ vedle analytických kolon se setkáváme se speciálními kolonami preparačními o velkém průměru a délce ̶ podmínky analýzy je nutné volit kompromisně s ohledem na dobu analýzy, požadované rozlišení a zatížení chromatografické kolony ̶ je-li požadováno vysoké rozlišení, doba analýzy se prodlouží, kolonu nelze zatěžovat dávkováním velkého objemu vzorku ̶ je-li nutné provést analýzu v co nejkratší době, bude dosaženo horšího rozlišení, kolonu nelze zatěžovat dávkováním velkého objemu vzorku ̶ je-li potřebné analyzovat velké objemy vzorků, doba analýzy se prodlouží a rozlišení bude dosahovat nižších hodnot Volba kolony ̶ jemnější sorbent = vyšší tlak a vyšší dělící schopnost ̶ typy sorbentu: 1) silikagel nebo Al2O3 2) fáze vázaná na silikagelu nebo Al2O3 3) gely 4) materiál s póry o kontrolované velikosti ̶ další dělení: 1) normální fáze 2) reverzní fáze 3) kombinovaná ̶ Průměr okolo 4 mm ̶ Délka 30, 100 a 250 mm ̶ Nerezavějící ocel ̶ Plnivo částice o průměru 2-10 μm, většinou anorganická matrice – silikagel, na něm zakotvené různé stacionární fáze ̶ tzv. sekcionované kolony – pro dělení složitých směsí látek HPLC detektory ̶ Odpovídající citlivost ̶ Stabilita a reprodukovatelnost ̶ Široký lineární dynamický rozsah ̶ Rychlá odezva ̶ Minimální objem detekční cely ̶ detektor může být univerzální nebo selektivní ̶ univerzální detektor reaguje na vlastnosti systému jako celku (refraktometrický) ̶ selektivní detektor reaguje na určitou selektivní vlastnost analytu (fluorescenční) ̶ detektor může být destruktivní (AAS, AES) nebo nedestruktivní (UV/VIS) ̶ detektory lze vhodně kombinovat (vícenásobná detekce) ̶ detektor může pracovat ve více doménách (detektor s diodovým polem) ̶ některé detektory vyžadují připojení pomocí interface (MS) ̶ UV/Vis detekce ̶ Fluorescenční detektory ̶ Radiochemické detekce ̶ Elektrochemické detektory ̶ Nuclear Magnetic Resonance (NMR) detektory ̶ Light-Scattering (LS) detektory ̶ Refraktometrické detektory ̶ Polarometrické detektory ̶ IR detektory HPLC detektory ̶ UV/Vis detekce pevná vlnová délka měnitelná vlnová délka DAD ̶ standardní monochromatický spektrofotometr, vlnová délka se mění otočením hranolu nebo mřížky, v daném okamžiku pouze jedna vlnová délka, deuteriová lampa UV detekce ̶ kontinuální sledování celého spektra UV i Vis: ̶ a) několik standardních spektrofotometrů za sebou – několik UV/Vis regionů ̶ b) DAD - Diode Array detektor - simultánní měření celé oblasti, data okamžitě, možnost tvorby 3D chromatogramu min7 8 9 10 11 12 13 14 15 mAU -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 DAD1 C, Sig=215,8 Ref =700,100 (C:\HPCHEM\1\DATA\SCHIZAND\VZ050217\ST000026.D) 8.071 9.111 9.749 10.487 10.739 11.010 11.276 13.429 14.163 14.394 nm200 250 300 350 mAU 0 5 10 15 20 25 *DAD1, 8.076 (30.8 mAU,Apx) Ref =7.956 & 8.236 of ST000026.D 3D chromatogram Fluorescenční detektory ̶ měří schopnost absorbovat a vydávat světlo při určité vlnové délce. Každá látka může charakteristicky fluoreskovat. Zdroj excitace prochází průtokovou celou do fotodetektoru, měříme vlnovou délku emitovaného světla ̶ citlivost 10-9 až 10-11 g/ml. 1) DNA/RNA 2) Enzymatické metody 3) Protein-Ligand Interakce 