1
ˇ přesnost
(reprodukovatelnost)
ˇ správnost
(skutečná hodnota)
? Skutečná hodnota
použití různých metod

2
Měření Pb v polyethylenu 36 různými laboratořemi
0,470  0,021 mol.g-1 tj. 97,4  4,3 g.g-1
Měření Pb v říční vodě 181 různými laboratořemi
12,9  0,3 ng.l-1 tj. 62,3  1,3 nM

3
Měření Pb v říční vodě národními certifikovaným laboratořemi
Absorbance - měření
lineární škála
logaritmická škála

4
Přesnost
odečítání
hodnot
Zákon šíření chyb

5
Geometrický význam ­ Pythagorova věta
Typy chyb
ˇ Chyby soustavné (systematické):
- jsou příčinou rozdílů mezi správnou a změřenou hodnotou;
- ovlivňují správnost měření;
- jejich příčiny lze nalézt a eliminovat.
př. špatná kalibrace přístrojů a pomůcek, špatné hodnoty koncentrace roztoků vzatých pro
kalibraci, matrixový efekt
ˇ Chyby náhodné:
- projevují se odchylkami mezi opakovanými (paralelními)
měřeními;
- ovlivňují přesnost měření;
- jejich příčiny není možno eliminovat;
- lze hodnotit jejich vliv na výsledek měření.
ˇ Chyby hrubé:
- vznikají nedopatřením, neznalostí či malou pečlivostí
pracovníka.

6
Výsledky analýz prováděných 4 různými lidmi
nepřesná nepřesná přesná přesná
nesprávná správná správná nesprávná
Detekce druhu chyb
ˇ Správnost měření (vliv soustavných chyb)
- porovnání změřené hodnoty s hodnotou
správnou.
ˇ Přesnost měření (vliv náhodných chyb) -
testování vyhodnocením výsledků
opakovaných měření vhodným statistickým
(chemometrickým) postupem.

7
Detekce systematických chyb
ˇ analýza vzorků o známém složení (Standardní
referenční materiály, SRM ­ rozdíly indikují systematickou chybu)
ˇ analýza vzorku blanku (nenulový výsledek indikace
systematické chyby)
ˇ použití různých analytických metod (neshodný
výsledek ­ systematická chyba v jedné nebo více metodách)
ˇ kruhový (,,round robin") test ­ analýza
různými lidmi v různých laboratořích ­
ANOVA TEST ­ vyšší neshoda než je náhodná chyba indikuje
systematickou chybu)

8
Analýza antikonvulsantních léčiv v krevním séru
Použití SRM ­ NIST (USA)

9
Množina (set) popisující životnost žárovek
Testování přesnosti měření
(základní statistické hodnocení výsledků analýzy)
ˇ Opakování analýzy téhož vzorku:
n počet opakovaných (paralelních) analýz
xi (x1 až xn) výsledek i-tého měření
ˇ Určení střední hodnoty:
pro n < 7 medián
pro n > 7 aritmetický průměr
n
x
x i
=

10
ˇ Odhad směrodatné odchylky:
n < 7
kn , tabelovaný koeficient
R = x(max) ­ x(min) , rozpětí
n > 7
s2 ..... variance
ˇ Výpočet relativní směrodatné odchylky (v %):
n < 7
n > 7
Rks n=
1
)( 2
-
 -
=
n
xx
s i
x
s
sr ~100=
x
s
sr 100=
ˇ Určení intervalu spolehlivosti:
n < 7 L1,2 = Kn R
Kn , tabelovaný koeficient
n > 7
t , tabelovaný koeficient
ˇ Vyjádření výsledku:
n < 7
n > 7
- výsledek je nutné doplnit údajem o počtu stanovení, n, a o zvolené
hladině pravděpodobnosti, pro kterou byl interval spolehlivosti určen
(95 či 99%)
n
st
L

=2,1
2,1
~ Lx 
2,1Lx 

11
n kn
2 0,8862
3 0,5908
4 0,4857
5 0,4299
6 0,3946
7 0,3698
n Kn (0,95) Kn (0,99)
2 6,4 31,8
3 1,3 3,01
4 0,92 1,32
5 0,51 0,84
6 0,40 0,63
7 0,33 0,51

12
n t/(n) (0,95) t/(n) (0,99)
4 1,59 4,61
6 1,05 2,25
8 0,84 1,60
9 0,77 1,42
10 0,72 1,29
25 0,41 0,67
Počet žárovek stejný v obou případech

13
Normalizace Gaussovské křivky
z = (x - ) /   (x - xbar) / s
  1 .....68,3% měření
  2 .....95,5% měření
  3 .....99,7% měření

14

15
Regulační
(kontrolní)
diagramy
Seriová analýza ­
Procesní analytika

16
Význam Studentova t-testu
Stanovení systematické chyby
ˇ srovnání opakovaného výsledku se ,,známou"
hodnotou ­ SRM
tcalc = |xbar ­ ,,známá hodnota| × n/s
ˇ srovnání opakovaných výsledků získaných dvěma
metodami
ˇ srovnání jednotlivých rozdílů u různých vzorků
bez opakování ­ bioanalytika, ŽP
Stejné populace
Různé populace
Jestliže tcalc > t(n1+n2-2, 95%) .......... významný rozdíl
? systematická chyba
Jestliže tcalc > t(degrees_of_freedom, 95%) ..........
významný rozdíl ? systematická chyba

