snímek 1 Chromatografické metody snímek 2 Podstata „Při chromatogrqfii dochází k neustálému vytváření rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze - stacionární a mobilní." snímek 3 Chromatografie Mobilní fáze - kapalina - LC plyn - GC Eluce - Izokratická - stejná eluční síla Gradientova - rostoucí eluční síla Použití - analytická preparativní snímek 4 Kapalinová chromatografie LC| • Mobilní fáze kapalina • Stacionární fáze pevná fáze, kapalina snímek 5 Provedení L C • Papírová PC • Tenkovrstvá TLC • Kolonová CC snímek 6 Teoretické aspekty chromatografie snímek 7 Chromatografie leluent vzorek JjjgjK i--------1 i—i sorbent \m "**•* t****** B°°o anály t leluát snímek 8 Chromatogram peak width snímek 9 Retenční - eluční čas tr Doba od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky Retenční - eluční objem Vr Objem mobilní fáze protekly od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky Vr = tr-Fm Fm - objemová rychlost mobilní fáze snímek 10 snímek 11 Mrtvý objem Vr - zdánlivý retenční objem Vr,- redukovaný (skutečný) retenční objem Vm- mrtvý objem - mimokolonove příspěvky + mimočásticový objem kolony Kapacitní faktor k' k'=l-10 Vs - objem stacionární fáze VM - objem mobilní fáze Distribuční koeficient cs - rovnovážná koncentrace látky ve stacionární fázi cM - rovnovážná koncentrace látky ve mobilní fázi snímek 12 Účinnost kolony počet teoretických pater N N = 5.545 112Y, taiglil/ľ snímek 13 Účinnost kolony výškový ekvivalent teoretického patra H 1 - délka kolony snímek 14 Účinnost kolony snímek 15 Rozlišení snímek 16 Síly a efekty využívané při separaci • Iontové síly • Polární síly • Nepolární síly • Sterícké interakce • Efekt velikosti molekul snímek 17 snímek 18 Rozdělovači chromatografie Použití - analytická PC, TLC snímek 19 snímek 20 Adsorpční chromatografie a-Cm O-Cm 1 + U ■ Cm «1 / /"" a ■ Cm » 1 CM snímek 21 Adsorpční chromatografie Stacionární fáze - polární Silikagel Si02. n H20 Oxid hlinitý A1203, AIO(OH), Al(OH)3 Hydroxyapatit [Ca5(P04)3OH] snímek 22 snímek 23 Adsorpční chromatografie Mobilní fáze - nepolární Eluce - zvyšováním polarity mobilní fáze Eluotropická řada: uhl ovodíky plná ionizace analytu snímek 27 Hydrofobní chromatografie • Stacionární fáze - - C8, -fenyl • Mobilní fáze - vodné roztoky 1.7M(NH4)2S04 • Eluce - snižováním iontové síly Použití : purifikace bílkovin snímek 28 snímek 29 lonexová chromatografie elektrostatická interakce Vazba Eluce ■•■ . _*, snímek 30 Ionexy • Katexy - - vazba kationtů silné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSO, slabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) COO • Anexy - + vazba aniontů silné - dietylaminoetyl(DEAE) slabé - trietylaminoetyl(TEAE) snímek 31 Slabý ionex Vykazuje změny vazebné kapacity v závislosti na pH Má pufrační kapacitu PH snímek 32 snímek 33 Donanův efekt —e oH- zvyšování pH snižování pH snímek 34 lonexová chromatografie • Nanášení vzorku - nízká iontová síla • Eluce - gradientova • Zvyšováním iontové síly • Změnou pH • Afinitní eluce Použití - purifikace, zakoncentrování, výměna pufru snímek 35 Chromatofokusace děj na koloně R / —N \ R -V* \ R ffi/RH \ R e/RH \ R pH=9 pH=4 snímek 36 Chromatofokusace chování vzorku pH pí ®t O 0 ®©©®©©©ffi@©©©©©©©© snímek 37 Chromatofokusace chování vzorku Použití : analytické - stanovení pí preparativní - punfikace bílkovin snímek 38 Afinitní chromatografie -^m Msand spacer matri" snímek 39 Afinitní interakce Afin tni iiiterakre specifický - stabilní -----------!