1
• Základy fytochemie a farmakognozie P6
2024/2025
Spektrofotometrické metody, spektroskopie, identifikace látek,
kvantifikace
2
Analytické techniky
̶ Určené ke
̶ Strukturní analýze
̶ Kvalitativní analýze
̶ Kvantitativní analýze
̶ Spojené s
̶ Spektrofotometrií
̶ Kolorimetrií
̶ HPLC
̶ GC
̶ TLC
̶ Infračervená spektrometrie
̶ Spektrofotometrie ve viditelné a
ultrafialové oblasti
̶ Hmotnostní spektrometrie
̶ Nukleární magnetická
rezonance
̶ Jejich online kombinace se
separačními technikami
F. W. Herschel (1738-1822)
Zakladatel oboru
infračervené spektroskopie
Paprsek elmag. záření o intenzitě I0 prochází látkou:
• Dochází k absorpci.
• Prochází bez absorpce - úplná transmitance.
• Záleží na frekvenci paprsku a charakteru (ne)absorbující molekuly
Elmag. záření je energie - při absorpci dochází ke změně energetického stavu
látky: ze stavu základního přechází na vyšší energetickou hladinu.
Pokud frekvence záření neodpovídá tzv. Bohrově frekvenční podmínce
(kvantum energie paprsku odpovídá rozdílu energií dvou energetických stavů
látky), nedochází k absorpci.
Spektrum látky = rozdíl mezi dopadajícím zářením a procházejícím.


hc
hEEE počkon ===− ..
Typy absorpční spektroskopie
Závisí na typu přechodu do vyšších energetických hladin a
odpovídajícímu rozsahu frekvencí absorbovaného záření.
• Rotační stav.
• Vibrační stav.
• Excitace valenčních elektronů.
Typy absorpční spektroskopie:
Mikrovlnná spektroskopie
Infračervená spektroskopie
UV/Vis spektroskopie
Elektromagnetické spektrum. Obrázek z UC Davis ChemWiki, CC-BY-NC-SA 3.0
6 Autor: Domestomas. Original version in English by Inductiveload – Translation from English
version, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=100189339
̶ Infračervená oblast leží mezi červenou oblastí viditelného světla a
mikrovlnou oblastí.
̶ IČ oblast
Blízká (NIR).
Střední (fundamentální).
Vzdálená (FIR).
Infračervená spektroskopie
Molekula se může pohybovat různým
způsobem:
V prostoru určitým směrem a rychlostí - translační
pohyb, je spojen s kinetickou energií molekuly
existují 3 translační stupně svobody
Rotace podle jisté vnitřní osyrotační
pohyb, spojen s kinetickou rotační
energií
existují 3 rotační stupně svobody
2222
2
1
2
1
2
1
2
1
vmvmvmmvE zyxK ++==
222
x I
2
1
I
2
1
I
2
1
zzyyxrotkE  ++=
Možnost vibrace - 1 stupeň vibrační volnosti
Dvouatomová molekula
Lineární molekuly: 3N-5 stupňů volnosti
Nelineární molekuly: 3N-6 stupňů volnosti
Každý z vibračních pohybů se projeví jistou
charakteristickou frekvencí.
Každý z vibračních pohybů je spojen s jistým
energetickým stavem.
Molekula může přejít do jiného energetického
stavu přijmutím energie.
Frekvence světelného paprsku musí odpovídat
frekvenci vibrace.
Můžeme měřit frekvence vibrací pomocí
frekvencí světla absorbovaného látkou.


hc
hEEE počkon ===− ..
Infračervené spektrum látky je pak graf závislosti intenzity IČ světla propuštěného
nebo absorbovaného látkou na energii IČ světla vyjádřené ve vlnočtech (cm-1) nebo
vlnových délkách (mikrony). Transmitanci volíme v případě přehledových spekter,
absorbanci při kvantitativním sledování intenzity.
