Modifikace PCR používané při analýze genomu i Amplifikace sekvencí klonovaných ve vektorech Primer [w Transformované bakterie s rekombinantním vektorem Izolace DNA z jednotlivých kolonií n—i i—i i—i PCR je použitá pro amplifikaci klonované DNA s využitím primerů pro vektorové sekvence Analýza PCR produktů na gelu Metoda je vhodná pro skríning knihoven Modifikace konců DNA, expression cassete PCR (EC-PCR) Připojení sekvencí prostřednictvím 5'-konců primem Cílová sekvence J ^ c u I Denaturace j a připojení I ° příměrů 1 a 2 I T /^ I 3 0rTAAGCCGG 51 Primer 2 .sticky foot" Primer 1 5- GCGCMGc^ m EcoR\ G^ATTCGGCC CTTA/j|gCCGG H/ndlll j PCR Target region Přidávané sekvence ♦ RE místa ♦ Promotory 5" gcgcaWgctt ♦ Terminátory 3" cgcgttcg|aa ♦ Translační signály Asymetrická PCR Podobně jako jiné DNA, lze produkty PCR sekvencovat. Templátem pro Sangerovu metodu jsou ssDNA. Pro jejich přípravu se používá se technika označovaná jako asymetrická PCR, při níž jsou tvořeny preferenčně ssDNA. Standardní PCR se založí s tím rozdílem, že výchozí koncentrace primem se liší faktorem 100 (tj. jeden z primem je ve 100 x vyšší konectraci než druhý). Dvouřetězcové DNA fragemnty se tvoří až do doby, než se jeden z primem nevyčerpá. Druhý primer pak dále syntetizuje pouze jeden z řetězců - i když se tento tvoří spíše lineární než exponenciální rychlostí, je jeho množství postačující pro sekvencování. Primer není k dispozici / Cycseqpc.exe PCR fragment dvouřetězcové DNA Denaturace a připojení primerů ^ Dostupný primer Syntéza nového řetězce Denaturace a připojení primerů Syntéza nového řetězce Denaturace a připojení primerů Syntéza nového řetězce Denaturace a připojení primerů atd. Obracena PCR (l-PCR) PCR umožňující amplifikovat úseky DNA o neznámé sekvenci ohraničené na obou stranách DNA se známou sekvencí. oblasti s neznámou sekvencí známa sekvence štěpení restriktázou ve specifických místech * l cirkularizace a ligace mnoho kružnicových molekul Primer 1 o _o pnmery se připojuji ke známé sekvenci a směřují směrem ven * AAA/i|A/\^J^ analýza sekvence příprava sond pro mapování chromozomu nebo primem pro PCR Využití adaptorů pro PCR amplifikaci neznámé sekvence známá sekvence GATC reštrikční štěpení i Y uCTAG GATC "—"■•"«■■»'■■»-" -»• =Cv. /y.rfn-iT-ľffi C TAG a Tra^rr.n^;^ CTAG GATC '--'-'■-?"*-•-■■*■■>■'■'■-"■•'*'-■'......'■ ■ i 'tiraiHTjwrpíw-.-* i------ 1................1 1 Q ligace GATC GATC 3 CTAG t: t amplifikovaný úsek neznámé sekvence ^ 3 "Bubble linker" r GA1 C i-.. —__ - - fO^ . ^^ -• M-Y »■» i ctagí-----------=ľ=:c^r ^y- ■ =a ^°^V, iw,-..«if.r»r.ii 2' G Al O r/vr.: ■•-,__^ii^ ^raí^w -'"» •* —»*-— Zpětná (reverzní) PCR (RT-PCR) detekce sekvencí na RNA ■ RNA nemůže sloužit jako templát pro PCR. ■ Produkty RT-PCR se tvoří, jestliže je izolovaná RNA nejdříve převedena na cDNA pomocí retrovirové zpětné transkriptázy ♦ M-MuLV = Moloney murine leukemia virus ♦ AMV = avian myeloblastosis virus a poté amplifikována pomocí PCR se dvěma specifickými primery. ■ Nevýhody: Zpětná transkriptáza je termolabilní a obvykle nefunkční nad 42°C. Navíc v některých případech znemožňuje převod RNA na cDNA, zejména při složité sekundární struktuře RNA. ■ Současná technika: ♦ Termostabilní Tth DNA polymeráza z Thermus thermophilus\e schopná převést RNA na DNA (RNA dependentní DNA polymerázová aktivita) za přítomnosti Mn2+ iontů při 72°C. ♦ Pomocí stejného enzymu je poté prováděna PCR reakce. ■ Použití: ♦ mRNA ♦ virové genomy (např. hepatitis C virus, virus chřipky, pikornaviry) 7 Princip RT-PCR i---------í 3 AAA Reverse transcription: M~MuLV or AMV Reverse Tran-scriptase orTth DNA Polymerase. I---------1 PCR I 1 I I : AAA Z3 RNA Primer: Oligo CdT)12_20 or hexamers or site specific primer cDNA Primer: site specific primers Amplified DNA 1 1 1 1 1 ' - '■ ■■■ -■ j i 1 [ ! I - 1 1 1 1 1 I 1 1 ' " ' II 1 1 1 8 Návrh primem pro RT-PCR RT-PCR amplifikace mRNA vyžaduje dvojici specifických primem. Primery můžeme navrhnout tak, abychom odlišili produkty vznikací při RT-PCR a při standardní PCR s genomovou DNA. Dva přístupy pro návrh primem: PCR product Intron 1 Primery, které se připojují k sekvenci 2 exonů na obou stranách určitého intronu. Amplifikační produkt z genomové DNA je větší než produkt RT-PCR. Primery komplementární k sekvenci na spojení exon/exon. Takové primery neamplifikují genomovou DNA. 1 __^ ^ Genomic DNA Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 1 mRNA Exon 1 Exon 2 " ~*" "^~ RT-PCR product PCR product upstream pnmer no PCR product downstream primer Genomic DNA 1 Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3 mRNA I Exon 1 Exon 2 - —...... Exon 3 RT-PCR product Uspořádaní R ■ Jednokrokova RT-PCR ♦ Tth DNA polymeráza ♦ dvojice primerů ♦ syntéza cDNA za přítomnosti Mn2+ ■ Výhody: ♦ rychlost ♦ není riziko kontaminace ♦ vyšší citlivost (probíhá při vyšší teplotě) r-PCR reakce ■ Dvoukrokova RT-PCR ♦ První krok: zpětná transkriptáza + oligo(dT) ♦ Druhý krok: Taq DNA polymeráza + dvojice primerů ■ Výhody: ♦ umožňuje optimalizovat zvlášť zpětnou transkripci a zvlášť PCR ♦ umožňuje syntézu dlouhých produktů (až 14 kb) 10 DD-PCR, Differential Display-PCR V genomech obratlovců existuje cca 100 000 strukturních genů V jednotlivých tkáních je exprimováno pouze malé procento z nich DD-PCR slouží pro studium úrovně exprese genů ♦ v různých tkáních ♦ při patologických procesech Princip: ♦ Vzorek RNA je převeden na cDNA pomocí RT-PCR ♦ s oligo-dT primerem, který má na 3'-konci dvě degenerované báze: 5' TTTTTTTTTTTTMN 3' , kde M = A, G nebo C; N = jakýkoli dNTP) ♦ druhý primer je směsný náhodný 8-10mer tvořený náhodnými sekvencemi ♦ Pro odhalení co největšího počtu mRNA mohou být využity různé sady druhého náhodného primem ♦ RT-PCR se provádí s radioaktivně značenými oligonukleotidy ♦ Rozdílně exprimované mRNAjsou detekovány na autoradiogramu Nur77 «... 7B7.C 1*1.7 «.7 13 1 fl.t SSS^rt 1ÄS.4 H-B 4.B 1 rt.R 1 1* 1:M 1:12» n.n n-.itdh RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) ■ Rychlá amplifikace konců cDNA (RACE) je technika založená na PCR vyvinutá k usnadnění klonování cDNA o úplné délce s 5'a 3'konci poté, co byla stanovena část sekvence cDNA jinými metodami. ■ Syntéza cDNA z mRNA o úplné délce není pomocí reverzní transkripce snadná. ■ Pomocí RACE se amplifikuje kratší úsek od jednoho konce (3' nebo 5') a ze střední části o známé sekvenci. ♦ 3'RACE ♦ 5'RACE 12 3 RA( Využívá výhody přirozeného poly(A) konce na mRNAjako místa pro zahájení PCR amplifikace. Při reverzní transkripci od 3'konce je první řetězec cDNA je inciován u poly(A) pomocí oligo-dT hybridního kotvícího primem. ♦ 17 oligo-dT zbytků navázaných na 17-mer adaptor ♦ má Trn vyšší než samotný oligo(dT17) ♦ je vhodné, když nese reštrikční místa pro