4) Další fluoreskující látky 32 Hmotnostní detektory ̶ Měří počet iontů generovaných elektrickým polem ̶ Měření pouze ionizovaných molekul ̶ Různé uspořádání systému ̶ Odlišné způsoby ionizace a separace iontů ̶ Relativně složité a drahé ̶ Extrémní citlivost a přesnost ̶ Získané informace ̶ Molekulová hmotnost ̶ Analýza fragmentů ̶ Strukturní analýza 33 Hmotnostní detektory ̶ Způsob ionizace ̶ ESI – electrospray ionization 34 Hmotnostní detektory ̶ Způsob separace ̶ Ion trap ̶ TOF ̶ Quadrupole 35 Ukázka separace Látka Hmotnosť[mg] 15-16/1 325 15-16/2 16 15-16/3 86 15-16/4 772 15-16/5 23 Analytický HPLC chromatogram frakcie CI CHCl3 15-16 pri 280 nm (metóda Konopi1) Chromatogram semipreparatívnej HPLC pri 254 nm. Zelenou sú zvýraznené oblasti zbierania frakcií. 36 Identifikace CBG UHPLC-MS chromatogram subfrakcie CI CHCl315-16/1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Time (min) 0 20 40 60 6.184.68 9.08 11.108.05 8.48 10.706.82 12.055.343.243.03 9.584.583.92 7.262.54 12.41 14.571.620.72 15.7113.570.15 16.6915.260.96 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 m/z 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 RelativeAbundance 99.41 317.56 287.44 81.43 284.76 140.3873.46 343.50298.6388.33 193.33151.27 208.03114.39 361.45237.12 270.40 391.84 413.64 454.61431.34 470.86 486.72 317.49 99.36 284.70 81.34 143.2373.43 82.28 327.08298.60193.28 208.19107.25 171.39 270.45 353.41224.07 254.30 391.25371.28 429.37 457.42403.39 478.78 495.57 NL: 5.09E5 190821_02#1389- 1428 RT: 6.29-6.46 AV: 40 T: + c ESI Q1MS [50.000-500.000] NL: 6.13E5 190822_12#1381- 1413 RT: 6.32-6.47 AV: 33 T: + c ESI Q1MS [50.000-500.000] 1H-NMR spektrum subfrakce CI CHCl3 15-16/1 v CDCl3 (5 mg/ml) MS spektrum standardu CBG (hore).a MS spektrum subfrakce CI CHCl3 15-16/1 (dole) Analytický HPLC chromatogram subfrakcie CI CHCl3 15-16/1 pozorovaný pri vlnovej dĺžke 215 nm a UV spektrum píku s retenčným časom 8,606 min. OH OH CH3 CH3 CH3CH3 GC - gas chromatography Plynová chromatografie ̶ Analytická separační technika užitečná pro separaci těkavých organických sloučenin ̶ Separace na základě rozdílného rozdělování a selektivní retardace v koloně ̶ Mobilní fáze - inertní plyn, pouze transport analytu kolonou, žádná interakce se vzorkem Zařízení se skládá ze: ̶ Zásobníku mobilní fáze inertní plyn (He, Ar) ̶ Injektoru - udržovaného při stabilní teplotě ̶ Separační kolony obsahující stabilní fázi vyhřívané na kontrolovanou teplotu ̶ Detektoru https://www.agilent.com/en/product/gas-chromatography/what-is-gas-chromatography 39 Princip GC Mobilní fáze ̶ Nosný plyn ̶ Úkolem je transport vzorku ̶ Inertní k analytu i stacionární fázi ̶ N2, H2, He, v případě ionizačních detektorů s radioaktivním zářičem Ar Injektor ̶ U vstupu do kolony ̶ Malý prostor pro zplynování vzorku ̶ Objem vzorku co nejmenší (0.1 - 1 μL) ̶ Teplota komory vyšší než bod varu nejméně těkavé složky roztoku Mobilní fáze ̶ Nosný plyn ̶ Úkolem je transport vzorku ̶ Inertní k analytu i stacionární fázi ̶ N2, H2, He, v případě ionizačních detektorů s radioaktivním zářičem Ar Kolony ̶ Náplňové x kapilární ̶ Různé materiály ̶ Tvar podle typu chromatografu - rovné - tvaru