Metody separace proteinů Literatura * Anzenbacher, Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky * Ferenčík : Biochemická laboratorní technika * Scopes : Protein Purification * Harris : Protein Purification Methods -- Practical Approach * Deutcher : Guide to Protein Purification * Janson : Protein Purification * Kastner : Protein Liqiud Chromatography Metody separace proteinů * Vychází z klasických metod chemické analýzy * Uplatňují se zde i speciální metody Separace kvalitativní * Analytické kvantitativní * Preparativní Charakterizace -- pI, MW, spektra, AMK .... Problémy se vzorkem * Komplexnost * Malá množství * Labilita Zásady pro práci s biologickým materiálem * Teplota * pH + iontová síla * Koncentrace bílkoviny * Pěnění * Lokální přebytky * Proteázy Plánování separace bílkovin Cíl izolace * Získání homogenní bílkoviny * Zachování biologické aktivity * Čistota Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením patřičného úsilí Volba vstupního materiálu * Preparát z daného organismu * Preparát s největším obsahem dané bílkoviny * Preparát s nejmenším obsahem nečistot Volba a kombinace separačních metod * Rozlišovací schopnost * Selektivita * Kapacita * Zpětný výtěžek * Náklady -- materiál, přístroje, člověk * Stupeň zřeďování a koncentrace * Slučitelnost mezi metodami Základní zásady * Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením (r) velké množství levného vstupního materiálu * Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná (r) ve vzorku již investovaná práce * Pořadí volit tak, aby metody na sebe vhodně navazovaly * Metody zřeďovací kombinovat s metodami koncentrujícími * Metody nepoužívat opakovaně Sledování průběhu separace Stanovení koncentrace bílkoviny Kjeldahlova metoda -- stanovení N[2 ]* Mineralizace vzorku -- převedení organického dusíku na NH[4]^+ * Stanovení NH[4]^+ - titrace, fotometrie, selektivní elektrody UV spektrofotometrie * 280 nm -- aromatické AMK interference nukleotidů * 180 - 230 nm -- peptidická vazba Výhody - nedestruktivní metoda - není třeba kalibrace VIS spektrofotometrie Přídavek činidla (r) barevný derivát * Destruktivní metoda * Nutná kalibrační závislost Biuretová metoda Princip : Cu^2+ vytváří v alkalickém prostředí komplex se 4 N peptidické vazby Cu^2+ Měření : 540 -- 560 nm 310 nm Folinova metoda Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany na molybdenovou modř Měření : 725 nm Lowryho metoda Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody Měření : 600 nm Metoda dle Bradfordové Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. Meření : 595 nm Fluorescence Princip : - vazba fluoroforu na bílkovinu (r) měření vzniklé fluorescence - zhášení fluorescence přídavkem bílkoviny Polarografie Princip : Brdičkova reakce -- SH skupiny bílkoviny vstupují v přítomnosti Co^2+ katalytické reakce na Hg elektrodě (r) proud Nejčastěji používané metody Stanovení biologické aktivity Enzymatické,imunologické, toxické, hormonální receptorové atd.. Vlastní separace Obecné schéma Vstupní materiál Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné množství - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - genetické inženýrství - termofilní organismy Bezobratlí Hmyz, plži, mlži Nevýhody - málo se používá, nesnadno se získává Živočišné tkáně * Laboratorní zvířata -- myši, krysy, králíci * Jateční zvířata -- orgány * Člověk -- tělní tekutiny Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách Nevýhoda -- problematický růst za definovaných podmínek Manipulace s biologickým materiálem * Pokud možno zpracovat co nejdříve * Zmražení -- při -- 60 -- 80 ^oC * Rozmrazování -- co nejrychleji Rozbití a extrakce Bakterie * Záleží na lokalizaci Balotina Princip -- jemné skleněné kuličky přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány nebo míchámy -- nutno chladit