následné klonování Amplifikace je docílena bez další purifikace, za využití PCR kotvícího primem a uživatelem navrženého specifického primem ve vnitřní části mRNA, která je cílem další analýzy. mRNA WWWWVWWWWVWWWWWAAAAAAAAAA cDNA* A**- (-) strand I I I ) : PCR Denature Anneal primer |3" amp Extend > f |3' amp (+) strand (-) strand mr— Denature Anneal primer Extend 3' amp| (+) strand TR (-) strand |-»"] Denature Anneal primers: 3'amp|and r"H Extend Up to -106 I3'amp| copies of cDNA (+) strand TR (-) strand E 13 5RA( ■ První řetězec cDNA je nasyntetiozován z celkové poly(A) RNA za použití prvního genově-specifického primem (SPI)pomocíAMVRTa deoxynukleotidového mixu. ♦ První řetězec cDNA je purifikován od neinkorporovaných nukleotidů a primem SP1 ■ Reakční produkt první reakce (cDNA) je pak prodloužen pomocí terminálni transferázy, která přidá homopolymerní konec dA na 3'konec cDNA ■ cDNA s napojeným koncem je pak amplifikována PCR s použitím druhého genově-specifického primem SP2, oligo dT-kotvícího primem a Taq polymerázy - stejným systémem jako u 3' RACE. ■ Pokud je to třeba, získaná cDNA může být dále amplifikována s použitím druhé PCR s využitím nested (sousedního) primem SP3 a PCR kotvícího primem. mRNA WWWWWWWWWWWWWVWAAAAAAAAAA ~(-) strand |5ŘŤ] cDNA" Remove excess 5RT primer Tail cDNAs with dATP V AAAAAAAAAA PCR ^ {-) strand Í5ŘŤI Denature Anneal primer >•■•■ mm Extend (+) strand >n AAAAAAAAAA (-) strand 5RT Denature ______ Anneal primerfšjjämg] Extend l — llll TR(+) strand -. ■<- TR(-) strand |5' amp| Denature Anneal primer [•"•] Extend If TR(t-) strand —>■ TR(-) strand |5' amp Denature Anneal primers: h"-|and[5' amp Extend TR(+) strand Upto-106 TR(-) strand Is7^^ copies ofcDNA 14 Degenerovaná PCR Využívá pro amplifikaci směsi degenerovaných primem Používá se, jestliže nevíme, která z variant sekvence se může v g enom u vyskytovat ♦ Kolísavé sekvence ♦ Sekvence předpokládané _ ^^^_ na Základě zpětné Trp Asp Thr Ala Gly Gin Glu translace z proteinového 5f tgg gay acn gcn ggn car ga 3f motivu t g G G G ♦ Degenerace je zajištěna c a a a a při syntéze primem. Není t t t nutné objednávat zvlášť c c c Všechny varianty Výsledkem je 256 variant primeru Příklady využití: ♦ Vyhledání sekvence DNA na základě sekvence aa stanovené u proteinu ♦ Vyhledání a klonování homologických genů např. člověka a myši ♦ Hledání a studium genových rodin s určitou strukturní podobností ♦ Fylogenetické a evoluční studie: hledání a srovnávání ortologních genů 15 Overlap extension PCR má využití v mutagenezi 3'<- 4 5'- Primer B 4 V<- 3'-f.- 5'- PrimerA Primer A' 5" 5' >3' i *>3' 3'-* ■5' 4 Primer C ■5' ->3' 4 4 smíchání a denaturace 4_ _ 5' ■5' ■3' 3' 3' přesah DNA polymeráza dosyntetizuje 5' chybějící řetězce •3' 4 PCR s primery B a C 16 Modifikace PCR používané v diagnostice ■ PCR metody nabízejí následující výhody: ♦ rychlost ♦ je potřeba malé množství buněk 17 PCR-RFLP ■ Amplifikace známé sekvence se dvěma specifickými primery ♦ Cílová sekvence (obvykle určitého genu) o délce 1 až 2 kb je amplifokována při vysoce stringentních podmínkách. ♦ Výsledkem amplifikace jsou amiikony (PCR produkty o stejné délce) detekované elektroforeticky ■ Amplikony jsou štěpeny reštrikční endonukleázou se 4 bp rozpoznávacím místem a poté opět analyzovány pomocí elektroforézy ■ Separace fragmentů DNA v agarózovém nebo polyakralamidovém gelu. ■ Srovnání restrikcních fragmentů amplifikované DNA u různých vzorků. PCR-RFLP fingerprinting ilustrovaný na příkladu genu pro 16S rRNA (rDNA-RFLP) Chromozóm A Chromozóm B 1500 bp 0 .50 200, , 900 .350 0 Amplifikace Restrikce Elektroforéza A B ± 1500 bp {S7 200, 1250 1250 900 350 200 50 <: ^ : Univerzální primery komplementární k vysoce konzervativním oblastem na koncích genu pro 16S rRNA Pozn.: V závislosti na volbě primem může být provedena PCR-RFLP analýza jakéhokoli genu 19 Prenatální diagnóza hemofílie pomocí PCR-RFLP V analyzované oblasti DNA mohou být až tři místa fíc/l, přičemž jedno z těchto míst v intronu 18 je polymorfní. Fragment DNA o délce 142 bp obklopující polymorfní místo fíc/l je nasyntetizován s pomocí oligonukleotidových primem. Normální alela má fíc/l místo a proto je fragment štěpen na 99 + 43 bp fragmenty Polymorfní místo může ♦ chybět na obou chromozomech (5), ♦ přítomné na jednom a chybět u druhého (2,4,7) ♦ nebo být přítomné na obou (1,3,6). ' »im m * ttáŕ/ha. s Áesttefi'/ú iD <•* IčoMťô/y (TÍ D O 1 f tf-ec tmákA 1 I Bui-*»*** f BŕftctnrtO 1——■ heíerczxjqc r J -----honíc vyčte t x/r syn *f" Mnohonásobná PCR (multiplex PCR) ■ Při multiplex PCR je použito více párů specifických primem. ■ Dochází k amplifikaci více cílových sekvencí při jedné reakci. ■ Použití a výhody: ♦ Vyhledávání změn na dlouhých úsecích DNA ♦ Testování vzájemně nesouvisejících oblastí na DNA ♦ Amplifikace vnitřních kontrol současně se vzorky ♦ Nižší cenové náklady než při samostatných amplifikacích ■ Používané aplikace: ♦ Detekce specifických toxinů produkovaných některými organizmy (Clostridium difficile, Staphylococcus aureus) - může být detekováno až 7 různých genů kódujících toxiny. ♦ Detekce více genů kódujících rezistenci k různým antibiotikům. ♦ Detekce více druhově specifických genů - identifikace organizmů ♦ Ko-amplifikace vnitřních kontrol Příklad detekce lyzogenie v genomu bakterie pro!ág serol- síupiny * -► _~ profag serol. skupiny F -> Staphylococcus aureus pr0fág serol. skupiny B -> pomocí multiplex PCR vnitřní kontrola -> Príklad použiti multi mutací v je Diagnóza Duchennovy muskulární dystrofie za použití mnohonásobné PCR k detekci deletovaných exonů ■ V genu pro dystrofin o délce 2000 kbp je navrženo celkem 9 úseků určených k amplifikaci. ■ Tyto úseky představují části genu, které bývají nejčastěji postiženy delecí. ■ Vzorky DNA z pacienta jsou amplifikovány za současného použití sady devíti primem v jedné reakci a produkty jsou separovány na elektroforéze a barveny EB. ♦ Pacient 1 má 1 deleci, pacient 2 má velkou deleci asi 1000 kbp. Ostatní mají více různých delecí. Dlex PCR pro analýzu dnom genu n «tc t e hři (bei. dt\ecť\ Odstupňovaná PCR Open transfer of 1st product to new tube -------------------------------------------------------------►- Aerosol contamination 1st amp! if i cation 15-30 cycles 1st round product [ Při PCR pomocí vnějších a vnitřních primem („nested" PCR) se amplifikace provádí ve dvou krocích. Metoda má oproti standardní PCR velmi vysokou citlivost. Používají se 2 modifikace: ♦ Dvoukroková ♦ První kolo zahrnuje 15-30 cyklů amplifikace s jedním párem vnějších primem. ♦ Potom je reakce převedena do druhé zkumavky a prováděna amplifikace zahrnující opět 15-30 cyklů s párem vnitřních primem. ♦ Jednokroková ♦ První kolo amplifikace s jedním párem primem se provádí při