Metody molekulární
diagnostiky
Molekulární diagnostika
Typizace
Léčba choroby
Prevence
Vyhledání zdroje / původce
Identifikace
Fylogenetické studie
Metody pro detekci
polymorfizmů v genomech
metody elektroforetické a
hybridizační
Metody studia sekvenčního polymorfizmu DNA
ˇ 1. Přímá metoda:
­ Sangerovo sekvencování
­ Pyrosekvencování
­ Pomocí čipů
ˇ 2. Nepřímé metody: fingerprinting (otisky DNA)
­ RFLP ­ polymorfizmus délek restrikčních fragmentů
­ AFLP ­ polymorfizmus délek amplifikovaných fragmentů
­ SSLP­ polymorfizmus délek fragmentů s jednoduchou repeticí
­ CFLP­ polymorfizmus délek fragmentů vytvořených kleavázou
­ SSCP ­ polymorfizmus konformace jednořetězců
­ DSCP ­ polymorfizmus konformace dvouřetězců
ˇ 3. Metody pro specifickou detekci jednonukleotidových
polymorfizmů
Složky prokaryotického genomu a
jejich využití pro subtypizaci
Klasifikace technik pro fingerprinting DNA prokaryot
Analýza celkové chromozomové DNA
1. Analýza počtu chromozómů (kvasinky
Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida;
protozoa; Aspergillus)
2. Polymorfizmus délky restrikčních fragmentů,
restrikční analýza (RFLP)
­ Analýza malých fragmentů
­ Analýza velkých fragmentů
­ Makrorestrikční analýza (pulzní gelová elektroforéza)
3. Selektivní hybridizace se sondou (Southernův
přenos restrikčních fragmentů na membránu a
následná hybridizace)
Princip RFLP
RFLP vzniká přestavbami sekvencí
inzercemi
delecemi
substitucemi bazí uvnitř restrikčních míst
Restrikční analýza chromozomální DNA (REA)
ˇ Jedna z prvních DNA typizačních metod zahrnující
analýzu počtu a velikosti restrikčních fragmentů
vznikajících štěpením specifickou restrikční
endonukleázou (RE).
ˇ Rozdíly mezi fragmenty se označují jako polymorfizmus
délek restrikčních fragmentů (RFLP).
ˇ Metoda restrikční analýzy
zahrnuje následující kroky:
­ izolace chromozomární DNA
­ výběr vhodné RE.
­ štěpení RE, která rozpoznává
4 až 6 bp dlouhé sekvence
­ standardní elektroforéza DNA fragmentů o velikosti 20 000 -
1000 bp v agarózovém gelu
­ vizualizace barvením v etidiumbromidu a densitometrické
vyhodnocení
Analýza velkých nebo malých fragmentů
ˇ Nevýhodou RE analýzy celkové
chromozomální DNA je velké množství
vytvářených restriktů s podobnou
pohyblivostí v tradičním agarózovém gelu.
ˇ Výsledkem je spektrum pruhů vizuálně
obtížně odlišitelných.
ˇ Pro přesné vyhodnocení míry podobnosti
spekter je nutné použít
­ densitometrické měření
­ korelační srovnání densitometrických křivek
ˇ Analýzu zjednodušit hodnocením pouze
ˇ malých fragmentů 50 ­ 1000 bp (PAGE +
barvení stříbrem)
ˇ velkých fragmentů 5 - 15 kb (FIGE)
ˇ Přes uvedené obtíže byla REA použita ke
studiu příbuznosti u řady bakteriálních
druhů Campylobacter, Legionella,
Neisseria, Staphylococcus, streptokoky aj.
Makrorestrikční analýza
chromozomální DNA pomocí PFGE
ˇ Metoda slouží pro stanovení
RFLP genomové DNA při
použití restrikčních
endonukleáz, které štěpí
DNA na < 30 místech.
ˇ Vznikají velké fragmenty
chromozomální DNA (10 -
1000 kbp), které jsou
separovány pulzní gelovou
elektroforézou.
ˇ Pro izolaci intaktní DNA není
vhodná konvenční metoda,
ale používá se specifický
postup. Příklad pulzní gelové elektroforézy DNA
různých kmenů Staphylococcus carnosus.
Analýza plazmidové DNA
ˇ Analýza obsahu a počtu plazmidů
ˇ Restrikční analýza plazmidové DNA (REAP)
ˇ Hybridizace se sondou - detekce specifických genů pro
­ virulenci
­ rezistenci k antibiotikům a antimikrobiálním chemoterapeutikům
ˇ Přenos plazmidů mezi kmeny (i mezi různými druhy a rody) se může
uskutečňovat:
1. Konjugací 2. Transdukcí 3. Fágem zprostředkovanou konjugací
ˇ Plazmidová analýza je rychlá, jednoduchá a levná metoda.
ˇ Má následující nevýhody:
­ kmeny bez plazmidů jsou netypovatelné
­ interpretace plazmidových profilů není jednoznačná (superhelicita)
­ dlouhodobá stabilita plazmidů je diskutabilní
ˇ Příklad analýzy plazmidů u Staphylococcus aureus z
epidemie na JIP v Olomoucké nemocnici.
ˇ V současné době se plazmidová analýza používá jako
doplňková typizační metoda u gramnegativních
(Salmonella, Neisseria, Escherichia) i grampozitivních
(Staphylococcus, Enterococcus, Helicobacter) bakterií.