U - šroubovice ̶ Nutnost udržovat stanovenou teplotu rychlost pohybu složek vzorku je závislá na teplotě Hmotnostní detektory Mass spectroscopy MS kombinace ionizačního, fragmentačního a separačního procesu tvorba iontů různými metodami fragmentace látky záchyt - hmotnostní spektrum interface mezi GC/MS - vysoké vakuum - molekulární separátory Electron Impact (EI)- ionizace dopadem elektronového paprsku nebo silného elektrického pole Chemical Ionization- ionizace pomocí ionizovaného plynu Fast Atom Bombardment (FAB) – bombardování xenonovými atomy citlivost 10-8 až 10-10 g/ml. GC-FID https://www.peakscientific.com/discover/articles/precision-solution-for-fid-gas/ ̶ Z kolony odchází separované uhlovodíky ̶ Spalování v plamenu tvořeném spalováním vodíku RH + O → RHO+ + e– → H2O + CO2 ̶ Tvorba iontů a zachytávání signálu ̶ Široký dynamický rozsah ̶ Vysoká citlivost ̶ Stabilní a opakovatelná odpověď GC konopných extraktů a materiálů GC ̶ Analytická technika pro regulační orgány a toxikologické laboratoře ̶ Nestabilita kannabinoidů ve formě kyselin ̶ Vysoká teplota během zplynování vzorku a separačního procesu ̶ Analýza THC ̶ Analýza THC x THCA x celkové THC ̶ Podle legislativy, často nejjednodušší získat celkové THC Total (celkové) THC ̶ Dekarboxylace před měřením ̶ 150 °C po dobu 5 min ̶ MW 900 W po dobu 1 min, 450 W po dobu 3 min ̶ Dekarboxylace i v injektoru a koloně, ale podle techniky může být nekompletní GC konopných extraktů a materiálů Kolony ̶ Různé stacionární fáze ̶ Kannabinoidy oobsahují aromatické skupiny, alkyly, hydroxylové skupiny (v případě kyselin karboxyly) ̶ Aromatické skupiny • Fenylové skupiny v dimethylpolysiloxanesilfenylech nebo směsné dimethylpolysiloxane-dimethyl-difenylové stacionární fáze • Nejčastěji směsné křemíkové nepolární kolony jako je 5% fenyl a 95% dimethylpolysiloxan • Více polární potahované kolony s 35 % fenylů a 65% dimethylpolysiloxanů Derivatizace ̶ Pro překonání problémů s dekarboxylací ̶ Vytvoření stabilních derivátů, zachování těkavosti ̶ Trimethylsilylační činidla → konverze kannabinoidů na trimethylsilyl (TMS) deriváty • Trimethylhalosilany, trimethylsilyl (TMS)-aminy, TMS-estery a TMS-amidy, včetně N,O-bis(trimethylsilyl)trifuoroacetamidu (BSTFA), N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamidu (MSTFA), a N-methyl-N-(tertbutyldimethylsilyl)trifluoroacetamidu (MTBSTFA). • Katalyzátory: trimethylchlorosilan (TMCS), trimethylsilylimidazol (TMSI), trimethyljodosilan (TMIS) nebo octan draselný ̶ Popisováno i lepší rozlišení derivátů než původních kannabinoidů ̶ Deriváty relativně stabilní i při laboratorní teplotě po dobu 48 hod. Vnitřní standardy – kvantifikace ̶ Docosan a tetracosane pro FID ̶ Směsi kanabinoidních standardů ̶ Někdy nedostačující, drahé, málo minoritních kannabinoidů ̶ THC ne příliš často – relativně nestabilní ̶ Využití CBN (pro FID teoreticky 1 korelační faktor) ̶ American Herbal Pharmacopeia používá androsten-3,17-dion pro GC-FID ̶ Využití deuterovaných kannabinoidů (THC-d3, THC-d6 and THC-d9) pro MS detekci Množství GC-MS metod ̶ Typicky tripleQ nebo Ion Trap ̶ Využití typických MRM přechodů 50 GC konopných extraktů a materiálů