Srážecí metody

                                              Srážení

*      Nezaměňovat s denaturací -- bílkoviny zůstávají v nativním stavu



[*      ] První metody používané pro separaci bílkovin -- EtOH, (NH[4])[2]SO[4

]

*      Filtrace nahrazena centrifugací



                                       Rozpustnost bílkoviny

*      Vlastnostmi bílkoviny -- distribuce hydrofobních a hydrofilních skupin na povrchu bílkoviny

                                       Rozpustnost bílkoviny

*      Vlastnostmi roztoku -- pH, iontová síla, org. rozpouštědla, org. polymery,  teplota



                                     Izoelektrická precipitace

                                     Srážení neutrálními solemi

                                             Vsolování

                                             Vysolování

                                         Praktické aspekty

*      Hofmeistrova řada

    Anionty

    SCN^-, J^-, ClO[4]^-, NO[3]^-, Br^-, Cl^-, Ac^-, SO[4]^2-, PO[4]^3-

    Kationty

    Na^+, K^+, NH[4]^+

                                           (NH[4])[2]SO[4

]*      Rozpustnost se málo mění s teplotou

*      Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm^3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin
(hustota 1,29 g/cm^3)

*      Levný

*      Stabilizuje bílkoviny

*      Relativně čistý

                                       Srážení - dvojstupňově

                                          Přidané množství

*      Tabulky



*      Vzorce

                                             Provedení

                            Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou

*      Rozpouštědla ruší solvatační obal bílkoviny

                                         Výběr rozpouštědla

*      Kompletně mísitelné s vodou



*      Nereaguje s bílkovinou



*      Musí mít dobrý precipitační efekt



                               EtOH, aceton, MetOH, propanol, dioxan

                            Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou

*      COHN -- separace plazmatických bílkovin EtOH

*      Nutno provádět při T < 0 ^oC, při větší teplotě dochází k denaturaci

*      Dvojstupňově

*      Přídavky z tabulky nebo podle vzorce



                                        Srážení org.polymery

                                  Princip identický s rozpouštědly



*      DEAE dextran

*      PEG

*      Polyakrylová kyselina

*      Rivanol

*      Kaprylová kyselina





                                   Srážení selektivní denaturací

*      Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina musí zůstat z 85 - 90 % v
nativním stavu.



*      Denaturační vlivy -- T, pH, org. rozpouštědla



*      Bílkovina musí nejen denaturovat i precipitovat



                                         Tepelná denaturace

                                         Tepelná denaturace

*      Doba inkubace je důležitá pouze pro reprodukovatelnost -- denaturační křivka se tím posouvá po
teplotní ose, má význam pro vyhřívání větších objemů



*      Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových
bílkovin





*      pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno



*      Při vyšší teplotě běží více proteolýza



                                           pH denaturace

*      Provádět za definované teploty



*      Změny pH dělat co nejrychleji



*      Pro změny pokud možno nepoužívat silné kyseliny a zásady





pH 5        HAc              pH 8        Tris

pH 4        k.mléčná        pH 9        DEA

pH 2        H[3]PO[4], H[2]SO[4]      pH 11      NaOH



*      Extrémy pH -- bílkovina silně ionizovaná a zůstává v rozpuštěném stavu (r) nutná zpětná úprava
pH

                                    Denaturace org.rozpouštědly

*      Pří srážení organickými rozpouštědly --

   T < 0 ^oC

*      Pří denaturaci organickými rozpouštědly --

   T =  20 -- 30 ^oC

*      Alkoholy s delšími alifatickými řetězci mají větší denaturační vliv

*      T a pH musí být přesně definovány

                                        EtOH, MetOH, aceton