nestringentních podmínkách (nižší teplota pro připojení primem) s 10-15 cykly. ♦ Následuje reamplifikace zahrnující 15-30 cyklů při stringentních podmínkách s vnitřními primery, při které se ověří specifita amplifikace z prvního kola. i 2nd amplification 15-30 cycles t 2nd round product No product transfer ----X---- 1st amplification Low annealing temp cGCGCfi wy/////////////A GCGCGC CGCGCG 2nd amplification High annealing temp GCGCGC\ Predominant 2nd round product wßmv////////Mm& 1st round products 23 Alelově specifická PCR (AS-PCR) Využití ♦ Pro detekci bodových mutací v genomech ♦ detekce homozygotního a heterozygotního stavu v klinických disciplínách Je prováděna ve dvou nebo více paralelních reakcích ♦ V první reakci je horní primer komplementární ke standardní sekvenci ♦ V další reakci k mutantní nebo polymorfní sekvenci ♦ Spodní primer je v obou reakcích stejný Předpokládá se, že k elongaci dojde pouze tehdy, pokud jsou primer a cílová sekvence plně komplementární. Uvažujeme-li homozygotní stav, k amplifikaci bude docházet pouze v jedné reakci. Metoda byla popsána nezávisle pod různými označeními a využívá dva odlišné přístupy. ♦ První přístup je založen na chybějící elongaci v důsledku chybného párování bází na 3'-konci primem. ♦ amplifikaci nedostupný mutační systém (ARMS), ♦ PCR-amplifikace specifických alel (PASA) ♦ alelově specifická amplifikace (ASA). ♦ Ve druhém přístupu se chybné párování nachází ve střední části sekvence primem a brání tak hybridizaci primem k cílovému místu v případě, že se v templátové DNA vyskytuje. ♦ kompetitivní připojení oligonukleotidu (COP). Pro snazší odlišení heterozygotního stavu v jediné reakci je používána varianta označená jako PCR-amplifikace více specifických alel (PAMSA) nebo dvojitý ARMS. ♦ Jeden z alelově-specifických primem obsahuje na 5'-konci přídatný úsek několika nekomplementárních nukleotidů, a tak mohou být amplifikační produkty obou alel rozlišeny na základě své délky. Metoda je obecně velmi citlivá na optimalizaci experimentálních podmínek reakce, zejména 24 koncentrace jednotlivých reagentů a templátové DNA._________________________________ PCR s degeneroval oligonukleotidovými primer ■ DOP (degenerate oligonucleotide primer) PCR slouží pro uniformní náhodnou amplifikaci DNA pokud je k dispozici pouze malé množství vzorku. ■ Další postupy (klonování, značení, hybridizace, následná PCR) mohou být potom provedeny účinněji. ■ DOP-PCR se používá jako první krok při: ♦ hybridizaci in situ ♦ srovnávací genomové hybridizaci (CGH) ♦ přípravě DNA fragmentů frakcionovaných podle velikosti pro další hybridizace ♦ analýzu DNA ze špatně kultivovatelných organizmů ♦ analýzu nebo klonování stopových množství DNA lými y (DOP-PCR) Amplifikace DOP-PCR vede ke vzniku různě dlouhých DNA fragmentů, které jsou viditelné na agarózovém gelu obarveném etidiumbromidem ve formě šmouhy. ■ DOP-PCR primery mají definované sekvence na 5'- a 3'-koncích a náhodnou hexamerovou sekvenci mezi těmito definovanými konci. ■ Prvních 5 cyklů DOP-PCR probíhá při velmi nízké stringenci. ■ Dalších 35 cyklů probíhá při vyšší teplotě pro připojení primem. ■ Za stringentnějších podmínek je materiál vytvořený při prvních cyklech amplifikován preferenčně, protože obsahuje kompletní primerovou sekvenci na obou koncích. Na jiných místech se DOP-primer při stringentních podmínkách neváže. DP-PCR