564
748
820
864
1079
1151
1226
1359
1390
1451
1495
1635
2911
2966
3191
3529
3591
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
%Transmittance
1000200030004000
W avenumbers (cm-1)
Vibrace molekuly neznamená přímo absorpci IČ světla. Molekula musí
mít jistý dipolový moment. Může být stalý (HCL) nebo vzniká vibrací
molekuly (CO2).
Asymetrický stretch
Symetrický stretch
Vertical bend
Horizontal bend
IČ spektrum oxidu uhličitého
Aplikace infračervené spektroskopie v organické chemii
Funkční skupiny organických molekul obsahují atomy o různé
hmotnosti spojené vazbami různé síly. Různé vibrační
frekvence.
Příklad:
Karbonyl: 1700 cm-1
Hydroxyl: 3200- 3400 cm-1
O
O H
̶ V organické chemii IČ spektrum dělíme do 3 oblastí:
1. 4000-1300 cm-1
2. 1300-900 cm-1
3. 900-600 cm-1
1. Oblast funkčních skupin a vazebných vibrací.
2. Oblast otisku prstu.
3. Oblast absorpcí aromatického jádra.
Nejdůležitější vybrané frekvence:
Typ vazby Typ sloučeniny Rozsah frekvencí
C-H Alkany 2960-2850(s) stretch
1470-1350(v) scissoring and bending
Alkeny 3080-3020(m) stretch
1000-675(s) bend
C-O Alkoholy, ethery,
karboxylové kyseliny,
estery
1260-1000(s) stretch
C=O Aldehydy, ketony,
karboxylové kyseliny,
estery
1760-1670(s) stretch
O-H Primární alkoholy 3640-3160(s,br) stretch
Alkoholy a fenoly s
vodíkovým můstkem
3600-3200(b) stretch
Karboxylové kyseliny 3000-2500(b) stretch
Využití:
1. Strukturní analýza.
2. Identifikace neznámé látky v kombinaci s dalšími metodami.
3. Identifikace neznámé látky srovnáním se standardem nebo
knihovnou spekter.
4. Čistota.
5. Kvantitativní analýza.
6. Sledování průběhu chem. reakcí.
Příprava vzorku pro IČ spektroskopii
̶ Kapalný vzorek:
̶ Kapalná látka nebo naředěný a rozpuštěný vzorek
̶ Lepší neředit- interakce rozpouštědla a látky.
̶ Nutná velmi krátká optická dráha (0,1 mm)- kyveta nebo dvě destičky.
̶ Ředění na ~ 0,2 M roztok (CCl3, CS2, CHCl3).
̶ Kyveta nebo film.
̶ Pevné vzorky:
1. Metoda tzv. Mull (nujolová metoda)
– Vzorek se po rozdrcení smísí s malým množstvím netěkavého rozpouštědla- vytvoří se pasta, která se
rozetře mezi destičky.
– Pohodlnější, rychlejší, žádné extrémní podmínky.
2. Metoda KBr tablety (pastilková metoda)
– KBr neadsorbuje v IČ nad 250 cm-1.
– Nutná absence vlhkosti.
– Lepší v případě termostabilních látek, lepší homogenizovatelnost materiálu, kvalitnější spektra.
3. Metoda ATR
20
Instrumentace FTIR
Zdroj IČ záření
Dělič paprsků
Detektor
Zpracování dat
Vzorek
Pevné zrcadlo
Pohyblivé zrcadlo
21
By Keshavana - Own work, CC BY-SA 4.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=79781005
4.2: IR Spectroscopy - Chemistry LibreTexts; Autor: Paul Derry
https://chem.washington.edu/instruments/kbr-pellet-press
Instrumentace FTIR
Ultrafialová spektrometrie
Definice pojmů:
λ – vlnová délka
ν – vlnočet
υ – frekvence
c – rychlost světla ve vakuu
h – Planckova konstanta 6,61 x 10-34 J/s
Energie absorbovaná molekulou je kvantová a musí
splňovat rezonanční Bohrovu podmínku.
c
v
==

1
.hE =
Všeobecné principy absorpce elmag. Záření
v oblasti 200 až 900 nm
Za absorpci záření jsou odpovědné určité strukturní elementy, které se nazývají
chromofory.
