Cvičení z klinické biochemie
                           ____________________________________

                              /2
Úloha č. 6
IZOENZYMY KREATINKINASY (CK) A LAKTáTDEHYDROGENASY (LD)
Pro  diferenciální diagnostiku poruch různých orgánů  má  velký
význam posouzení aktivit některých orgánově selektivních enzymů
a  zejména  izoenzymů.  V  této úloze  jsou  demonstrovány  dva
přístupy používané při analýze izoenzymového spektra v  krevním
séru  -  v  případě  kreatinkinasy  je  to  využití  specifické
inhibice  jednoho  izoenzymu  protilátkou,  u  LDH  je  využito
odlišné substrátové specifity izoenzymů.
A)   Kreatinkinasa  je  hojně  zastoupena  v  různých   tkáních
(kosterní svalstvo, myokard, mozek, prostata, děloha). Enzym je
dimerní; kombinací podjednotek M a B vytváří tři izoenzymy  CK1
(BB),  CK2  (MB)  a  CK3  (MM). Izoenzym  MB  kreatinkinasy  je
specifický pro srdeční tkáň, zatímco izoenzym MM se vyskytuje v
kosterním  svalstvu.  Stanovení aktivity  kreatinkinasy,  a  to
zejména izoenzymu MB, má velký význam při diagnostice srdečních
onemocnění.  Distribuční rozložení izoenzymů v séru:  96-100  %
MM, < 4 % MB.
Stanovení  aktivity  kreatinkinasyvyužívá indikační  a  pomocné
enzymové reakce a Warburgův optický test:

                    CK
 kreatinfosfát + ADP          kreatin + ATP

              hexokinasa
glukosa + ATP                glukosa-6-P + ADP

                  G-6-PD
glukosa-6-P + NADP           6-fosfoglukonát + NADPH + H+

Monotest  CK-MB  fy. Merck obsahuje protilátky proti  izoenzymu
MM,  a  ty  s  ním  vytvářejí  komplex,  který  je  enzymaticky
inaktivní. Na izoenzym MB se protilátky nevážou, jeho  enzymová
aktivita je tedy neovlivněna.
B) Laktátdehydrogenasa
Tetramer LD vytváří 5 izoenzymů kombinací dvou typů podjednotek
H  (heart)  a M (muscle): LD1 (H4), LD2 (H3M), LD3 (H2M2),  LD4
(H3M)  a  LD5  (M4).  K  separaci a  kvantifikaci  jednotlivých
izoenzymů  se  používají elektroforesa, ionexová chromatografie
resp.  imunoprecipitace; jinou možností je právě využití  různé
substrátové specifity těchto izoenzymů. Distribuce izoenzymů  v
krevním séru: LD1 18-33 %, LD2 28-40 %, LD3 18-30 %, LD4 6-16 %
a LD5  2-13 %.
a) Stanovení celkové aktivity LD v séru
Proveďte  stanovení  celkové aktivity LD  Warburgovým  optickým
testem fy. Sevac.
b) Stanovení -hydroxybutyrátdehydrogenasy v séru
Toto  stanovení využívá skutečnosti, že izoenzym LD1 je schopen
poměrně účinně oxidovat i 2-oxobutyrát (-hydroxybutyrát). Tento
izoenzym se vyskytuje především v srdeční tkáni, jeho stanovení
má hlavní význam při diagnostice infarktu myokardu. V játrech a
plících   je  tohoto  izoenzymu  poměrně  málo,  nezanedbatelné
aktivity  však  lze najít i v kosterním svalstvu,  ledvinách  a
erytrocytech. Při vlastním stanovení postupujte podle návodu  v
setu  fy.  Sevac.  Vyhodnoťte obsah izoenzymu  LD1  na  celkové
aktivitě LD ve vašem vzorku.

GESTAGNOST - imunologický průkaz těhotenství
Gestagnost  fy.  Sevac  slouží k průkazu  choriongonádotropního
hormonu  v  moči  gravidních  žen.  Stanovení  proveďte   podle
přiloženého návodu.