RNA

                                          Nestabilita RNA

                                     Stabilizace RNA a uložení

                                         RNA v diagnostice

                                   

                                   

 Struktura NF1 genu

 -  350 kb

 - 60 exonů

 - 11 - 13 kb mRNA

 - protein neurofibromin
            - 2818 aminokyselin
            - zřejmě tumor supresor



           

Komplikace při molekulární diagnostice NF1

   - problematická klinická diagnostika

   - až 50 % případů de novo
 
   - vysoká mutační rychlost
 
   - velikost genu (350 kb, 60 exonů)

   - absence hot spot oblastí   - nutnost vyhledávání v celém genu

   - nejasná korelace mezi typem mutace a formou postižení

   - neurofibromin - známa funkce pouze jeho centrální domény

   - různé klinické projevy i u pacientů nesoucích stejnou mutaci

                                    Neurofibromin a ras regulace

                     Strategie molekulárně-genetického testování  NF1 pacientů

                      Vazebná DNA analýza v rodinách s výskytem NF1 onemocnění

                                                SSCP

                                                DGGE

                    Sekvenace vzorku DNA s odlišnou elektroforetickou mobilitou

                                        cDNA - SSCP analýza

     







                             Výhody a nevýhody RNA dignostiky genu NF1



- jednodušší a rychlejší skríning multiexonického genu  (10 segmentů cDNA místo 60 exonů), mRNA je
bez intronů



- záchyt sestřihových mutací v intronech



- záchyt delece celého exonu na jedné alele genu



- nižší ekonomické náklady 



- složitější odběr krve pro izolaci RNA



- nižší stabilita RNA



- dlouhé úseky genu NF1 - obtížnější elektroforetická separace a sekvenace



- nejasný efekt mutace na fenotypové úrovni (stejné u DNA diagnostiky!)





                             Další kroky  v diagnostice neurofibromatóz



 - zavedení funkční analýzy proteinového produktu genu NF1,

   (rozlišení neutrálního polymorfismu od mutaci způsobující změny)



 - objasnění souvislosti konkrétní mutace a formy postižení



 - genová terapie, cílená terapie:

                - blokování enzymů zapojených do farnesylace ras

                - blokování dalších cílů aktivovaných proteinem ras

                  pro amplifikaci mitogenního signálu





- zavedení diagnostiky neurofibromatózy  typu 2 na našem pracovišti

          Tab.1: Mutace  identifikované  v NF1 genu v souboru  pacientů

   RNA diagnostika neuroblastomu

*      1.enzym dráhy syntézy katecholaminů

*      katecholaminy - důležité neurotransmitery a

                                   hormony, regulují vnitřní funkce

                                   a motorickou koordinaci

                                - jsou sekretovány 98% NB

                                  (NB je endokrinně aktivní)

                                - jejich metabolity používány pro

                                  sledování průběhu onemocnění

*       exprese TH genu je regulována tkáňově specificky

         během neonatálního vývoje a diferenciace

                                      Biosyntéza katecholaminů

                                           Schéma TH mRNA

                                 Strategie detekce exprese TH genu

E  Izolace mRNA (PB, BM, tkáň nádoru)

Ë  RT-PCR  TH cDNA

I  PCR  TH syntéza úseku DNA odpovídajícího

                 mRNA pro TH

            TH syntéza DNA pro bmG (provozní gen)

                 - kontrola kvality RNA a RT

Í  ELFO - 5% PAGE, barvení stříbrem                    ~ Fragmentační analýza (ABI PRISM)

Î  Stanovení citlivosti  TH RNA izolovaná z NB

                                        buněčné linie IMR-32 



                                  Citlivost detekce TH mRNA - PAGE

                                     Citlivost detekce TH mRNA
                                       - fragmentační analýza

                                 Molekulární markery neuroblastomu

*      Tkáňově specifická exprese TH genu   -  buňky NB

  --    Detekce v KD, periferní krvi - cirkulující buňky NB

  --    Vysoká citlivost detekce(~1b./10^4-5)

*      Nádorově specifická exprese buněčných antigenů MAGE, GAGE

  --    kombinací více molekulárních markerů je možno postihnout heterogenitu NB- zvýší se
  pravděpodobnost záchytu NB

  --    možnost zavedení a aplikace DNA vakcín

*      Klinický význam:

         ë stanovení diagnosy

         ë určení prognosy

         ë sledování průběhu onemocnění (MRD, relaps)

         ë detekci NB buněk v transplantátu před

              autologní transplantací









                                               Závěr

*      Od r. 2001 bylo vyšetřeno 27 pacientů s neuroblastomem , tj. celkem 200 vyšetření exprese Th
genu z různých biologických vzorků