► kirmpl x bílkovina - Ugánd rererzibilní J inlemkte hydrofobnl ^^ uspořádáni ^^" vlastnosti prostředí van der Wsalsovy sily snímek 40 Interakce mezi DNA a endonukleasou snímek 41 Afinitní páry Ligilrtd Bilkmind Kd(M) antigen pt>K U until ni protilátka 10*- 10"" Ľ11I1Ľ.J11 monoklonal n í protilátka LO""- 10* Ltin svito 10J5 siachiarid lekli 11 10*- ht' hormon, toxin vazebný protein i o"'- mu sutana enzym L0"'- 10"3 mhihioi -*» 10"-10* Ku-lO^-K^M snímek 42 Afinitní chromatografie nanesení vzorku '.a S r snímek 43 Afinitní chromatografie vznik interakce •KrS • •»a > •fr© * snímek 44 Afinitní chromatografie vymytí balastů •wt-a r Ä snímek 45 snímek 46 Předpoklady pro vznik komplexu • Sterícké - použití raménka (spacer) 9 -0 snímek 47 Optimální pH, iontová síla Předpoklady pro vznik komplexu • Vazebné • Konformační ft ■♦ ■• VV* ■ ♦■•« JB3_ snímek 48 Provedení • Nanesení vzorku - nízká iontová síla • Eluce - selektivní - volným ligandem - neselektivní - změna pH, iontové síly, polarity Použití : analytické (stanoveni K), purifikace snímek 49 Gelová permeační chromatografie snímek 50 Gelová permeačn chromatografie | gel mov snímek 51 Gelová permeační chromatografie Princip - stérická exkluse - omezená difuse Pořadí eluce : MrA>MrB>MrC snímek 52 C }el ch ová permeační romatografie S E 1 ! Selektivní permeace 1 s i \.i Elutioíi«olume[ml] snímek 53 Gelová permeační chromatografie • Nanášení vzorku - objem vzorku < 2% objemu kolony • Eluce - izokratická Použití : stanovení Mr, odsolování, purífikace snímek 54 PC a TLC snímek 55 PCa rix • 1944- - Martin, Snyge - PC aminokyselin (Nobelova cena) • 1952- - TLC nahrazuje PC snímek 56 Instrumentace PC a TLC snímek 57 Chromato grafický papír • Nemodifikovaný • Modifikovaný - ionexy, acylace f. Watman (Anglie) Schleicher-Schüll (Německo) snímek 58 TLC Vlastní příprava - sypané, nalévané Komerčně dostupné - Siluful (Cz) Watman snímek 59 PC a TLC - mody • rozdělovači • adsorpční • íonexova • hydrofobní - RPaHIC • gelová permeační snímek 60 Nanášení vzorku • Pipety • Kapiláry snímek 61 Provedení • Vzestupné • Sestupné • Kruhové • Dvojrozměrné snímek 62 snímek 63 Sestupné snímek 64 snímek 65 snímek 66 Dvojrozměrné 1 II 1 1 0 O 0 0 0 0 o 0 ° o » 1 •• • • 0 0 snímek 67 snímek 68 snímek 69 Provedení • Analytické • Preparativní Analýza kvalitativní 4—¥- fr—^Sr- standardy vzorky Analýza kvantitativní Plocha Denzitometrie snímek 70 Denzitometrie 1 ? 3 6 7 8 «4|:4. v^&^ 5 chr o m atogr am. u 1 svetelný zdroj 5 chrornatogram 2 čočka 6 fotonásobič 3 monochromátor 7 zesilovač 4 zrcadlo S zapisovač snímek 71 Denzitometrie signál * o | ^poloha snímek 72 Preparace • PC- vystřižení a eluce skvrny • TLC - vyškrábání a eluce skvrny - odsání a eluce skvrny snímek 73 snímek 74 Chromatografie Chromatografie Cvet - separace chlorofylů na A1203 1906 snímek 75 Kapalinová chromatografie rozdělení Nízkotlaká (atmosferický tlak) - LPC Střednětlaká (4 Mpa) - FPLC