Cvičení z klinické biochemie ____________________________________ /2 Úloha č.3 STANOVENí ENZYMOVé AKTIVITY ALKALICKé FOSFATASY Alkalická fosfatasa v séru pochází především z kostní tkáně (osteoblastů) a mikrosomů jaterních buněk, její aktivita v séru stoupá v důsledků nemocí těchto orgánů. Jako jeden z mála enzymu je alkalická fosfatasa vylučována žlučí do trávicího traktu, její zvýšená hladina v séru tedy může indikovat sníženou průchodnost žlučových cest (cholestasis). Aktivita tohoto enzymu se určuje nejčastěji na základě jeho schopnosti štěpit syntetický substrát p-nitrofenylfosfát, produkt p- nitrofenol má intenzivní žluté zbarvení. Změřte aktivitu alkalické fosfatasy několika níže uvedenými způsoby současně posuďte vliv aktivátoru a inhibitoru. Reagencie: roztok 1: 5.5 mM p-nitrofenylfosfát v glycinovém pufru roztok 2: 5.5 mM p-nitrofenylfosfát + 1 mM MgSO4 v glycinovém pufru roztok 3: 5.5 mM p-nitrofenylfosfát + 0.1 M KH2PO4 v glycinovém pufru 1. Dvoubodové stanovení Postupujte podle následujícího schématu : vzorek blank roztok substrátu (roztok 1 ml 1 ml 1) 0.1 ml - sérum inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě 0.02 M NaOH 10 ml 10 ml sérum - 0.1 ml Po promíchání změřte absorbanci proti blanku při 400 nm. Současně proveďte s aktivátorem - Mg2+_ionty (roztok 2) a inhibitorem - fosfátem (roztok 3).Vypočtěte aktivitu alkalické fosfatasy v katalech, jestliže extinkční koeficient = 18.8 mM-1.cm-1. Posuďte vliv inhibitoru a aktivátoru. Jako vzorek použijte kontrolní sérum EXA E nebo Precinorm E. 2. Kinetické stanovení Kinetická stanovení ALP proveďte setem fy Lachema Alkalická fosfatasa mikro, při použití vlnové délky 420 nm. Stanovení proveďte opět s kontrolním sérem a neznámým vzorkem (2x). STANOVENí CHOLESTEROLU Cholesterol představuje jednu z nejdůležitějších složek lipidů krevného séra. Největší diagnostický význam má skutečnost, že zvýšená hladina cholesterolu je důležitým rizikovým faktorem pro vznik arteriosklerosy. V případě hypercholesterolemie se častěji setkáváme se srdeční nedostatečností a infarkty myokardu. Změny v koncentracích cholesterolu a dalších lipidů v krevním séru doprovázející různé patologické stavy organismu shrnuje následující tabulka: celkov triacyl- cholester fosfolipi é glyceroly ol dy lipidy a mastné kys. hypothyroidismus N ++ + diabetes mellitus + ++ + + nefrotický syndrom + + + + chronická + ++ + + pankreatitida alkoholismus + + obstrukční poškození + N ++ ++ jater akutní virová + + hepatitida Aterosklerosa + ++ ++ + Do poředí zájmu vstoupilo vyšetřování cholesterolu v lipoproteinových frakcích, zejména HDL a LDL. Protože hladina cholesterolu je ovšem také výrazem hladiny lipoproteinů a obě uvedené frakce jsou cholesterolem bohaté, může cholesterol svědčit o poruše metabolismu lipoproteinů (HDL transportují cholesterol do jater a tím umožňují jeho odbourávání. Nízká hodnota cholesterolu v HDL je nepříznivým prognostickým znamením; ukazuje zvýšenou možnost srdečního infarktu). K nízké hladině cholesterolu v HDL se zpravidla druží vysoká hodnota cholesterolu v LDL a naopak. U zdravých lidí ve věku 18 - 35 let je průměrně 29.3 % cholesterolu v HDL, u lidí po infarktu bylo nalezeno jen 14.1 % cholesterolu v HDL. Úkoly: Stanovte koncentraci triacylglycerolů v kontrolním séru REPROCHOL setem fy Sera-Pak; celkovou hladinu cholesterolu setem fy. Lachema a Chemelex a její frakci obsaženou v HDL setem HDL Cholesterol fy Chemelex.