snímek 1
snímek 2
snímek 3
Srážecí metody
Srážení
Nezaměňovat s denaturací - bílkoviny zůstávají v nativním stavu
První metody používané pro separaci bílkovin - EtOH, (NH4)2S04
Filtrace nahrazena centrifugací
Rozpustnost bílkoviny
Vlastnostmi bílkoviny - distribuce hydrofobních a hydrofilních skupin na povrchu bílkoviny
snímek 4
Rozpustnost bílkoviny
Vlastnostmi roztoku - pH, iontová síla, org rozpouštědla, org. polymery, teplota
snímek 5
Izoelektrická precipitace		
|	•-•   /	
	pH	
snímek 6
Srážení neutrálními solemi
vysolování
snímek 7
Vsolování	
BM^^\	
í    m	i2o
H-A	J
n-A- +   y	H20
H^^^^To	
snímek 8
snímek 9
	Praktické	aspekty	
• Hofmeistrova řada			
Aniontv			
			
SCN", J-	C104-, N03-	Br, Cľ, Ac-	so42-,
po43-			
Kationtv	----------		
Na+, K+,	NH4+		
snímek 10
(NH4)2S04
Rozpustnost se málo mění s teplotou
Saturovaný roztok 4 M - hustota l,235g/cm3
umožňuje centrifugaci agregovaných
bílkovin (hustota 1,29 g/cm3)
Levný
Stabilizuje bílkoviny
Relativně čistý
snímek 11
Srážení - dvojstupňové		
60 -40 -20 -	~^\	
	\	
		— Bílkovina — Aktivita   |
	\	
		
		
snímek 12
Přidané množství
Tabulky
Vzorce
gll =
533-(S2-S,) 100-0.3-S,
snímek 13
Chlazení Míchání 10-30' Centri ŕugace
Provedení
_
pevný (NH4)2S04
nebo
saturovaný roztok
(NH4)2S04
- úprava pH NH4OH
snímek 14
Srážení org. rozpouštědly mísitelnými s vodou
Rozpouštědla ruší solvatační obal bílkoviny
snímek 15
Výběr rozpouštědla
Kompletně mísitelné s vodou Nereaguje s bílkovinou Musí mít dobrý precipitační efekt EtOH, aceton, MetOH, propanol, dioxan
snímek 16
Srážení org. rozpouštědly mísitelnými s vodou
COHN - separace plazmatických bílkovin
EtOH
Nutno provádět při T < 0 °C, při větší
teplotě dochází k denaturaci
Dvojstupňové
Přídavky z tabulky nebo podle vzorce
snímek 17
Srážení org	polymery
Princip identický	s rozpouštědly
• DEAE dextran	
• PEG	
• Polyakrylová kyselina	
• Rivanol	
• Kaprylová kyselina	
snímek 18
Srážení selektivní denaturaci
Pň této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu.
Denaturační vlivy - T, pH, org. rozpouštědla
Bílkovina musí nejen denaturovat i precipitovat
snímek 19
Tepelná denaturace		
90 70 60 #    50 40 30 20 10	—       \         ~^x	
		
	\	
		
		
	\	
		
		
		
		
	\	
		
	teplota	
snímek 20
Tepelná denaturace
Doba inkubace je důležitá pouze pro reprodukovatelnost - denaturační křivka se tím posouvá po teplotní ose, má význam pro vyhřívání větších objemů
Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin
snímek 21
pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno
Při vyšší teplotě běží více proteolýza
snímek 22
pH denaturace
Provádět za definované teploty
Změny pH dělat co nejrychleji
Pro změny pokud možno nepoužívat silné kyseliny a zásady
snímek 23
pH 5          HAc                   pH 8	Tris
pH 4          k.mléčná            pH 9	DEA
pH2          H3P04, H2S04   pHll	NaOH
• Extrémy pH - bílkovina silně ionizovaná a	
zůstává v rozpuštěném stavu —>	nutná
zpětná úprava pH	
snímek 24
Denaturace org.rozpouštědly
•   Pří srážení organickými rozpouštědly -T<0°C
•   Pří denaturaci organickými rozpouštědly -T = 20 - 30 °C
•   Alkoholy s delšími alifatickými řetězci mají větší denaturační vliv
•   T a pH musí být přesně definovány
EtOH, MetOH, aceton