Vysokotlaká (40 Mpa) - HPLC snímek 76 Kapalinová chromatografie využití LPC - semipreparativní FPLC - semipreparativní a analytická HPLC - analytická snímek 77 Kapalinová chromatografie doba trvání • LPC-hodiny • FPLC - desítky minut • HPLC-minuty snímek 78 Zařízení pro LPC >'_____ji ■z snímek 79 Instmmentace pro LPC • Pumpa - peristaltická nebo gravitace • Gradient - mísič gradientu • Dávkování - přímo pumpou na kolonu • Kolony - skleněné • Detekce - spektrofotometrická 254, 280 nm • Vyhodnocování - zapisovač • Sběrač frakcí - programovatelný snímek 80 Instmmentace pro FPLC a HPLC snímek 81 Zařízení pro HPLC Column Detector Interface -á D ata station CT 1 ___ # tu lipoid» ď MÍlHlini E=l|// mH------w/ 1 | Injection u a Mobile phase (e lue| Pump uent) snímek 82 snímek 83 snímek 84 Lineární dávkovače HB a ■ syringe d - motor b- sede - fill system snímek 85 Pumpa j ednopístová ^3 start of fill I T sfart of pump snímek 86 snímek 87 Pumpa dvoupístová snímek 88 snímek 89 snímek 90 Tlumení pulsů PISTON CAMS MOVEMENT F LOW-PRESSURE PROFILE PROFILES • ^ duaľpištoľvfrľ*^ rtirtntaiiniíeijcjiiil aftfcr damphering [0.5 ml dampher) Tlumení pulsů snímek 91 Gradient nízkotlaký Solu en t aVV f^~p\ Sv5tem controller ^Jr^W^Kxl ht\\ PUMP Solvent B '^K^^ snímek 92 Gradient vysokotlaký (í SolventU Solvent B ^ŕŕtamcoutJoILai i . 1 to the injector fix Önpr'MPB snímek 93 Dávkování - dávkovací ventil Syringe Rheodyne Valve snímek 94 Dávkovací ventil - „Load" snímek 95 Dávkovací ventil - „Inject" INJECT from pump ^^^^^L ia\ \jp^l ^^A snímek 96 Kolona Standart column hardware in palinu/ S.S. hihť 1/4-1 U>"^ Nut Ferrule snímek 97 snímek 98 Detektory snímek 99 Refraktometrický detektor sample cell ^ . _^, 1 incident N / beam 1 ,/_-- k^e La \ | \_ief erence cell snímek 100 lefraktometrický detektor Wafers design ligksora \Z\ d ad|UslmsMi control íJalsctůf snímek 101 Refraktometncký detektor Varian desiqn TI f'ow [ 4JLL- ^^--' lighluc adjustment control y, snímek 102 UV - VIS detektor detekční cela snímek 103 UV-VIS detektor s fixní vlnovou délkou Rife r •7 m ^y Flow cell snímek 104 UV-VIS detektor s proměnlivou vlnovou délkou . , . . reference dutenum bearn^ photo „,„„,, snímek 105 UV-VIS detektor s diodovým polem sr"ll ^^ amplifier I f^jL*1" snímek 106 snímek 107 Elektrochemický detektor Working Reference electrode/ ^electrode snímek 108 Konduktometrický detektor .1. T snímek 109 snímek 110 „Termospray" snímek 111 „Electrospray" rflr MJ snímek 112 snímek 113 Derivatizace „pre-column" - před vlastní analýzou „post-column" - za kolonou po analýze snímek 114 Šumá drift detektoru >2*noise U|yrf//^ *fWľl — — -~"7Drift | fNoise Mez detekce S/N > 2-3 Mez stanovitelnosti S/N > 10 snímek 115 Vyhodnocení Zapisovače Integrátory Integrační software + PC snímek 116 Provedení • Analytické • Preparativní snímek 117 Analýza kvalitativní Srovnání retenčních časů (objemů) píku u vzorku a standardů „spiking" - přidání standardu do vzoru —> nárůst výšky píku Specifická detekce - UV-VIS, fluorescence, elektrochemická MS snímek 118 Analýza kvantitativní i Plocha (výška) píku • Metoda externího standardu • Metoda vnitřního standardu Metoda standardního pndavku snímek 119 L C analýza o? j^ pSP j_jUI fe_