Konfokální mikroskop
confocal laser scanning microscope (CLSM)
Historie
• Minský M. (60. léta 20. století)
• Petráň M. a Hadravský M. (1967) - konstrukce konfokálního mikroskopu pracujícího na bázi rotace Nipkowova kotouče
• rozvoj od konce 70. let 20. století - laserový paprsek, počítač
• dvou (multi-) fotonový mikroskop
Confocal - conjugate (sbíhat) + focal (ohniskový)
obě donkyjsou umístěny v ohniscích
Scanning
					c	ican		Size i							
											•	La sei- i			
															
												Spot^			
						-■									
			.'■												
		l											s		
		r'			d								■■		
					%W										
													/		
		>													
		-	---				'J								
															
															
															
															
															
				C	)bj	ec five's Fie of View x				lei					
16x16 Pixels
Microscop
(internet)
Schéma současného
konfokálního
mikroskopu
(s rozmĺtaným laserovým paprskem)
(Vesmír, 1995)
( Bäseiŕ jfc
cip konfokalniho mikroskopu
konfokální clonka
0  paprsky z ohniskové roviny
..... ohnisková rovina
O  paprsky z mimoohniskových rovin
..... mimoohniskové roviny
Konfokální mikroskop na bázi Nipkowova kotouče
(internet)
Využití světla pro CLSM
• reflexe - textura a složení povrchů - elektronických součástek, studium neuronových sítí (pomocí Ag), ...
• difúze
• fluorescence - struktura buňky a tkání, studium metabolických drah, ...
Výhody CLSM
• odstranění mimoohniskových rovin
• vysoký kontrast obrazu
• neinvazní metoda
• zachování prostorového uspořádání
• schopnost vytvoření prostorové rekonstrukce
• digitální forma výstupu - rotace, perspektiva, ...
• schopnost zobrazení buňky - tkáně - mnohobuněčného organismu
• současné použití až 4 kanálů + procházející světlo
Nevýhody CLSM
• délka zpracování materiálu i snímků =>,,vyhasínání fluorescence"
• neostré snímky při nízké intenzitě fluorescence
• pořizovací cena (mikroskop, konfokální nástavec, počítač + program)
snímek z digitálního fotoaparátu
snímek z konfokálního mikroskopu
Srovnání 3 metod užívaných ve fluorescenční mikroskopii
(Lacey, 1999)
Dvoufotonová mikroskopie
• absorbce 2 fotonů fluorochromem ve stejném okamžiku => záření s dvojnásobnou vlnovou délkou (poloviční energie) => excitační záření 700 nm (červená) => emitované záření 900 nm
Výhody
• se zvyšující se intenzitou záření zdroje se zvyšuje pravděpodobnost absorpce 2 fotonů fluórochromem
• excitace fluorochromu jen v zaostřené rovině => odpadá nutnost konfokální clonky => maximum světla
• velká vlnová délka (700 nm) => pomalejší „vyhasínání"
menší rozptyl světla ve vzorku větší penetrace světla ve vzorku malá fototoxicita (x U V záření)
Nevýhody
• cena Ti Sapphire laseru
• ohřev vzorku => užití laserových pulsů než plynulé ozáření
Srovnání konfokální a 2-fotonové mikroskopie
konfokální                                    2-fotonové
|   | oblast excitace •   pozorovaná oblast
Konfokální mikroskopy
TCS SP2
Olympus Fluoview 500
• optické řezy v rovinách XY, XYZ , XZY
• schopnost zaznamenat změny i v časové rovině XYt, XYZt
• současné snímání obrazu v procházejícím a fluorescenčním světle
• použití 4 kanálů zároveň
• sekvenční snímání
• volitelnost rychlosti a typu rastrování => kvalita snímku
• kompenzace šumu, zesíleni signálu
• 3D rekonstrukce obrazu a rotace
faloidin
FITC
fluorochrom    TRITC
F-aktin
vazba aktin-faloidin (FITC)
vazba aktin-faloidin (TRITC)
vazba tubulin-protilátka (FITC)
vazba aktin-faloidin (FITC) vazba DNA-DAPI
neuron, vazba mikrotubulové proteiny-protilátka (Texas-RED)
1 >	vazba aktin-faloidin (FITC) vazba DNA-DAPI vazba mitochondrie-mitotracker red
	^^»
	
Internetová odkazy
http://137.120.28.214/cslm/lpath.mpg
http://www.microscopyu.com/articles/confocal/index.html
http://www.olympusmicro.com/primer/virtual/confocal/index.html
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/iava/multiphoton/excitationbleaching/index.html
http://www.olympusmicro.com/primer/iava/confocal/index.html
http://www.microscopyu.com/galleries/confocal/index.html
http://www.lob.polytechnigue.fr/themes/imagerie fonctionnelle/Anim celU  small.gif