Fine Glass ^ Thread yy^ Drop of fir Electrolyte Solution Micropipette y 1 /im Cathode Ray Oscilloscope (CRO) Micropipette Tip Electrometer (Input from Electrode) (I Ground Electrode Squid Axon Fig. 4.4 The micropipette is used for electrical recording (extracellular, intracellular, patch), electrical stimulation (current or voltage clamp), or delivery of substances (microionophoresis or pressure ejection). Preparation of an intracellular recording micropipette is shown on the left. The diagram on the right shows the arrangement for recording from a squid axon and observing potentials on a cathode ray oscilloscope (CRO). ATP ADP^P 4imV RT [ion]o E. =------In--------- ion zF [ion] i [ion]o E. = 61mV log--------- ion ö [ion]i Nernstova r. l55imV Intracelulami L , . í Extracelulami ,™ r^r pMem bran a ,™^^r prostor prostor RT PK[K+]o + PNa[Na+]o + PCl[Cl"]i Er = __ in--------------------------------- F PK[K+]i + PNa[Na+]i + PCl[Cľ]o Goldmanova r. Obr. 2.9. Rozdílné membránové podmínky pro IMa+ a K+. IMa/K pumpa stale udržuje na membráne gradient IMa + i K+. Zatímco K+ vsak muže membránou volné procházet, pro Na+ jetémér nepro* pustna. IMa+je čerpáno Hdo strmého kopce" - proti velké elektrochemické síle. lont vo Na" K CI Iný C^' fixní an ionty Koncentrace Intracelulami' 12 mmol/l 155 mmol/l 4 mmol/l 10 mnrol/l 155 mrrel/l Extracclulární 145 mmol/l 4 mmol/l 123 mmol/l 1.5 nrnrol G rad ient Rovnovážný I ntra^Extra pot c nd ál 1:12 39:1 1:31 1:15.000 ^Ü7 mV ■98 mV -90 mV +129 mV 7äf>. 2.2. Tabulka rozložení iontových koncentrací n& bunečné membráne kosterníhosvalu savce. AKČNÍ NAPĚTÍ ion mS f— 1 1-30 -20 -10 ■-0 pod- rt»d- prahový podnět čas (ms) _ .. . Voltage Feedback g^^ Amplifier Voltage Amplifier Record Membrane Potential Record Membrane ( / Current Hodkgkin & Huxley napěťový zámek, 1963 ® ČAS [ms] 10 15 20 -10 ® K* proud 160 mV •60 mV 5 10 ČAS [mi] Obr. 14.16 Membránové proudy na myelinisovaných axonech po experimentálně provedené skokové změně membránového napětí. Membránové napětí bylo v čase t=0 skokem změněno z -95 mV na hodnoty udané u jednotlivých křivek. Křivky vyjadřují naměřené proudy iontu, nahoře natria, dole kalia. Svislá osa - intensita proudu, vodorovná osa - čas. Při skoku na -60 mV je skok jeStě podprahový a nevyvolává žádný proud. A: Na proud; mezi +30 a +60 mV mění Na proud polaritu z negativního (směrem do buňky, pod vodorovnou přímkou) na positivní (ven z buňky, nad přímkou, pro daný preparát letí totiž hodnota rovnovážného napětí pro Na+ pod +60 mV) a s přibývající depolarisací teče stále kratčeji. B: K* proud; tento proud stoupá po depolarisací (do positivních hodnot, tj. ven z buňky) mnohem pomaleji než proud Na+ a drží se na stejné výšce během celé depolarisace. (Z DUDELA 1990b) Ugandy a) Přenášená molekula T Elektrochemický gradient Vř Přenášená molekula + 1- + »mfífk Mem brána Dep ol a r izo v a n á v klidu membrána Š) T Elektrochemicky gradient * STAVY KANÁLU ZAVŘENÝ j ! aktivovatelnýJ depolarisac« repolarisacc f OTEVŘENÝ i AKTIVOVANÝ J- ... - , ■ '.■.«■•>'-.^-.'-''-.lj':,Wia ., ;-y - ■„.■■■';-. '-ŕ-'"'. " '--^".'^Ir'* i. ,f .... ZAVRENY ..*H fí| INAKTIVOVANÝp Örw. 2. ?. Vrátkované kanály. Pohyblivá uzavírací doména reaguj o otevřením kanálu na různé podněty; a} chemicky vrátkované na vazbu ligandu na receptorové misto, b} elektricky vrátkované na změnu membránového napětí, c} mechanicky vrátkované na tah za připojený cytoskeletální filament. Extracellular Side Cytoplasmic Side COOH Fig. 5.3 Presumed tertiary structure of the Na+ channel protein based on hydropathicity plots of the primary amino acid sequence. A. The channel protein consists of four repeating subunits, each containing six presumed transmembrane segments. Segment 4 contains an excess of positively charged residues and is assumed to be the voltage sensor. A long loop between segments 5 and 6 is believed to dip into the membrane and form the face of the pore. A cytoplasmic loop contains the inactivation gate. B. View looking down on the membrane to see the arrangement of the four subunits around the central pore. The Ca2+ channel protein is similar in its construction. (Modified from Catterall, 1988, and Stevens, 1991, in Kandel et al., 1991) Whole-cell reCord í n Neher & Sackman Terčíkový zámek, 1991 — Patch Clamp Inside-out recording Strong -pulse or Cytoplasm is continuous with pipt?»e_intĽrior f Expose to air czJOtj Cytoplasmic domain accessible Outside-out recording Retract j pipette | End-s of membrane anneal 32=i j Extracellular domain accessible 14.12 MEMBRÁNOVÉ PROCESY V JEDNOTLIVÝCH TKÁNÍCH 66 O frei Siflourr A- _r »tW/Mr**» J n, -40 mV -80 mV__i součot proudů přes kanály *» —LT _IHl (tí I j TJ JUH. U 5pA 10 mi Obr. 14.18 Proudy tekoucí Na+-kanály (vlevo) a K+-kanály (vpravo). Membránové napětí bylo po dobu 14 ms experimentálně skokem přestaveno z -80 mV na -40 mV (horní křivka), a to bylo desetkrát opakováno. Přitom byly měřeny membránové proudy (10 křivek v dolejší části obr.). Proudy proteklé jednotlivými kanály se objevují porůznu během depolarisace a trvají různě dlouho. Sumací takovýchto záznamů vzniká záznam sumačního proudu, 7nq popř. Jk (zubatá křivka). Je vidět, že u Na -kanálů je otevření nejpravděpodobnější krátce po změně napětí na membráně a že pak dochází k pozvolné inak-tivaci. fr-kanály se naproti tomu otevírají v průměru s jistým zpožděním, pak se však ustavuje určitá střední častost otevření, která zůstává konstantní po celou dobu depolarisace. (Z DUDELA 1990b)