DOP-PCR primer Template DNA DOP-PCR products Náhodně amplifikovaná DNA ■ Náhodná amplifikace využívající jeden nebo více primem s neznámou homologií k cílové sekvenci DNA ■ Vzniká více amplikonů s různou velikostí a rozdílným molárním množstvím, nevyžaduje se proto štěpení restrikčními endonukleázami ■ Úspěšná, rychlá a jednoduchá technika pro DNA fingerprinting popsaná nezávisle pod různými označeními: ♦ AP-PCR (arbitrarily primed PCR fingerprinting) ♦ RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) ♦ DAF (DNA-amplified fingerprinting) ♦ MAAP (multiple arbitrary amplicon profiling) ♦ PCR-mediated genotyping ■ Princip metody: ♦ Metoda používá obvykle jeden krátký primer (8 - 10 bp nebo M13). ♦ Teplota pro připojení primeru je mnohem nižší než teoretická hodnota Ta. ♦ Za těchto podmínek dochází k nasedání primeru s vysokou pravděpodobností na více místech na obou řetězcích chromozomální nebo plazmidové DNA. ♦ Obvykle se vyskytne několik míst pro připojení primeru umožňujících nasednutí primem 3' konci k sobě, která se vyskytují na protilehlých řetězcích, a nejsou od sebe příliš vzdálená. ♦ Výsledkem je amplifikace mnoha fragmentů s různou délkou (max. 2000 bp). 97 Náhodně amplifikovaná DNA ■ Použití: ♦ Rychlá typizace většiny izolátů mikroorganizmů ♦ Typizace genomové rostlinné DNA z různých kultivarů ♦ Taxonomické studie a identifikační postupy ♦ Analýza mikrosatelitů ♦ AP-PCR může být kombinována s DGGE nebo SSCP analýzou. ♦ Produkty AP-PCR slouží pro přípravu hybridizačních sond používaných při binární typizaci ♦ Metoda má vyšší diskriminační schopnost než PCR 16S-23S mezerníkových oblastí, ale nižší než Rep-PCR. ■ Nevýhody: ♦ Nízká re p rod u kováte I n ost mezi laboratořemi. ♦ Částečné zvýšení reprodukovatelnosti je možné provedením reakce s různým ředěním DNA. Výsledek ovlivňují plazmidy přítomné v izolované DNA. 28 Chromozóm A Chromozóm B Chromozóm C Náhodné amplifikovaná DNA (AP-PCR) 1000 200 1000 200 1000 Amplifikace při nízké stringenci (nízká teplota pro pripojení primeru) 500 {> Příklad elektroforézy s AP-PCR produkty 1 500 bp -> 300 bp -> Elektroforéza v agarózovém nebo polyakralamidovém gelu i> B 1000 A B 200 100 4/ü-repetice je velmi variabilní, ale obsahuje sekvenci, která je specifická pro člověka. Připraví se dva primery, každý pro jeden směr, přičemž se využije nejvíce konzervativních úseků těchto sekvencí. ■ Primery nelze použít společně, neboť vzájemně hybridizují. Sekvence Alu však mohou být přítomny na DNA v obou směrech, takže primery se používají samostatně. ■ Lidské sekvence se budou amplifikovat, pokud leží mezi sousedními >4/ü-repeticemi, které jsou umístěny (orientovány) v opačných směrech. Tvoří se různý počet fragmentů lidské DNA v závislosti na velikosti lidské DNA v buněčné linii. Tato technika je často používána pro "odhalení" lidské DNA od ostatních DNA. 34 Alu\-PCR Primer A 3' AACGTCACTCGGCTCTA 5' Cast Alu sekvence 5'... ttgcagtgagccgagat ... 3' jedinečná pro primáty 3f...AACGTCACTCGGCTCTA...5' Primer B 5' TTGCAGTGAGCCGAGAT 3' amplifikace s primerem A A A A/iii Alu+- ~+Alu Alu*- Alv amplifikace s primerem B 5'. .. TTGCAGTGAGCCGAGAT ... 3' 3' TAGAGCCGACTGACGTT 5' 5'...ATCTCGGCTCACTCGAA...3' 3'. .. AACGTCACTCGGCTCTA ... '5 5' TTGCAGTGAGCCGAGAT 3' B 3' ... TAGAGCCGAGTGACGTT ... 