Příklad detekce genu pro exfoliativní
toxin na plazmidech kmenů S. aureus
OC
CCC
Polymorfizmus délky genomových
segmentů u virů se segmentovaným
genomem
10% polyakrylamidový gel s genomovou segmentovanou RNA
rotavirů
Selektivní hybridizace
restrikčních fragmentů (SRFH)
ˇ DNA hybridizační diagnostické metody využívají
Southernův přenos (1975) pro detekci a lokalizaci
vybraných sekvencí, což umožní zjednodušení RFLP
analýzy snížením počtu srovnávaných fragmentů.
ˇ Základní metodické kroky při SRFH
­ štěpení celkové chromozomální DNA restrikčním enzymem
­ separace fragmentů pomocí elektroforézy
­ přenos fragmentů z gelu na nitrocelulózovou nebo nylonovou
membránu
­ hybridizace DNA navázané na membráně s jednou nebo více
značenými sondami homologickými se zkoumanými geny
­ detekce navázané sondy
ˇ sondy značené radioizotopy + autoradiografie
ˇ sondy značené neradioaktivně (digoxigenin, biotin, fluorescein, atd.) a
následná detekce zahrnující enzym (AP) a barvotvorný substrát nebo
enzym a chemiluminiscenční substrát
­ vyhodnocení RFLP
Princip selektivní hybridizace
Příklad hybridizace se
sondou specifickou
pro16S rDNA.
Přehled používaných sond pro
SRFH u prokaryot
1. Náhodně klonované sondy
­ Relativně stabilní oblasti bakteriálního chromozómu
ˇ Použití: Legionella, Brucella
2. Sondy specifické pro geny kódující metabolické faktory
nebo faktory virulence
­ Sondy je nutné připravit individuálně pro určité bakteriální
druhy, tzn. že tento přístup není použitelný obecně.
­ Sekvence některých genů jsou velice konzervativní a jsou proto
nevhodné k přípravě sond, naopak geny s určitou sekvenční
variabilitou, případně geny vyskytující se ve více kopiích jsou
velice vhodné.
ˇ Použití: Pseudomonas aeruginosa: gen pro exotoxin A
ˇ Staphylococcus aureus: mec (determinant meticilinové
rezistence)
­ Genově specifické sondy je možné využít k hybridizaci s
makrorestrikčními fragmenty separovanými pomocí PFGE
3. Sondy odvozené z vícekopiových elementů typu
inzerčních sekvencí a transpozonů
­ Inzerční sekvence (IS) jsou transponovatelné repetitivní DNA
elementy nacházející se v genomu prokaryotických
a eukaryotických organizmů.
­ Přítomnost elementu na určitých místech chromozómu je
odrazem chromozomálních přestaveb během evoluce.
­ Hybridizace se sondami připravenými z IS elementů vykazují
vysokou reprodukovatelnost a vysokou diskriminační schopnost
související s přítomností těchto elementů ve více lokusech na
chromozómu.
­ Bakteriální IS elementy mají na koncích obvykle 10-40 bp
dlouhé obrácené repetice, sonda se proto připravuje z vnitřních
sekvencí elementu.
­ Výběr restrikční endonukleázy a vhodného elementu pro
přípravu sondy je nutné provést pro každý bakterální druh.
ˇ Použití: Mycobacterium tuberculosis IS6110
ˇ další druhy mykobakterií
ˇ Staphylococcus aureus IS257/431
4. Sondy připravené z dalších repetitivních sekvencí
­ Pro stanovení polymorfizmů metodou SRFH byly použity některé
krátké repetitivní sekvence obecně přítomné v genomech
organizmů.
­ Pouze některé repetice jsou obecně použitelné:
ˇ 15-bp repetice z pozdního genu coa z bakteriofága M13
­ Escherichia coli
­ Staphylococcus
ˇ polymorfní tandemová repetice z mykobakterií
­ Mycobacterium tuberculosis (MPTR-SRFH)
ˇ repetitivní sekvence označovaná BOX
­ Streptococcus pneumoniae
ˇ náhodné trinukleotidové repetice jako např. (GTG)5
­ Salmonella, Shigella a Mycobacterium.
5. Sondy připravené z dalších variabilních genetických
elementů integrovaných v chromozómu
ˇ Profágy
ˇ Plazmidy
Příklad detekce profágů integrovaných v bakteriálním
genomu selektivní hybridizací DNA se 3 sondami
specifickými pro různé fágové serologické skupiny,
značenými biotinem, digoxigeninem a fluoresceinem
kb
8,3 
4,1 
1,7 
6. Ribotypizace - Sondy připravené z 16S rRNA nebo 23S
rRNA (rDNA-SRFH, rDNA-RFLP)
ˇ Ribotypizace je nejvšestrannější a nejvíce využívaná
strategie pro získání informace o polymorfizmu
bakteriálního genomu.
ˇ Historie:
­ 1965 - bylo zjištěno, že sekvence ribozomální RNA mohou být
využitelné ke stanovení příbuznosti organizmů
­ 1980 - poprvé byl použit termín ribotyp
­ 1981 - byla potvrzena teorie, že ribozomální RNA všech organizmů
pochází ze společného předka
­ 1983 - byla patentována metoda charakterizace organizmů na
základě ribozomálních DNA sekvencí
­ 1986 - ribotypizace byla použita pro srovnávací studii 41 různých
bakteriálních druhů
­ od 1990 - široké využití v oblasti lékařské a veterinární
epidemiologie, patologie, zjišťování kontaminace potravin atd.
­ 1995 - Bylo zavedeno automatizované zařízení RiboPrinter pro
fingerprinting DNA bakterií.