Chromofory- izolované krátké vazby
Jedná se převážně o  - * přechody
Další absorbující skupiny - auxochromy: působí
• Batochomní posun (červený)
• Hypsochromní posun (modrý)
• Hyperchromní posun
• Hypochromní posun
C
C
C
C
C
O
Konjugované systémy
Vliv prostředí a rozpouštědla
• Změna polohy a/nebo intenzity pásu
Chemický vliv
Tvorba komplexů
Tvorba tautomerů
Polarita rozpouštědla a samotné látky
Disociace
C
C
C
C
̶ Energetické hladiny:
Při absorpci elmag. záření přecházejí elektrony z jednoho eenergetického
stavu do druhého, molekula tím pádem přechází ze stavu základního
do excitovaného.
Interpretace přechodů pomocí molekulových orbitalů
Elektrony se řadí podle energie:
    n
 - vazebný elektron
 -  elektron dvojných a trojných vazeb
n - elektron volného elektronového páru
Nejčastější přechody:
n - *
 - *
 - *
Výběrová pravidla:
Podle nich se řídí jestli k přechodu dojde nebo ne.
1. Při pohlcení kvanta energie se do vzbuzeného stavu může dostat pouze jeden
elektron.
2. Spinové kvantové číslo se při pohlcení energie nesmí změnit.
Lambert-Beerův zákon
lcIIA ..)/log( 0 ==
Tungsten lamp
Deuterium lamp
Flow cell
Diode array
Optical grid
Zdroj UV/Vis
Vstupní štěrbina
Hranol
Polychromátor
Selektor vlnové délky
Kyveta
Fotonásobič/detektor
Strukturní analýza
28
O
OOH
OH
OH
OH
CH3
CH3
CH3
OO
O
OOH
OH
OH
CH3
Využití pro kvantifikaci
29
min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5
mAU
0
200
400
600
800
DAD1D,Sig=280,20Ref=900,50(G:\EXPERIM...141020\KAPSAICIN1410202014-10-2015-49-57\KAPSA141020_005.D)0.105
0.3770.442
0.565
0.679
1.237
1.499
4.119
4.562
4.761
5.677
6.727
6.885
7.419
11.065
12.20012.292
12.392
17.483
18.223
nm250 300 350 400 450 500 550
mAU
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
DAD1, 4.280 (40.1 mAU, - ) of KAPSA141020_005.D
DAD1, 5.534 (136 mAU, - ) of KAPSA141020_005.D
DAD1, 4.774 (1230 mAU, - ) of KAPSA141020_005.D
Kapsaicin kalibrace
Metoda:
Kolona Ascentis Express RP-Amide 2.7 µm, 100 × 2.1 mm
Gradien acetonitril : 0.2% HCOOH
0. minut 30:70, 10. minuta 71:29
Průtok 0.5 mL/min
Teplota 40 °C
Detekce 254 a 280 nm
Nástřik 1 µl
Kapsaicin Dihydrokapsaicin
Nástřik Množství v nástřiku
Plocha
254 nm
Plocha
280 nm Plocha 280 nm
[µL] [µg]
0 0 0 0 0
0,1 0,1 21,4 153,4 120
0,2 0,2 221
0,5 0,5 76,8 561,7 493
1 1 152,9 1112,8
2 2 299,9 2164,3 1970
5 5 762,1 5421,2 4868
y = 0,0066x - 0,0085
R² = 0,9999
y = 0,0009x
R² = 0,9999
y = 0,001x
R² = 0,9999
-1
0
1
2
3
4
5
6
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
NH
OH
O
CH3
O
CH3
CH3
Využití pro kvantifikaci
Kolorimetrické stanovení je založené na vzniku
barevných komplexů se solemi hlinitými nebo
zirkoničitými.
