snímek 1 Elektromigrační metody snímek 2 snímek 3 Podstata „Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli" Historický přehled 1880 - první elektroforetické separace Smirnow,Hardy 1897 - regulační frunkce Kohlrausch 1930 - volná elektroforéza Tiselius (1948 Nobelova cena) 1962 - izoelektrická fokusace Vesterberg, Svensson 1967 - kapilární elektroforéza v rotující 1-3 mm křemenné kapiláře Hjerten 1970 - SDSPAGE Laemmli 1975 - 2D-elektroforéza O Farrell 1976 - isotachoforéza Everaerts, Mikkers snímek 4 snímek 5 Teoretické aspekty elektromigračních metod Mobilita E - Fe Fr l + l ŕ + J snímek 6 Elektrická síla F, E = intenzita elektrického pole [V/m ô = náboj částice = ^ X e \\ Frikční sila Ff v = rychlost častice yprikční koeficient) = 6n.r|J snímek 7 Ustáleny stav ExQ=vxf I ExQ _v_ß mobilita ---->""~]?~7 '""" snímek 8 Sekundární jevy • Jouleovo teplo • Elektroosmoza snímek 9 Jouleovo teplo u Exi i2 S KXS2 P=výkon[Wjii3] S = průřez [m2] K= vodivost [£1-'.m'] i = elektrický proud [A] snímek 10 Elektroosmotický tok i © © / © © e o © © o!°o1. ° e l -SiOH ^- -SiO + H1 0>K„- 6) SSľ.Iľ" snímek 11 Elektroosmotický tok £ S- í, = potenciál Helmholtzovy dvojvrstvy 7} = viskozita e = dielektrická konstanta fieo = elektroosmotická mobilita 4^?7 xEš snímek 12 Původ elektroosmotického toku ÍJTS» — M&Ä****«**2^ snímek 13 Elektroforéza ,JDělení nabitých částic na základě rozdílných elektroforetických mobiliť snímek 14 Elektroforéza • Volná • Zónová snímek 15 Volná elektroforéza -i f ■ C i A+B+C Ha>Hb>Hc snímek 16 snímek 17 Zónová elektroforéza + + !iA>^B>|ic Stabilizace Rotací Gradienty hustoty Porézními medii Kapilárou snímek 18 Požadavky na porézní media • Homogenita • Inertnost - nespecifické interakce - nulový EOF • Reprodukovatelna a snadná pnprava • Mechanická pevnost • transparentnost snímek 19 Upořádání Horizontální ta "Tvr snímek 20 Upořádání Vertikální "M snímek 21 Chromato grafický papír Složení - celulosa - Nehomogenní - Přítomnost ionogenních skupin - Spatně se chladí - pálí se Použití : téměř už se nepoužívá snímek 22 snímek 23 Agar a agarosa Složení - kopolymer galaktosy a anhydrogalaktosy - Přítomnost ionogenních skupin - silný EOF + Velké pory + Snadná příprava Použití : imunoelektroforetické metody elektroforéza NK Acetát celulosy Složení - acetát celulosy + Komerčně dostupný + Dobré mechanické vlastnosti Použití: imunoelektroforetické metody klinické aplikace snímek 24 Škrob Složení - hydrolyzovaný škrob + poprvé se uplatňuje efekt molekulového síta - Spatné mechanické vlastnosti - Komplikovaná a nereprodukovatelná příprava - Není transparetní Použití : izoenzymová analýza snímek 25 snímek 26 snímek 27 Sypané vrstvy Složení - Sephadex - zesíťovaný dextran + uplatňuje efekt molekulového síta Použití : preparativní Polyakrylamid Složení - kopolymer