Charakteristika bakteriálního rrn operonu
ˇ rRNA-operon (rrn operon) se vyskytuje na
bakteriálním chromozómu v několika kopiích.
tRNA
P1 P2 16S-rRNA 23S-rRNA 5S-rRNA T1 T2tRNA
pre-rRNA
transkripce
posttranskripční úprava
(vyštěpení funkčních produktů)
DNA
promotory terminátory
geny
16S-rRNA tRNA 23S-rRNA 5S-rRNA tRNA
tRNA tRNA
Princip ribotypizace
ˇ Ribotypizace zahrnuje fingerprinting restrikčních
fragmentů genomové DNA, které obsahují celý
nebo část genu kódujícího 16S a 23S rRNA.
ˇ Hlavní výhody ribotypizace:
­ Sekvence genů pro ribozomální RNA jsou velice
konzervativní, proto pro ribotypizaci všech Eubakterií
může být použita jediná sonda.
­ Jelikož většina bakterií obsahuje několik ribozomálních
operonů, získáme po hybridizaci dostatečné množství
fragmentů umožňujícíci mezidruhové i vnitrodruhové
odlišení kmenů.
Automatizace
ribotypizace
Sondy používané pro SRFH u eukaryot
ˇ Jednolokusové sondy
­ Hybridizují k jedné hypervariabilní oblasti genomu a vytvářejí vzor
o 1-2 proužcích
­ Pro identifikační účely se používá směs (,,kokteil")
jednolokusových sond
­ Jsou citlivější a dávají jednodušší obraz než multilokusové sondy
­ Pro hybridizaci je třeba min 10 ng DNA
ˇ Mnoholokusové sondy
­ Hybridizují k repetitivním sekvencím vyskytujícím se s četností
100 ­ 1000 v genomu
­ Při Southernově hybridizaci se detekuje 20 ­ 30 proužků
­ U člověka se využívá minisatelitů, z nichž 60 má
společnou konvenční sekvenci
­ Délka repeticí u každé z alel je polymorfní
­ Pravděpodobnost, že 2 jedinci budou mít stejnou délku
1 repetice po štěpení restriktázou HinfI je 0,25.
Pokud uvažujeme 36 detekovatelných lokusů (proužků),
je pravděpodobnost výskytu stejného vzoru
0,2536=10-22
­ Nevýhodou je vysoký nárok na množství DNA (250 ng)
­ Příklad hybridizace se sondou připravenou z minisatelitu
v myoglobinovém genu s konvenční sekvencí
GGAGGTGGGCAGGANG
ˇ Sondy z transponovatelných sekvencí
­ Transpozony
­ Retrotranspozony
ˇ Sondy z dlouhých roztroušených elementů (LINEs)
ˇ Sondy z krátkých roztroušených elementů (SINEs)
ˇ STRs (short tandem repeats) tetranukleotidové
repetice analyzované pomocí multiplex PCR s
následným sekvencováním ve 4 lokusech u člověka
nahradily od roku 1994 hybridizační metody pro
identifikační účely
Interpretace elektroforetických vzorů
proužků a konstrukce dendrogramů
ˇ Otisk DNA je výsledkem většiny molekulárních metod.
ˇ Získaný vzor, který je viditelný na obarvených
elektroforetických gelech nebo vyvolaných hybridizačních
membránách
­ Je specifický pro izoláty určitého klonálního původu
­ Vzorem se rozumí skladba určitých znaků (kvantitativně
vyjádřených) jimiž se vyznačuje daný objekt.
­ Znakem je fragment DNA určité velikosti, u kterého se
hodnotí přítomnost nebo nepřítomnost nebo jeho plocha.
ˇ Při DNA-typizaci jedinců získáme velkou množinu dat, kterou
je třeba převést do prezentovatelné formy určením tříd nebo
skupin.
ˇ K tomuto účelu se využívá shluková analýza
­ využívá se k nalezení hierarchického seskupování množin dat s
mnoha proměnnými
­ redukuje počet objektů jejich umístěním do skupin
Shluková analýza
1. Metody nehierarchické
­ dávají jednoduché rozdělení, které optimalizuje homogenitu
uvnitř skupiny
2. Metody hierarchické
­ členové níže zařazených shluků se stávají členy větších výše
zařazených shluků, výsledkem je zobrazení souhrnu jejich
hierarchie
A. Dělící
­ Začínají s předpokladem, že všechny objekty jsou
částí jednoho shluku
­ Algoritmus štěpí tento velký shluk krok za krokem
dokud každý objekt netvoří samostatný shluk
B. Aglomerační
­ Na začátku každý shluk obsahuje jeden objekt
­ Shluky jsou postupně spojovány
­ cílem obdržet přímé znázornění příbuznosti mezi objekty
ˇ Výsledek hierarchického shlukování je obvykle zobrazen jako
dendrogram, ve kterém jsou zobrazeny následné jednotky shluků
společně s hodnotami podobnosti vedoucím k těmto jednotkám
Algoritmus hierarchických aglomeračních
metod shlukování
1. Vytvoření množiny dat.
ˇ Soubor hodnot, které nabývají objekty na základě množství
znaků.
2. Transformace dat.
ˇ Sjednocení jednotek, vyřazení kvalitativně rozdílných znaků.
3. Sestavení matice podobnosti nebo rozdílnosti.
ˇ Na základě měření podobnosti nebo rozdílnosti každého páru
objektů.