Tvorba komplexů flavonoidů s chloridem
hlinitým se provádí nejlépe v rozpouštědle
sestávajícím ze směsi kyseliny octové a pyridinu.
V tomto rozpouštědle nedochází ke vzniku sraženin,
které absorbují na svém povrchu část účinných látek
a tak způsobují snížení výsledků.
Doprovodné látky (např. chlorofyl) rušící stanovení
se mohou odstranit vytřepáním extraktu chloridem
uhličitým. Výsledky měření se vztahují na standard,
kterým je často rutosid.
30
O
O
H (OH)
O
H (OH)
O
O
H (OH)
O
OH (Oglyc)3
5
7
3'
4'
A
B
flavon (flavonol) dihydroflavon (dihydroflavonol) flavan (flavanol) antokyanidin (antokyanin)
+
C
0,500 g drogy se ve varné baňce smíchá se 150 ml
vody. Zahřeje se k varu a vaří se dalších 30 minut pod
zpětným chladičem. Ochladí se pod tekoucí vodou,
směs se převede kvantitativně do 250ml odměrné
baňky a doplní se vodou po značku. Po usazení částic
drogy se roztok zfiltruje. Prvních 50 ml filtrátu se
odstraní.
Celkové polyfenoly: 5,0 ml filtrátu se zředí vodou na
25,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se smíchají s 1,0 ml
zkoumadla fosfomolybdenan-wolframového, 10,0 ml
vody a 17,0 ml 20% roztoku uhličitanu sodného. Přesně
po 2 minutách od přidání posledního roztoku se měří
absorbance (A) při 750 nm za použití vody jako
kontrolní tekutiny.
Obsah tříslovin v procentech se vypočítá podle vzorce:
m0,316
A3,125


m je navážka v gramech.
C
OH
OHOH
OH O
O
O
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OHHOOC
HOOC
kyselina gallová kyselina ellagová
kyselina hexahydroxy-
difenová
O
OH
OH
OH
OH
OH
katechin (flavan-3-ol)
2R,3R-3,3´,4´,5,7-pentahydroxyflavan
1 2
3
4
3'
4'
Hmotnostní spektrometrie
Principy, zařízení, využití
Principy metody
• Fyzikálně-chemická metoda pro stanovení hmotnosti atomů, molekul a
molekulových fragmentů po jejich přeměně na ionty.
• Možnost charakterizace struktury analyzovaných látek.
• Propojení hmotnostního spektrometru s moderními separačními technikami pro
provádění kvantitativní a kvalitativní analýzy stopových sloučenin a komplexní
matrice.
• Dostupnost moderních iontových zdrojů rozšířila aplikační oblasti RS na
vysokomolekulární netěkavé sloučeniny (biochemický, klinický výzkum).
Obvyklá sestava zařízení
Základní stavební části:
• Iontový zdroj
• Hmotnostní analyzátor
• Detektor
• Řídící jednotka
Práce ve vysokém vakuu
Iontový zdroj
Převod analyzované sloučeniny do ionizovaného stavu
V prostoru iontového zdroje probíhá většina fragmentačních reakcí
Hmotnostní analyzátor – umožňuje separaci směsi iontů s různými poměry
hmotnost/náboj v prostoru nebo čase
Detektor – závisí na počtu padajících iontů
• Součástí každého hmotnostního spektrometru je výkonný, obvykle
dvoustupňový systém generování vakua, umožňující udržet
dostatečné vakuum pro pracovní podmínky.
Ionizace a iontové zdroje v MS
Veškeré informace poskytované hmotnostní spektrometrií se týkají pouze
nabitých částic (iontů).
Energetická náročnost závisí na typu analyzované sloučeniny (7–16 eV).