akrylamidu a N,N,- methyl enbis akrylamidu + plně splňuje požadavky - Monomery jsou neurotoxiny !!!!!! Použití : analýza bílkovin Polyakrylamid H2C=CH H2C= =CH —CH2 —CH—H2C- -CH— C=0 C=0 C=0 C=0 NH NH2 NH + CH2 ** CH2 NH NH2 NH C=0 C= C=0 H2C= =CH —CH2 —CH—H2C- -CH— snímek 28 snímek 29 Polyakrylamid - příprava Radikálová polymerace Katalyzátor - tetramethylethylendiamin TEMED Iniciátor - chemicky - (NH4)2S208 - fotochemicky - ribloflavin + UV Polyakrylamid - složení r = ^xioo°/ C = —— xl00% a+b a - akrylamid (g) b - methylenbisakrylamid (g) m- objem (ml) snímek 30 Fergussonova rovnice PAGE není pouze pasivním nosičem, ale podílí se na separaci efektem molekulového síta. log ß = log ß, + K,[T] |i - mobilita |i0- mobilita při limitním zředění Kj. - retardační koeficient snímek 31 Uplatnění Fergussonovy rovnice Mr, P'a* P'b MrB MrA ŕ MrB P'a= P'b P'a* pIB snímek 32 Provedení PAGE vertikální x horizontální deskové x trubičkové homogenní x gradientově kontinuální x diskontinuální snímek 33 snímek 34 snímek 35 snímek 36 Diskontinuální PAGE Orstein, Davis Koncentrační gel Izotachoforéza |čäy] b- | a- [ä] separační pufr Separační gel is g ycinpH 8 3 zónová elektroforéza TnsGlycinpH8.3 l^y^H SDS PAGE 1 g bílkoviny váže 1.4 g SDS => unifonnní náboj najednotku MW snímek 37 SDS PAGE ■1* - snímek 38 snímek 39 Stanovení Mr pom PAGE - standi od SDS trdy 123456789 10 ■M i snímek 40 Použití SDS PAGE Stanovení Mr Analýza komplexních směsí Sledování purifikace bílkovin Stanovení podjednotkového složení snímek 41 PAGE- sekvenace DNA P...... | ŕ g ť ř ■-=: - .. =-=" —--_ = '- - ■- ::ľ ~ - - _ _z :":- : % _- ŕ z ~- ^ snímek 42 Kapilární zónová elektroforéza CZE capillary Eledrophoref snímek 43 Módy CZE snímek 44 Kapilární zónová elektroforéza ve volné kapiláře www«»««*«*08*'00 3 E snímek 45 Výsledná mobilita částic při CZE . B. EOF t'n = MeOF + Hc _ ... U 4 EOF LI" Tim, snímek 46 Separace aniontů pomocí CZE snímek 47 Princip MEKC Micek Jí % S U* Q $" a - střed - rozpustná v obou b - silně hydrofilní - nerozpustná v micele c - silně hydrofóbní - nerozpustná ve vodné fázi snímek 48 Micelární elektrokinetická chromatografie snímek 49 Separace fenolů a alkoholů pomocí MEKC InAin í je3 p^. i ill iL 7.5 ,0 ,25 ,5 „5 20 22 5 25 25 5 J LhÄľíSin.lcoh„,,,.ppn,| š "«rÄtSSppm) 1 llils snímek 50 snímek 51 snímek 52 Instrumentace CZE snímek 53 snímek 54 Napájecí zdroj stabilizovaný ± 30 kV 300 uA konstantní napětí nebo proud obojí polarita ochrana obsluhy snímek 55 Kapilára křemenná - 25 -100 jim i.d - 350 jim o.d. délka až 100 cm délka polyimidové vnější pokrytí snímek 56 snímek 57 Dávkování - elektrokinetické snímek 58 Detekce spektrofotometrická II ř =pathlength • " • ® ™Aks • ^l • ® *®*® ®J!Lm L -J f| A snímek 59 Detekce fluorescenční e Q o o «P ? p ^ e Q o o ©-pi? © 'd t • ® • » *»*• ^ * • « • ® «r» • a ' snímek 60 Izoelektrická fokusace ,filektroforéza v gradientu pH, částice jsou separovaný podle svých pľ snímek 61 Tvorba gradientu Anoda (+) H30+ 6H20^02 + 4H30++ 4 e" Katoda (-) OH- 41^0^2^ + 40H" - 4 e" Ampholyty -CHi-N-CCHA-N-CH,- E_CHj (CH2)n R - CH2COOH -H NR3 snímek 62 Izoelektrická fokusace PH 4 <0 .0 / H ti ! H3Q» OH- I OH- snímek 63 Izoelektrická fokusace t. PH snímek 64 snímek 65 Izoelektrická fokusace analytická Provedení - v gelech - PAGE, agarosa Použití - sledování komplexních směsí - izoenzymové složení - stanovení pí - rozřezání a eluce - u,pH elektrody - pí standardy snímek 66 Izoelektrická fokusace analytická snímek 67 [zoelektrická fokusace analytická ) i S 1 S S A B snímek 68 Izoelektncká fokusace analytická - standardy snímek 69 Izoelektncká fokusace preparativní Provedení - v sypaných vrstvách - Sephadex - v gradientech hustoty - sacharóza - rotací - Rotofor (BioRad) Použití - izolace bílkovin snímek 70 Dvourozměrné metody • Metoda titračních křivek • Dvourozměrná elektroforéza snímek 71 10.0 pH 3Í Metoda titračních křivek PH .0 10.0 ^ Ife I.rozměr - IEF H.rozměr - elektroforéza bez vzorku se vzorkem snímek 72 Dvojrozměrná elektroforéza pí 3.0 i pH - r\ n * • t . - u, I.rozměr ffiF H.rozměr SDS-PAGE snímek 73 Dvoj rozměrná pí elektroforéza 21.6» - t 2 5 4 7 pattern of tlie 2-0 SOS-PAGE Standards separated on the Mmt-PROTEANII cull. F.sjri were s-pplieC !o a 3.5% Tube gel croBsSiketl wHfi piperazine diacrylamirie Btwui'via S .'.■) LV.Ľ.vn'í^.ňia-i.^ fi.v.c,':c!>•:■?.; ,'í p.ir: 3.':í. í o.ii-ri E/7). JYie Kjfač geJ Lťas rar nfj a (5% oöntJTLMüs slab qfí .-fĽss.'i'^íil ■v.r'i s1; ,-.-iŕf silver snímek 74 snímek 75 Izotachoforéza „ Vzorek je umístěn mezi dva elektrolyty : vedoucí L (leading) s nejvyšší mobilitou a - uzavírající T (terminating) s nejmenší mobilitou" snímek 76 Izotachoforéza »o t! T 1 A+B | L - 1 B A+B A L + - 1 B AB A L 1 + - 1 ■ B A ■ 1 + snímek 77 snímek 78 Izotachoforéza V-L > V-A > V-B > V-T v E snímek 79 Kohlrauschova regulační funkce ,. ft ĺíi + ĺír LI Zi d = Cl ■------------------------------ [k [k + [Ir 2, snímek 80 Analytická ITP Napájení | Detekce - o n t Dávkování ^ snímek 81 Analytická ITP instrumentace Napájení - stejnosměrné 30 kV 0,2 - 0,5mA Kapilára 0,1 - 2 mm Dávkování - dávkovací ventil Detekce - universální - konduktometncka - potenciálně gradientova - selektivní - UV-VIS snímek 82 Analytická ITP Metoda spojování kapilár Předseparační kapilára - 2 nun üh Analytická kapilára -0.1 mm snímek 83 Izotachoforetický záznam kvantita snímek 84 Izotachoforetický záznam kvalita B T _Ll__j snímek 85 Preparativní ITP V gelech - Sephadex m w snímek 86 Preparativní ITP Kontinuální plošná HH1 T I A+BI L snímek 87 Detekce po elektroforéze a izoelektrické fokusaci přímo v gelu detekce