4. Shlukování.
ˇ Výběr vhodného algoritmu, což je v podstatě vztah pro
opakovaný výpočet rozdílnosti nebo podobnosti nového
shluku s ostatními shluky.
5. Dendrogram.
ˇ Znázornění postupného shlukování jednotlivých objektů
grafickou formou.
Měření podobnosti.
ˇ Při určování podobnosti elektroforetického vzoru (dvou drah proužků)
a tím i podobnosti mezi dvěma izoláty se využívají koeficienty
podobnosti založené na
­ Přítomnosti nebo absenci proužků
­ denzitometrických hodnotách.
ˇ Koeficienty založené na proužcích
­ Jaccardův koeficient:
­ Diceho koeficient:
­ Plošně citlivý koeficient: Ai ,j
Si ,j = ni + nj + ni ,j
2ni ,j
Si,j =
ni + nj
ni ,j

Ai ,j =   + Bi ,k - Bj ,kk=1
Si,j = podobnost mezi i-tou a j-tou řadou proužků
ni = počet proužků v i-té dráze
nj = počet proužků v j-té dráze
ni,j = počet odpovídajících si proužků v i-té a j-té dráze
Ai,j = hodnota vycházející z počtu odpovídajících si proužků v i-té a j-té dráze,
zohledňující rozdíly v plochách odpovídajících si proužků
 = konstanta
Bi,k - Bj,k= absolutní hodnota rozdílu ploch k-tých odpovídajících si proužků v i-té
a j-té dráze
ni,j
Si,j =
ni + nj - ni,j
Nejčastěji používané metody pro
shlukování
ˇ Metoda nevážených průměrů párových
skupin (unweighted pair group average
method, UPGMA).
­ Shluky jsou spojovány na základě průměrné
vzdálenosti mezi všemi členy ve dvou
skupinách.
­ Tato metoda se využívá při vyhodnocování
otisků DNA (elektroforetických vzorů)
ˇ Jednoduché spojování
(neighbour joining, metoda nejbližšího
souseda).
­ Shluky jsou spojovány na základě nejmenší
vzdálenosti (největší podobnosti) mezi dvěmi
skupinami.
­ Metoda má použití při sestavování
fylogenetických stromů odvozených z
porovnávání částečných sekvencí
konzervovaných genů, např. 16S a 23S rRNA.
M.caseolyticus
M.unicus
M.eqiupercicus
M.carouselicus
M.lamae
M.bovicus
M.brunensis
Příklad jednonukleotidových polymorfizmů
ˇ Příklady běžných chorob detekovatelných
pomocí SNPs
­ Parkinsonova choroba
­ Alzheimerova choroba
­ Diabetes typu II
­ Crohnova choroba
­ Obezita
TTTTCCCCCCCCAA--TTGGGGTTGGCC0
AATTCCGGCCCCAACCTTGGCCTTGGCCB
TTTTCCCCCCCCAAGGTTGGGGTTGGCCA
Krevní skupina
Schematické znázornění metod s vysokou rozlišovací
schopností pro identifikaci polymorfizmů v genomech
Přehled základních metod
ˇ Enzymatické
­ PCR-RFLP
­ AS-PCR (ARMS)
­ AFLP se specifickými adaptory
­ Ligázová řetězová reakce
ˇ PCR-OLA
­ Ligace prostřednictvím RCA
­ Sangerovo sekvencování
­ Pyrosekvencování
­ CFLP
ˇ Konformační
­ SSCP
ˇ PCR-SSCP
ˇ ddF
­ DGGE
­ DSCP
ˇ HMA
ˇ Hybridizační
­ ASO
­ FISH
­ PNA-sondy
­ Oligonukleotidové čipy
ˇ Hybridizace se sondami
ˇ Minisekvencování
ˇ Sekvencování hybridizací
ˇ Fluorescenční výměny
­ Kvantitativí PCR s
fluorescenčními
hybridizačními sondami
­ Molekulární ,,majáky"
­ FRET
­ Fluorescenční polarizace
ˇ Hmotnostní spektrometrie
Polymorfizmy detekované speciálními
elektroforetickými metodami
ˇ Odhalení lokálních polymorfizmů v DNA je závislé na použití
speciálních elektroforetických
­ Krátké fragmenty DNA o konstantní délce
­ Elektroforetické separace v závislosti na jejich odlišné sekvenci
ˇ Metody jsou vhodné zejména pro srovnání polymorfizmu na úrovni
genů, aniž by bylo nutné stanovovat přímo jejich sekvenci.