Použitý charakter ionizace podstatně ovlivňuje aplikaci metody.
Vývoj nových typů iontových zdrojů rozšířil aplikace do oblasti
netěkavých sloučenin s vysokou molekulovou hmotností.
Výtěžek ionizace u většiny technik jen výjimečně překračuje 0,01 %,
proces ionizace omezuje citlivost a dosahovanou mez detekce použité
metody.
Hmotnostní spektrum
̶ Hmotnostní spektrum představuje závislost odezvy detektoru
(intenzity iontového proudu) na hodnotě m/z
̶ Hmotnostní spektra jsou většinou programově převáděna do
normalizovaného tvaru (%)
̶ Nejintenzivnějšímu píku ve spektru přísluší hodnota 100 %
̶ V hmotnostním spektru obvykle pozorujeme pík odpovídající
molekulárnímu iontu a píky odpovídající fragmentovým iontům
Molekulární ion
̶ Molekulární ion má v procesu určení struktury zkoumané látky mimořádný
význam
̶ Molekulární ion má ve spektru nejvyšší hmotnost (s výjimkou píků izotopických)
̶ Molekulární ion je iontem s nepárovým elektronem
̶ Molekulární ion koresponduje s ostatními ionty ve spektru
̶ Svým relativním zastoupením musí molekulární ion odpovídat postulované
struktuře
̶ Intenzita molekulárního iontu ve spektru má přímý vztah ke struktuře stanovované
látky
̶ S rostoucím počtem násobných vazeb a cyklů v molekule intenzita píku
molekulárního iontu roste
̶ Pík odpovídající molekulárnímu iontu může být ve spektru pro některé sloučeniny
dominantní (strychnin), avšak pro jiné sloučeniny (n-dodekan) může být velmi
nevýrazný
Fragmentace v hmotnostní spektrometrii
̶ Možnost detailního poznání procesů fragmentace je limitována neznalostí konkrétních
struktur vznikajících iontů
̶ Obsahuje-li molekulový ion přebytek vnitřní energie, rozpadne se za vzniku iontového
fragmentu a elektroneutrální částice
̶ Pravděpodobnost rozpadu molekulového iontu roste s jeho hmotností, násobné vazby zvyšují
stabilitu molekulového iontu
̶ Míra fragmentace iontů závisí na přebytku energie, kterou tyto ionty obsahují
̶ V procesu ionizace je nejpravděpodobnější odtržení elektronu s nejnižší ionizační energií,
z energeticky nejvyšších vazebných molekulových orbitalů nebo orbitalů nevazebných
̶ Díky nízkému tlaku při EI ionizaci jsou reakce probíhající v iontovém zdroji prakticky
výhradně monomolekulární
̶ Relativní zastoupení iontu ve spektru je dáno rozsahem fragmentace vedoucím k jeho vzniku
a také jeho stabilitou
̶ Fragmentové ionty se při přebytku energie mohou dále rozpadat
Významné mechanismy fragmentace organických molekul
• štěpení s-vazby (iniciované radikálovým centrem)
• a-štěpení iniciované radikálovým centrem
• štěpení iniciované nábojovým centrem
• štěpení cyklických struktur spojené s rozrušením více vazeb
• přesmyky iniciované radikálovým centrem
• přesmyky iniciované nábojovým centrem
Využití hmotnostní spektrometrie
• Strukturní analýza a identifikace chemických individuí
• Informace o funkčních skupinách obsažených v molekule analyzované látky
• Možnost určení izotopového složení
• Rychlá identifikace chlorovaných a bromovaných sloučenin na základě
zastoupení jejich izotopů (79Br, 81Br; 35Cl, 37Cl)
• Využití MS jako detektoru pro GC a HPLC
• Stopová analýza plynných směsí anorganického i organického původu
• Určování nečistot ve velmi čistých látkách
• Možnost aplikace v kvantitativní analýze na základě lineární závislosti mezi
iontovým proudem a koncentrací látky
• Analýza povrchů tuhých látek za použití hmotnostní spektrometrie sekundárních
iontů
832
1045
10691177
1216
1355
1437
1508
1569
1614
2911
2972
3237
3266
3665
3840
3880
FC-7
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
0,090
0,100
0,110
0,120
0,130
100020003000
Wavenumbers (cm-1)
nm200 250 300 350 400 450
mAU
0
50
100
150
200
250
300
*DAD1, 8.916 (317 mAU,Apx) Ref =8.663 & 9.703 of 09111201.D
min0 5 10 15 20 25 30 35
Norm.