17
Statistický rozdíl na obou hladinách (95% a 99,9%)
Systematická chyba
?

18
Srovnání jednotlivých diferencí ­ analýzy neopakovány ­
stanovení v lidské krevní plazmě
2
( )
1
i
d
d d
s
n
-
=
-
tcalc = |dbar | × n / sd
F-test Fcalc = s1
2 / s2
2 = var1 / var2

19
Testování hrubých chyb
(vylučování odlehlých výsledků)
ˇ Dean-Dixonův test
(pro malý počet měření)
Qcalc = rozdíl / rozpětí
ˇ Grubbsův test
(pro větší množinu měření
s opakováním)
1
1
x x
T
S
-
= n
n
x x
T
S
-
=
2
1
1
( )
n
i
i
S x x
n =
= -
1n
S s
n
-
= ×
2 1
1
x x
Q
R
-
= 1n n
n
x x
Q
R
--
=
n kn Kn
 = 0,05  = 0,01
Qn
 = 0,05  = 0,01
Tn
 = 0,05  = 0,01
2 0,8862 6,353 31,822 -- -- -- --
3 0,5908 1,304 3,008 0,941 0,988 1,412 1,416
4 0,4857 0,717 1,316 0,765 0,889 1,689 1,723
5 0,4299 0,507 0,843 0,642 0,760 1,869 1,955
6 0,3946 0,399 0,628 0,560 0,698 1,996 2,130
7 0,3698 0,333 0,507 0,507 0,637 2,093 2,265
8 0,3512 0,288 0,429 0,468 0,590 2,172 2,374
9 0,3367 0,255 0,374 0,437 0,555 2,237 2,464
10 0,3249 0,230 0,333 0,412 0,527 2,294 2,540

20
ANOVA
Analysis of Variances
- umožňuje analýzu zdroje chyb

21

22
Limit detekce
cdl = cblank + 3 sblank
Limit stanovení
cst = cblank + 10 sblank

23
Kalibrace analytické metody
(přístroje)
Analytické metody
ˇ absolutní ­ nevyžadují kalibraci; klasické a některé instrumentální metody (např.
elektrogravimetrie, coulometrie, aj.)
ˇ relativní (komparativní) ­ stanovení založeno na kalibraci přístroje
použitého k měření analytického signálu; většina instrumentálních metod
Dvoustupňový analytický proces u relativních instrumentálních metod
ˇ Kalibrace ­ hledání funkčního vztahu mezi odezvou přístroje
produkující analytický signál, S, a koncentrací analytu (standardy), c :
S = f(c)
ˇ Vlastní stanovení ­ změření signálu S pro neznámý vzorek a výpočet
jeho koncentrace z funkce použité pro kalibraci ­ inverzní problém
Stránka laboratorního
deníku Martina Franta
(fa Orion)
první F- elektroda

24
Příklady S = f(c)
ˇ lineární : A =  × c × l, IF = k × c,
Il,dif = k × c
ˇ lineární po transformaci
E = const + log (c)
log(I) = const + b × log(c)
ˇ exponenciální E = 10-c
I = a × cb
Linearizace funkční závislosti ­ lineární regrese
Citlivost ­ směrnice kalibrační přímky (křivky)
Metody kalibrace přístroje
ˇ metoda kalibrační křivky
ˇ metoda standardního přídavku
ˇ metoda vnitřního (interního) standardu
ˇ metoda vnějšího (externího) standardu
Volba většinou podle velikosti matricového
efektu

25
Prezentace matricového efektu
Lineární regrese ­ metoda nejmenších čtverců

26

27
dynamický rozsah

28
Detekce linearity
Hyperbolická
neurčitost
kalibrační křivky
-inverzní problém
stanovení koncentrace
analytu

29
Metoda kalibrační křivky
Metoda standardního přídavku ­ lineární závislost

30
Modifikace
H-point metoda
eliminace matricového
efektu a efektu blanku

31
Vnitřní standard
Neznámý vzorek
Metoda vnitřního standardu AX / cX = F (Ast / cst)
Faktor odezvy
Různý chemický charakter
,,Spiking" metoda
Stanovení EDTA v krevní plazmě
spikováno 1 M Ni(edta)

32
Stanovení léčiva Cefotaximu
známé nečistoty 2,3,5-9

33
Obecné zásady při provádění kalibrace
ˇ počet kalibračních vzorků n > 6;
ˇ při metodě kalibrační křivky by koncentrace
neznámého vzorku měla ležet v
dynamickém rozsahu metody
ˇ koncentrace analytu v kalibračních
roztocích by měly být odstupňovány
nelineárně (např. 1, 2, 4, 8, 16...), resp.
podle chemometrických požadavků
Výhody a nevýhody kalibrace pomocí
metody kalibrační křivky
ˇ kalibrační graf či rovnici lze použít
opakovaně;
ˇ závislost S = f(c) nemusí být lineární;
ˇ kalibrační roztoky mají jinou matrici než
vzorek

34
Výhody a nevýhody kalibrace pomocí
metody standardního přídavku
ˇ vliv matrice na odezvu je stejný u vzorku i
kalibračních roztoků;
ˇ kalibraci je nutno provádět při analýze
každého vzorku;
ˇ metoda je použitelná pouze v případě
lineární závislosti S = f(c)
Validace metody
Příklad
spektrofotometrické stanovení rimantadinu