ˇ Úseky DNA s vhodnou velikostí (100 - 2500 bp) se pro analýzy
připravují:
1. Klonováním
2. Restrikčním štěpením
3. Polymerázovou řetězovou reakcí (PCR)
ˇ Výsledky mohou být ovlivněny
­ hustotou a síťováním polyakrylamidového gelu
­ teplotou gelu
­ obsahem přídatných chemických látek v gelu
­ délkou analyzovaného fragmentu
­ lokalizací rozdílných sekvencí na analyzovaných fragmentech
Konformační polymorfizmus jednořetězců
(Single-Strand Conformation Polymorphism -
SSCP)
ˇ SSCP analýza se obvykle používá pro detekci
sekvenčních rozdílů mezi různými alelami téhož
genu
ˇ Metoda je vhodná pro sledování změn (mutací)
na krátkých fragmentech DNA o velikosti 150 -
400 bp
ˇ Metoda využívá vytváření rozdílné sekvenčně
specifické intramolekulární struktury ssDNA
ovlivňující rychlost pohybu při nedenaturujících
elektroforetických podmínkách
ˇ U delších fragmentů se snižuje diskriminační
účinnost a reprodukovatelnost
Princip metody SSCP
ˇ zvýšení účinnosti SSCP se dosahuje
různými modifikacemi:
­ RFLP-SSCP
ˇ přístup kombinující štěpení DNA
restriktázami s následnou SSCP
ˇ vzdálenost polymorfizmu od konce
fragmentu
­ Vazbou různých látek ovlivňujících
elektroforetickou mobilitu ssDNA
­ RNA-SSCP (je nutno připravit ssRNA
transkripcí pomocí T7- nebo SP6-RNA
polymerázy)
ˇ SSCP je vhodná pro analýzu mutací v
prokaryotických (rDNA), eukaryotických a
virových genomech
ˇ Homozygotní DNA vytváří 2
elektroforetické formy
ˇ Heterozygotní DNA obsahující sekvence
dvou různých alel vytváří 4
elektroforetické formy
Dideoxy fingerprinting (ddF-SSCP)
ˇ Hybridní diagnostická metoda využívající dva metodické
přístupy:
­ Sangerovo sekvencování, reakce je na rozdíl od
klasického sekvencování prováděna pouze s jedním
dideoxy terminátorem.
­ SSCP
ˇ Používá se zejména k detekci
mutací u eukaryotických genů.
ˇ Mutace jsou detekovány jako výsledek ztráty nebo
získání dideoxy-terminačního segmentu nebo na základě
rozdílné elektroforetické mobility u alespoň jednoho z
dideoxy-terminačních segmentů.
Princip ddF
Denaturační gradientová gelová elektroforéza
(Denaturating Gradient Gel Electrophoresis - DGGE)
ˇ Metoda využívá rozdílné elektroforetické mobility u částečně
denaturované DNA a DNA v nedenaturovaném stavu
ˇ Vzorky o velikosti 150 - 1200 bp se analyzují v
polyakrylamidovém gelu s denaturačním gradientem zajištěným
­ postupně vzrůstající teplotou (TGGE)
­ vzrůstající koncentrací denaturačního činidla
ˇ formamidu
ˇ močoviny
ˇ dsDNA se pohybuje během elektroforézy v závislosti na její
velikosti a pozvolně denaturuje
­ na začátku elektroforézy není patrný žádný rozdíl v elektroforetické mobilitě
­ po určité době denaturace ovlivní rychlost elektroforetické migrace (zpomalení
vzhledem k dsDNA)
­ elektroforéza sama umožní odlišit sekvenční polymorfizmus na základě odlišné
hodnoty Tm srovnávaných vzorků
ˇ Zvýšení rozlišovací schopnosti dosáhneme
­ připojením GC-svorek na konce analyzovaných fragmentů
ˇ zamezíme tím úplné denaturaci až do jednořetězcových forem a zvýšíme
­ provedením 2-D (dvojrozměrné) DGGE
DGGE je vhodná pro
ˇ analýzu mutací v eukaryotických genech
ˇ diagnostiku dědičných chorob
ˇ analýzu mutací v prokaryotických genech
­ charakterizaci bakteriálních populací na základě DGGE 16S
rDNA
2D TGGE1D
Sekvenčně specifická elektroforéza
zprostředkovaná vmezeření barviv do DNA
ˇ Zřídka používaná metoda ke stanovení sekvenčních
rozdílů v dsDNA fragmentech do velikosti 1500 bp
ˇ využívá vazbu bis-benzimidu (H33342) na AT páry
ˇ Elektroforéza se provádí v agarózových gelech s bis-
benzimid-polyetylen glykolem
ˇ Princip metody
­ a) vazba bis-benzimidu na AT bohaté fragmenty DNA
­ b) následné zpomalení elektroforetické mobility dlouhými
molekulami polyetylenglykolu u DNA fragmentů bohatých na AT
Analýza konformace dvouřetězcové DNA
(Double Strand Conformation Analysis -
DSCA)
ˇ Diagnostická metoda, která využívá rozdílných ohybů v
dsDNA (double strand conformation polymorphism - DSCP)
ovlivňujících elektroforetickou pohyblivost při nedenaturujících
elektroforetických podmínkách v polyakrylamidovém gelu a
umožňuje tak rozlišit DNA-řetězce s různou sekvencí.
ˇ Metoda využívá předpokladu, že dsDNA ve vodném roztoku
zaujímá složitou konformaci s vnitřním zakřivením, které
závisí na nukleotidové sekvenci
ˇ Zakřivení DNA se může přímo vztahovat ke tření, které
fragment dsDNA překonává při elektroforéze v porézních
gelech
ˇ Substituce páru bází v kritickém místě dsDNA fragmentu vede
ke změně vinutí a může zásadně ovlivnit elektroforetickou
mobilitu během nedenaturační polyakrylamidové gelové
elektroforézy s vysokou rozlišovací schopností
ˇ Využívá se k detekci bodových mutací v eukaryotických
genech (fragmenty o délce 100-500 bp)
Heteroduplexní analýza,
analýza pohyblivosti heteroduplexů
(Heteroduplex Mobility Assay ­ HMA)
ˇ Diagnostická metoda, která využívá rozdílné
elektroforetické pohyblivosti heteroduplexů.
Používá se k lokalizaci a detekci bodových
mutací v eukaryotických a virových genomech.
ˇ homoduplex (homoduplex). Hybridní molekula
DNA, jejíž řetězce se vyznačují úplnou
komplementaritou.