5' Analýza mezerník< (RS-PCR, PC U prokaryot obsahují rDNA operony geny pro všechny tři typy rRNA (16S, 23S a 5S). Geny pro 16S a 23S rRNA jsou odděleny mezerníkovou oblastí, která se liší délkou v závislosti na druhu (od 278 bp u mykobakterií do do 2 kb u borrelií). Navíc u většiny Eubakterií se vyskytuje více kopií rDNA operonu, u nichž se vyskytují menší rozdíly v délce mezerníku. 500 bp 100 bp^ U Staphylococcus aureus se nachází v genomu 6 rrn operonu, všech 6 mezerníku mezi 16S a 23 S rRNA se může lišit svou délkou. Dvých oblasti v rDNA R-ribotypizace) Chromozóm A Chromozóm B 23S ^ť—-J - -ř~J» I^É^z^ ^ '55^ \& tffi 150 tap 7 t * i ■ * * ( ■ í> 23S 23S , , <° 350 Amplifikace Elektroforéza A I B 350 250 150 —>—>—>—>■ Návrh pimerů (^^) komplementárních k ohraničujícím sekvencím ■<- —> —>—>—>—> ■ ■<-*■ •*■—>—£ ■ —>—>—> —> —>—>—> —>■ <—«■ —>—>—>—>—>. ■*-—>- -<—«■ ■*-—>—t ■<-*• ►—>—>—>. ■ <1— 20 000 (b) selective PCR amplification Hindill (A/AGCTT) NNNNNNNNNCIASCTTNNNN-NNNNNNNNNGTCGAlANNNN- A HOI NNNNNNNNNCAGCTT_, NNNNNNNIMNGTCGAAlflNNN NNNNNNNNNCAGCTT_ , NNNNNNNNNGTCGAA0NNN------j A NNNNNNNNNCAGCTT„ / NNNNNNNNNGTCGAA0NNN------/ Taq] (T/CGA) —If--------nnnnt[č& -ff----------NNNNAGQ NNNNNNNNNCAGCTT 3'~NNNNNNNNNGTCGAA NNNNTICGGNNNNNNNNNNN NNNNAGCJCNNNNNNNNNNN no amplification amplification ------CAGCCNNNNNNNNNNN-5' 5'-NNNNNNNNNCAGCTTA- \ /---------[GTTCGGNNNNNNNNNNN-3 ' -*---lek 42 JAGCCNNNNNNNNNNN T02 In situ PCR (PCR in situ, incell PCR) Hybridizace in situ (ISH) umožňuje lokalizaci určité sekvence NK uvnitř jednotlivých buěnk, ale vykazuje nízkou detekční aktivitu. Konvenční PCR vyžaduje nutnost tkáně nebo buňky destruovat a izolovat NK, nelze asociovat výsledek amplifikaceke specifickému histologickému typu buněk. In situ PCR kombinuje vysokou citlivost PCR s cytologickou lokalizací sekvencí poskytnutou ISH ♦ PCR in situ hybridization ♦ incell PCR ♦ PCR driven ISH umožňuje asociovat výsledek amplifikace ke specifickému histologickému typu buněk umožňuje korelovat výsledek s histopatologickými rysy nebo množstvím buněk, obsahujících cílovou sekvenci Indirect In Situ PCR in situ amplification m Stfi/hybridization for detection PCR-product Direct In Situ PCR in srtü amplification with incorporation of labeled niicleotiiles direct detection 5** 3'-C 1-V :-5' PCR-product SMI |-3! 3-|_ -5' s'-C labeled probe % [abeled nucleotides Specifické sekvence jsou uvnitř buňky amplifikovány, čímž se zvýší počet kopií natolik, zeje lze snadno detekovat ♦ pomocí ISH (nepřímá in situ PCR) ♦ imunochemicky (přímá in situ PCR) 43 Příprava vzorku pro in situ PCR in Situ PCR tm Glass Slkfes >:: 111! -_^^-. cytospins, tissue sections fixation permeabiiizaíion i ŕ-- r I ^3 thermal cyding sealing ofcoversllp primers, nucleotides. DMA polymerase Fixace buněk nebo tkáně -zachování morfologie (paraformaldehyd) Permeabilizace - přístup PCR reagentů k NK (detergenty, proteázy) ♦ průběh PCR ♦ v buněčných suspenzích ♦ v cytocentrifugačních preparátech ♦ pod mikroskopickým sklem Detekce intracelulárních produktů ♦ ISH ♦ Imunochemicky (protilátky proti DIG-11-dUTP, fluorescein-dUTP, 3H-CTP) In situ PCR má aplikace jak ve výzkumu, tak v diagnostice: ♦ detekce virových nebo provirových N K (HIV, CMV, HBV, HSV-2) ♦ chromozomální přeskupení, translokace, hledání jednokopiových genů ♦ mapování nízkokopiových chromozomálních sekvencí v metafázických chromozomech ♦ detekce nízkokopiových mRNA a virových RNA 44 washing detection