0
25
50
75
100
125
150
175
DAD1 A, Sig=254,4 Ref =500,100 (C:\HPCHEM\1\DATA\KARCA\OSTATNI\FC091112\09111201.D)
8.913
Strukturní analýza
563.2
621.0 1149.0
563.2
-MS, 7.4min #368
0
2
4
6
8
5x10
Intens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
O
O-
OOH
HO
O
OH
OH
HO
OH
O
HO
HO
OH
O
O-
OOH
HO
O
HO
HO
OH
O
OH
HO
O
O-
OOH
HO
O
OH
OH
HO
OH
HO
473.41503.44
O
O-
OOH
HO
OH
O
HO
HO
OH
443.39
O
O-
OOH
HO
O
OH
OH
HO
OH
O
HO
515.45
48
ZOOM 1ul MIX std HPLC-MS/MS pos. mode
XICof +MRM(12pairs): 418.920/286.800DaID: Cy.arab1fromSample58(1ul MIXoldcol 5%HCOOH) of 20230417.wiff (TurboSpray) Max. 1.1e5cps.
10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 16.0 16.5 17.0 17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 20.0
Time, min
0.00
5000.00
1.00e4
1.50e4
2.00e4
2.50e4
3.00e4
3.50e4
4.00e4
4.50e4
5.00e4
5.50e4
6.00e4
6.50e4
7.00e4
7.50e4
8.00e4
8.50e4
9.00e4
9.50e4
1.00e5
1.05e5
1.10e5
1.15e5
1.20e5
1.25e5
Intensity,cps
17.01
XICof +MRM(12pairs): 418.920/286.800DaID: Cy.arab1fromSample59(0.1ul Aroniaoldcol 5%HCOOH) of 20230417.wiff (TurboSpray) Max. 5.6e4cps.
10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 16.0 16.5 17.0 17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 20.0
Time, min
0.00
5000.00
1.00e4
1.50e4
2.00e4
2.50e4
3.00e4
3.50e4
4.00e4
4.50e4
5.00e4
5.50e4
6.00e4
6.50e4
7.00e4
7.50e4
8.00e4
8.50e4
9.00e4
9.50e4
1.00e5
1.05e5
1.10e5
Intensity,cps
17.01
19.41
ZOOM 0.1ul Aronia extract HPLC-MS/MS pos. mode
Retention order on MS
Cyanidin diglucoside 12.92 min.
Cyanidin galactoside 15.48 min.
Cyanidin glucoside 16.07 min.
Cyanidin rutinoside 16.57 min.
Cyanidin arabinoside 17.01 min.
Autor: I, User:Pawvic, CC BY-SA 3.0,
https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=2385601
O
+
OH
OH
OH
O
O
O
O
OHOH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
y = 255,33x2 + 494102x
R² = 0,9998
y = -11995x2 + 368712x
R² = 0,9981
y = -2990,5x2 + 318180x
R² = 0,9997
y = -2206,4x2 + 80287x
R² = 0,9994
y = -5978,5x2 + 244327x
R² = 0,9993
0,0E+00
2,0E+05
4,0E+05
6,0E+05
8,0E+05
1,0E+06
1,2E+06
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Area
Am. (ng/OC)
Cy.ara
Cy.gal
Cy.glu
Cy.diglu
Cy.rut