ˇ heteroduplex (heteroduplex). Hybridní molekula
DNA vyznačující se neúplnou komplementaritou.
Analýza elektroforetické pohyblivosti heteroduplexů
Princip metody DGGE heteroduplexů
Polymorfizmus délky fragmentů vytvořených
štěpením enzymem Cleavase
(Cleavase Fragment Length Polymorphisms -
CFLP)
ˇ Diagnostická metoda, která využívá enzymu kleavázy k detekci
a lokalizaci polymorfizmů v jednořetězcové DNA
ˇ Optimální velikost fragmentů pro tuto analýzu je do 2700 bp.
ˇ ssDNA vytváří různé sekundární struktury (vlásenky, vlásenky
se smyčkou, křížové struktury) v závislosti na primární
struktuře.
ˇ Cleavase je specifická endonukleáza, jejíž cílové místo se
nachází vždy u paty vytvořené vlásenky na molekule ssDNA.
ˇ Enzym nepůsobí na všechny vlásenky (pravděpodobně v
závislosti na dalších faktorech ovlivněných strukturou ssDNA).
ˇ Mutace (bodové, delece, inzerce) a modifikace v
nukleotidových sekvencích ovlivňují sekundární strukturu
ssDNA a konečným výsledkem se vytvoření rozdílných míst
rozpoznávaných enzymem.
CFLP
ˇ Po stěpení enzymem Cleavase vzniká spektrum
fragmentů charakteristické pro danou molekulu
ˇ Separaci fragmentů provádíme na krátkém
denaturačním polyakrylamidovém gelu
ˇ Metoda CFLP je metodou porovnávající tvorbu
vlásenek v jednotlivých jednořetězcích, ale z
obecného hlediska je polymorfizmus CFLP
analogický s RFLP.
ˇ Metoda byla použita na
­ odlišení bakteriálních patogenů
­ detekci mutací u rychle mutujících virů
­ detekci mutací v genech pro rezistenci u bakterií
­ detekci mutací v eukaryotických genech
(např. gen pro p53)
Schematický postup CFLP
1. Příprava koncově
značené dsDNA (na
obrázku je znázorněno *)
2. Teplotní denaturace DNA
3. Ochlazení DNA a
vytvoření vlásenek
4. Částečné štěpení
Cleavase I (na obrázku
znázorněno )
5. Elektroforéza v
denaturačním
polyakrylamidovém gelu
ˇ (pouze koncově značené
DNA jsou detekovány)
Příklad polymorfizmu CFLP u
16S rDNA různých bakteriálních druhů
Diagnostické amplifikační
metody nevyužívající PCR
Amplifikační metody umožňují detekovat
jedinou kopii cílové DNA, zatímco při
hybridizačních metodách musí být k dispozici
minimálně 104 -105 kopií DNA, aby bylo možné
při detekci získat signál.
Přehled metod používaných pro
amplifikaci nukleových kyselin
Amplifikační metoda Používané enzymy Rok
publikace
Amplifikace specifické sekvence
ˇ PCR (polymerázová řetězová
reakce) a její modifikace
termofilní DNA
polymeráza (Taq, Tth,
Tma)
1986
ˇ TAS (amplifikace pomocí
transkripce)
zpětná transkriptáza,
RNA polymeráza
1989
ˇ 3SR (amplifikace pomocí
transkripce)
zpětná transkriptáza,
RNáza H,
RNA polymeráza
1990
ˇ SDA (amplifikace
vytěsňováním řetězce)
restrikční endonukleáza,
DNA polymeráza (bez
3` 5` exonukleázové aktivity)
1992
Amplifikace sondy
ˇ LAR (ligázová amplifikační
reakce)
DNA ligáza 1989
ˇ LCR (ligázová řetězová
reakce)
termofilní DNA ligáza 1991
ˇ reakce s Q-replikázou Q-replikáza 1988
Amplifikační systémy založené na
transkripci (TAS a 3SR)
ˇ Transcription-based Amplification System: metoda
využívá pro amplifikaci nukleových kyselin transkripci
in vitro.
ˇ Každý cyklus TAS se skládá ze dvou částí:
­ syntéza molekuly DNA, která je komplementární k cílové
nukleové kyselině (RNA nebo ssDNA)
­ transkripce nově syntetizované cDNA, která slouží jako
intermediát a templát pro RNA polymerázu in vitro.
ˇ Syntéza cDNA je umožněna připojením speciálně
navržených primerů:
­ oblast primeru směrem ke 3`-konci je komplementární k
cílové DNA
­ oblast primeru směrem k 5`-konci tvoří specifická sekvence
obsahující promotor pro T7 RNA polymerázu.
Amplifikační systémy založené na
transkripci (TAS a 3SR)
ˇ V prvním kroku je po připojení primeru pro každou
cílovou RNA nebo ssDNA syntetizována molekula
ssDNA pomocí zpětné transkriptázy.
ˇ Syntéza druhého řetězce vyžaduje tepelnou denaturaci
*RNA-DNA nebo DNA-DNA hybridních molekul.
ˇ Po přidání druhého primeru a opět zpětné
transkriptázy, probíhá syntéza druhého řetězce.
Výsledná kopie dsDNA obsahuje funkční T7 promotor
na jednom nebo obou koncích cDNA.
ˇ Po přidání T7 RNA polymerázy dochází k transkripci
cDNA a z každého templátu vzniká až 40 molekul
RNA (toto je amplifikační krok).
