DNA diagnostika Hlavní cíle: * potvrdit diagnózu choroby, která je podmíněna genovou mutací * zjistit genetické dispozice k onemocnění v rodinách s určením rizika u potomků Přímá DNA diagnostika * Detekce mutací v odpovědném genu vždy potvrdí klinickou diagnózu musíme znát: 1 gen , který má být analyzován 2 standartní (wild type) sekvenci tohoto genu Přímá DNA diagnostika * Metoda přímé detekce již známých mutací Přímá DNA diagnostika * Metody přímého vyhledávání neznámých mutací (screenovací metody) - odhalí jakékoliv odchylky v sekvenci DNA pacienta, avšak vždy jen ve srovnání se standartní sekvencí - neodliší patogenní a nepatogenní změny v sekvenci DNA - jsou náročnější časově i finančně Princip metody DGGE SSCP na gelu SSCP v kapiláře SSCP na gelu Cystická fibrosa /mukoviscidosa/ * -autosomálně recesivní onemocnění * -frekvence 1:3000 živě narozených dětí * -výskyt nositelů mutace v genu CF je 1:25 Základní fyziologický defekt při onemocnění CF * Porucha absorbce iontů chloru, sodíku a vody buněčnou membránou * Zasahuje různé orgány - plíce * - pankreas * - trávící trakt * - reprodukční orgány CFTR protein (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein CFTR protein CFTR Mutations * to date, more than 1500 CFTR mutations have been found (CFTR Mutation Table; http://www.genet.sickkids.on.ca./cftr-cgi-bin/FullTable * many of these are rare, "private" or their relationship to desease has yet to be estabilished * fewer than 20 mutations account for majority of cases of CF * the wide range of mutation frequence is observed in different populations * the most common mutation dF508 is found in approximately 70% of CF patients Mutace v genu CFTR u českých CF pacientů (k 1.7.1999) * dele2,3(21kb) 4,64% * G551D 4,03% * N1303K 3,02 % * G542X 2,22% * 1898+1GtoA 2,02% * 2143delT 1,21% * R347P 0,81% * W1282X 0,60% * 4374+1GtoA, 1717-1GtoA, R1162X, E92X, 2184insA, 3849+10kb každá 0,4% * R334W, R553X, 621+1GtoT, ........ každá 0,2% Cílená mutační analýza CF genu je prováděna: * A, pro potvrzení diagnosy 1. u pacientů s dg. CF 2. u členů rodin s výskytem CF 3. prenatálně u plodů v riziku s pozitivní CF rodinnou anamnézou 4. prenatálně u plodů s patologickým ultrazvukový nálezem (abnormalita střevních kliček) 5. u novorozenců s mekoniovým ileem 6. u mužů s poruchami reprodukce Přehled mutací CFTR genu vyšetřovaných na OLG, FN Brno * Základní vyšetření: * dF508, dele 2,3(21kb), G542X, G551D, R553X * Rozšířené vyšetření: * N1303K, 1717-GtoA, W1282X, S1251N, R560T, 3905insT, Q552X, dI507, 394delTT, G85E, 621+1GtoT, R117H, 1078delT,R347P, R334W, E60X,711+5GtoA, 2789+5GtoA, R1162X, 3659delC, 3849+10kbCtoT, 2143delT,A455E, 2183AAtoG, 2184delA * Celkově vyšetřováno 30 mutací v genu CFTR * 95% všech mutací detekovaných u CF pacientů v ČR Detekce 5ti nejčastějších CF mutací klasickými molekulárně genetickými metodami Detekce mutace dF508 Detekce CF mutací G542X, G551D, R553X SSCP analýza PCR produktů exonu 11 Mutace CFTR Dele 2,3 (21 kb) * Druhá nejčastější mutace v CFTR genu v naší populaci, řadí se do základní mutační analýzy pěti nejčastějších mutací CFTR genu. * Delece v úseku tohoto genu od intronu 1 až po intron 3 v délce 21 080 pb * Zahrnuje okolo 25% in.1, ex.2, in.2, ex.3, a okolo 45% in.3. * Analýza transkriptu ukazuje nepřítomnost ex.2 a 3 v epiteliální CFTR mRNA.- výsledek : předčasně ukončená translace v kodonu 106 v ex. 4. * Dele 2,3, (21 kb) je frekventována u populace západo - a východoslovanského původu. Detekce mutace CFTRdele2,3(21kb) ELFO: 5% PAGE, 200 V, 20°C, 2hours Artefakt při analýze * kontrolní produkt 3i5 a 3i3 (309 pb) projevuje nižší intenzitu než 207pb dlouhý spojov. fragment - falešně pozitivní výsledek * heterozygot se jeví jako homozygot * chybu způsobuje i nízká mol.hmotnost DNA a její snížená kvalita Ověření pozitivního výsledku Rodokmen rodiny P. Pacientka Z.V., 15 let důvod vyšetření: rok trvající kašel * CT prokázalo četné bronchiektasie v obou horních plicních lalocích * hyperplazie maxillárních, nosních a sphenoideálních dutin * pankreas, játra bez odchylek * vyšetření chloridů v potu opakovaně se zvýšenými hodnotami (82 - 88 mmol/ml) * zvažována dg.CF Pacientka Z. M., 6 let důvod vyšetření:časté infekty,trvalý kašel Výsledek mutační analýzy genu CFTR genotyp: R347P / 711+5 GtoA dg. CF potvrzena Duchennova muskulární dystrofie * těžká X-recesivní monogenně dědičná choroba * primární příčina: mutace v dystrofinovém genu (Xp21) * incidence choroby 1:3500 novorozených chlapců * destrukce svalových vláken * fenotyp: 1) špatné držení těla, potíže při zvedání se ze země 2) narůstající svalová slabost 3) pseudohypertrofie lýtek 4) lordóza * většina pacientů má abnormální EKG * zvýšenou hladinu kreatinkinázy * někteří trpí gastroparézou * 1/3 vykazuje mírnou mentální retardaci