French (X) press Princip -- zmražená bakteriální suspenze protlačována malým otvorem, přičemž dochází k rekrystalizaci a rozrušení buněk Ultrazvuk Princip -- ultrazvuk (> 20 kHz) v roztoku vyvolává střižní síly -- nutno chladit Lysozym + osmotický šok (mírný osmotický šok) Princip -- lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou H[2]O -- bakterie popraskají Další * Alumina Al[2]O[3] -- roztírání v třecí misce [* ] Opakované zmražování a rozmražování [ ] Kvasinky Toluenová autolýza Princip -- toluen extrahuje při 35 --40 ^oC fosfolipidy buněčné stěny (r) osmotický šok (r) enzymová autolýza Balotina, French press, Živočišné tkáně * Třecí miska s pískem * Ruční homogenizatory -- Potter -- Elvehjemův * Mixery * Osmotická lyse - erytrocyty Rostlinné tkáně * Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas, * Obsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony -- melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny Optimalizace extrakce * Teplota -- 4 -- 6 ^oC chlazení * pH -- optimální pro danou bílkovinu -- práce v pufrech * I -- v prostředí o definované iontové síle * Přídavky látek -- EDTA, b-merkaptoethanol, kovové ionty, inhibitory proteáz Separace subcelulárních organel Enzymy - markery Membránově vázané bílkoviny Izolace membránových bílkovin * Chemicky -- detergenty, chaotropní soli, organická rozpouštědla, nízká iontová síla, * Fyzikálně - homogenizace, sonikace * Enzymaticky -- fosfolipasy, lipasy, proteasy Centrifugace Použití Otáčky (r) g Rozdělení centrifug Preparativní centrifugace Metody nanášení vzorku Preparativní centrifuga Preparativní centrifuga Preparativní ultracentrifuga Rotory * Úhlový -- diferenciální centrifugace * Výkyvné -- zonální centrifugace * Zonální -- bez kyvet, vzorek je uvnitř rotoru Úhlový rotor Výkyvný rotor Gradientová centrifugace média * Sacharosa * Glycerol * Ficoll - dextran * Percoll -- SiO[2 ] * CsCl -- gradient vzniká během centrifugace Gradientová centrifugace Gradientová centrifugace Zonální rotor Centrifugace se zonálním rotorem Analytická ultracentrifuga Analytická ultracentrifuga Kyveta Analytická centrifugace Analytická ultracentrifugace Metoda sedimentační rovnováhy Metoda sedimentační rychlosti Fázové separace Odstranění H[2]O rotační vakuová odparka Odstranění H[2]O lyofilizace Odstranění H[2]O zahuštění Použití semipermeabilní membrány Odstranění H[2]O zahuštění Použití semipermeabilní membrány Odstranění H[2]O zahuštění Použití semipermeabilní membrány Odstranění nízkomolekulárních složek Dialýza Stanovení interakčním konstant Rovnovážná dialýza Ultrafiltrace Použití speciálních membrán s definovanou velikosti pórů - tzv. cut-off limit Ultrafiltrace míchané cely Ultrafiltrace centrifugační přípravky Ultrafiltrace Hollow fiber -- dutá vlákna Ultrafiltrace Hollow fiber -- dutá vlákna Příprava laboratorní vody Nečistoty ve vodě * Soli -- těžké kovy - denaturace * Organické látky -- HPLC, GC * Hrubší částice -- mikroorganismy * Koloidní částice - biomakromolekuly Kriteria čistoty * Vodivost -- 18 MW/cm * Těžké kovy -- AAS * Pyrogenita Postupy čistění destilace * Destilace -- teoreticky odstraní všechny složky, prakticky jsou strhávány těžké kovy z elektrod (Cu, Zn, Fe) * Redestilace -- křemenné aparatury Nevýhoda -- náklady na vodu a elektrickou energii Postupy čistění reverzní osmoza * Nevýhoda -- malá kapacita, nevyčistí úplně Postupy čistění deionizace * Kolony se směsnými ionexy -- katex + anex Postupy čistění elektrodeionizace Postupy čistění odstraňování org. látek * Speciální patrony s aktivním uhlím a jinými sorbenty * UV -- 180 nm + 254 nm - oxidace org. látek, - likvidace bakterií Postupy čistění filtrace * Membránová -- vetší póry -- bakterie * Ultrafiltrace -- malé póry - koloidní částice Kaskádový systém kombinace Kaskádový systém kombinace Millipore