TAS a 3SR
ˇ Nové molekuly RNA tvoří substrát pro
další cyklus TAS. Po několikanásobném
opakování cyklu získáme několik miliónů
kopií.
ˇ * proces tepelné denaturace RNA-DNA
duplexů může být nahrazen enzymatickým
odstraněním RNA pomocí RNázy H.
Takto modifikovaná amplifikační technika
je isotermní (nevyžaduje změny inkubační
teploty a přidávání zpětné transkriptázy při
dalším cyklu). Proces se nazývá Self-
Sustaining Sequence Replication (3SR)
nebo Nucleic Acid Sequence-Based
Amplification (NASBA).
ˇ Aplikace a použití:
ˇ detekce lidského papilomaviru
ˇ detekce rezistence k azidotymidinu
u HIV
ˇ detekce Chlamydia trachomatis
ˇ detekce Mycobacterium tuberculosis
Skupina metod pro amplifikaci
molekuly navázané sondy
Alternativní metody pro detekci
nízkého počtu molekul cílové
sekvence využívající amplifikaci
samotné sondy po vazbě na cílovou
sekvenci.
Amplifikace RNA-sondy pomocí
Q-replikázy
ˇ Q-replikáza je RNA-dependentní RNA polymeráza, která replikuje
genomovou RNA bakteriofága Q (Leviviridae). Enzym rozpoznává
specifickou sekundární strukturu RNA tvořenou párováním bazí uvnitř
molekuly bakteriofágové RNA. Jiné sekundární struktury RNA nejsou
enzymem rozpoznávány.
ˇ Sonda se připravuje transkripcí in vitro. Pro konstrukci sondy, která je schopná
replikace se využívá:
­ predikce sekundární struktury RNA podobné standardní struktuře v genomu
bakteriofága
­ sonda nese navíc ve smyčce s vlásenkou na 3` nebo 5` konci sekvenci specifickou
pro cílovou molekulu.
ˇ Po provedení hybridizace se volná sonda se odstraní RNázou III (u navázané
sondy chybí rozpoznávací místo pro RNázu III v důsledku změny sekundární
struktury po vazbě na cíl).
ˇ Systém s Q-replikázou byl vyvinut za účelem zesílení hybridizačních signálů
amplifikací samotné sondy.
ˇ Využívá se pro detekci obtížně kultivovatelných mikroorganizmů, např.
Chlamydia trachomatis.
Amplifikace sondy Q-replikázou
Ligázová řetězová reakce
(Ligase chain reaction - LCR)
ˇ Amplifikace cílové sekvence pomocí ligázy je alternativní metoda pro
amplifikaci oligonukleotidové sondy navázané na cílovou sekvenci využívající
DNA ligázu.
ˇ Při LCR se nevytváří nové kopie cílové sekvence, proto se řadí do skupiny
metod pro amplifikaci sondy.
ˇ Metoda využívá DNA ligázu ke spojení dvou párů komplementárních
oligonukleotidových sond po jejich připojení na cílovou sekvenci.
­ Úspěšná ligace proběhne pouze při dokonalém párování 3` a 5` konců obou
oligonukleotidových sond k cílové molekule.
ˇ Po proběhnutí první úspěšné ligace vzniká produkt, který napodobuje původní
molekulu a slouží jako templát pro připojení zbývající dvojice oligonukleotidů
a jejich ligaci.
ˇ Nevýhodou ligázové amplifikační reakce (LAR) je teplotní nestabilita DNA
ligázy a nutnost přidávát ligázu po každé denaturaci.
­ V současnosti sepoužívá ternostabilní DNA ligáza z Thermus aquaticus, která je
stabilní po mnoha cyklech denaturace (LCR).
Ligázová řetězová reakce (LCR)
ssDNA
Použití LCR
ˇ pro detekci obtížně kultivovatelných patogenů
­ Neisseria gonorrhoae
­ Borrelia burgdorferi
­ Mycobacterium sp.
ˇ pro detekci mutací v lidských genech (dědičná nemocnění)
Oligonukleotidové ligační stanovení (OLA)
ˇ Modifikace LCR využívající pouze jedné dvojice sousedících
oligonukleotidů může být kvantitativní metodou
­ ligázová detekční reakce (LDR)
­ oligonukleotidové ligační stanovení (OLA)
ˇ Lineární kinetika amplifikace
ˇ Ve spojení s analýzou produktů PCR, kde se dá očekávat dostatečné
množství templátu, je OLA používáno jako účinný detekční systém
bodových mutací (PCR-OLA).
ˇ Tento přístup nevyžaduje průkaz amplifikovaného produktu na elektroforéze
­ využívá 5'-koncového značení první oligonukleotidové sondy afinitní značkou -
biotinem a opačného konce druhé sondy reportérskou značkou (např.
fluorescenční látka, digoxigenin nebo alkalická fosfatáza).
­ Pouze po ligaci jsou obě značky neseny jednou molekulou.
­ Po ligázové reakci jsou produkty zachyceny na afinitní matrici se streptavidinem
a nezligované reportérské sondy jsou odmyty.
­ Navázaný materiál je měřen na základě
ˇ fluorescence,
ˇ barevné reakce
ˇ enzymatické aktivity
ˇ FRET
­ může se stát v budoucnu rozšířenou automatizovanou metodou využívající DNA-čipy pro
detekci nízkokopiových cílů a změn v nukleotidových bázích
Amplifikace otáčivou kružnicí -
RCA (Rolling Circle Amplification)
ˇ Metoda amplifikace sondy navržená pro detekci jednonukleotidových polymorfizmů
přímo v genomové DNA.
ˇ Pro každý polymorfizmus je navržena alelově specifická sonda, kterou tvoří
oligonukleotid dlouhý 80 až 90 bází.
­ Fosforylovaný 5'-konec sondy nese přibližně 20 nukleotidů, které hybridizují k oblasti
bezprostředně vedle 5' polymorfního místa.
­ 3'-konec sondy obsahuje 10 až 20 nukleotidů, komplementárních k oblasti bezprostředně
vedle 3' polymorfního místa.
ˇ Používané alelově-specifické sondy jsou identické s výjimkou báze na 3'-konci, která se
liší tak aby byla komplementární k polymorfnímu místu.
ˇ První krok RCA zahrnuje
­ společnou hybridizaci obou konců sondy s cílovou sekvencí (vytvoření otevřené kružnice)
­ diskriminační ligaci sondy termostabilní ligázou, jejímž výsledkem je kružnicová ssDNA.
­ Ligační krok proběhne pouze v případě, že se 3'-konec sondy páruje s polymorfním místem.
ˇ Mezi koncovými rameny sondy, která jsou cílově specifická pro detekovanou sekvenci
jsou vtěsnaná vazebná místa pro RCA-primery.
ˇ Druhý krok RCA zahrnuje
­ hybridizaci RCA-primerů, případně náhodných hexanukleotidů na cirkularizovanou sondu
­ izotermní replikaci otáčivou kružnicí v přítomnosti DNA-polymerázy vytěsňující řetězce
(např. DNA-polymeráza fága 29)
­ Prodlužující se řetězce jsou vytěsňovány a tvoří jednořetězcové konkatemery původní sondy,
na které se mohou vázat další RCA-primery a vytvořit složité replikativní struktury
RCA v homogenním roztoku
ˇ Ligáza katalyzuje ligaci sondy ve formě otevžené
kružnice, která přesně svými
3`- a 5`-konci hybridizuje k místu se SNP
ˇ Hybridizace náhodných hexanukleotidů
ˇ Replikace otáčivou kružnicí pomocí
DNA-polymerázy fága 29
ˇ Vznikme až 109 kopií sekvence
Rca.swf
Stanovení SNP pomocí DNA čipu
a RCA
ˇ Metoda pracuje na
principu amplifikace
signálu na DNA-čipu
ˇ Studovaná cílová
molekula DNA je
denaturována
ˇ Při hybridizaci k
cílové sekvenci ligáza
katalyzuje spojení dvou
oligonukleotidových
sond z nichž jedna je
imobilizovaná na pevném podkladu čipu
ˇ Ligace nastane pouze tehdy jestliže je 5` báze v místě SNP přesně komplementární k
cílové DNA (je 500× efektivnější než při nehomologickém páru)
ˇ Rozdíly v sekvenci na 5`-konci poskytují možnost specificky a simultánně
detekovat jednotlivé varianty SNP
ˇ 29 DNA-polymeráza katalyzuje izotermní replikaci formou otáčivé kružnice,
inkorporuje značené nukleotidy a rostoucí řetězec je vytěsňován
Technologie cirkulující sondy ­ Cycling
Probe Technology (CPT)
ˇ CPT využívá hybridizaci cílové sekvence DNA (může být použit i
amplifikovaný produkt PCR) s chimérickou na obou koncích fluorescenčně
značenou DNA-RNA-DNA sondou
ˇ Sonda po navázání na komplementární sekvenci poskytuje vytvoření
štěpitelného místa pro RNázu H.
ˇ Reakce probíhá za specifické konstantní teploty, která umožňuje jak
hybridizaci sondy, tak zachování templátové DNA v jednořetězcovém stavu.
ˇ Vytvořený duplex chimérické sondy a cílové sekvence je rozpoznán RNázou H
a RNA-sekvence sondy je degradována.
ˇ Rozštěpené fragmenty sondy nemají v cílovém místě při reakční teplotě stabilní
vazbu a disociují do prostředí.
ˇ Uvolněná fluorescenčně značená část sondy emituje fluorescenci, jejíž intenzita
je měřena.
ˇ Cílové místo je potom volné, hybridizuje s další sondou a celý cyklus se
opakuje
ˇ Fragmenty sondy se akumulují lineární kinetikou a slouží jako základ pro
detekci a kvantifikaci cílové sekvence.
ˇ Výhodou oproti PCR je, že cílová sekvence sama o sobě není amplifikována a
tím se minimalizuje riziko přenosu kontaminace. Současnou snahou je
optimalizace reakce CPT tak, aby bylo možné detekovat jednonukleotidové
polymorfizmy.
CPT
Amplifikace signálu
ˇ Pro zvýšení citlivosti hybridizačních metod je možné použít
alternativní techniky k technikám enzamatickým (založeným
na polymeráze nebo ligáze).
ˇ Zesílení signálu vytvořeného navázanou sondou může být
dosaženo
­ větší reportérovou molekulou
­ skupinou více molekul připojených na samotnou sondu (složené sondy)
ˇ Výsledkem metod pro amplifikaci signálu nejsou
amplifikované sekvence DNA, proto jsou tyto metody více
citlivé na kontaminaci a nespecifické signály
ˇ Detekční citlivost metod pro amplifikaci signálu je vyšší než
u klasických hybridizačních metod s autoradiografickou
barevnou nebo chemiluminiscenční detekcí.
Amplifikace signálu pomocí
složené sondy