Přenosy genů do živých buněk
(transfekce)
Účel:
­ studium funkce genů
- studium mechanismů řídících genovou expresi
Klasifikace transfekčních postupů
Podle stability transgenu:
1. transfekce přechodná
- přenášená DNA se dostává do
buňky, ale zůstává
v extrachromozomálním stavu,
transgen se přepisuje několik dní
- jedna transfekovaná buňka může
obsahovat větší počet kopií
transfekční DNA (vyšší exprese
transgenu)
2. transfekce stabilní
- přenášená DNA se začleňuje do
chromozomu hostitelské buňky
(tento děj nastává z nízkou
frekvencí 10-5 ­ 10-6)
- nízká pravděpodobnost výskytu
dvou nebo více kopií transgenu v
jedné buňce
Podle způsobu penetrace
membrány:
1. Postupy biochemické
2. Postupy fyzikální
3. Postupy biologické
Biochemické transfekční postupy
1. Transfekce zprostředkovaná fosforečnanem vápenatým:
- DNA se smíchá s chloridem vápenatým ve fosfátovém pufru
- vytvoří se jemná sraženina DNA a fosforečnanu vápenatého
- precipitát je pohlcován buňkami endocytózou
- účinnost transfekce je relativně vysoká: až 50% buněk může
cizorodou DNA přijmout
- ,,hrubostí" sraženiny lze regulovat poměr cytotoxicity versus
účinnosti transfekce
Použití:
- přechodná i stabilní transfekce fibroblastů a jiných adherujících
i neadherujících buněk
Biochemické transfekční postupy
2. Transfekce zprostředkovaná DEAE-dextranem
Dietylaminoetyl-dextran:
- vysokomolekulární kladně nabitý polymer
- slouží jako most mezi negativně nabitou DNA a negativně nabitým povrchem
buňky
Princip:
- negativně nabitá DNA se váže ke kationtům DEAE- dextranu
- rozpustný komplex se přidá k buňkám
- přenos komplexu do buněk endocytózou
Použití:
- adherující i neadherující buňky (značná variabilita účinnosti u rýzných typů
buněk)
- nevhodné pro stabilní transfekci (toxicita)
- lze použít nižších koncentrací transfekční DNA ve srovnání s precipitací
fosforečnanem vápenatým
Biochemické transfekční postupy
3. Transfekce lipofekcí
Princip:
- transfekčním činidlem je lipofilní molekula, která obklopí
transfekční DNA
- transfekční činidlo má pozitivně nabité skupiny ­ usnadnění vazby k
negativně nabité DNA
- lipidy s navázanou DNA fúzují s buněčnou membránou a zajistí tak
přenos DNA do buňky
Použití:
- rozmanité buněčné typy, často velmi dobrá účinnost
Biochemické transfekční postupy
4. Transfekce zprostředkovaná polykationty (polybrenem a
poly-L-ornitinem)
Princip:
- DNA vytváří s polykationty komplexy, jejichž přenos do buněk je
usnadněn permeabilizací buněčné membrány a osmotickým šokem,
které zajišťuje DMSO
Fyzikální transfekční postupy
2. Transfekce genovou puškou (,,gene gun")
Princip:
- nastřelování buněk kovovými projektily pokrytými DNA
Použití:
ˇ vhodná metoda pro transfekci rostlinných buněk
ˇ je třeba optimalizovat řadu parametrů:
- počet buněk vystavených transfekci (buněčnou hustotu, rychlost
proliferace buněk)
- typ média
- stupeň vakua ve střelné komoře
- míru tlaku hélia na mikroprojektily
- vzdálenost mezi puškou a buňkami
- velikost mikroprojektilů (obvykle částice zlata nebo wolframu o
průměru 0,6-1,6 m)
Fyzikální transfekční postupy
3. Mikroinjekce
Princip:
mechanický přenos DNA do buněk jemnou jehlou mikromanipulátoru
Použití:
Vhodnými objekty jsou velké buňky jako oocyty a vajíčka
Přenosy genů do zárodečných myších
buněk mikroinjekcí
Význam:
- umožňují studium funkce genů v kontextu intaktního organismu
- myši, které tímto způsobem získaly cizí geny se nazývají
transgenní myši
Princip:
- DNA se mikroinjekcí vpraví do prvojádra oplozeného myšího vajíčka
- po mikroinjekci se vajíčka přenesou do pseudobřezí myši, kde se
dále vyvíjejí
- u přibližně 10% potomstva bude cizorodá DNA integrována do
genomu všech buněk
- protože cizorodá DNA se v potomstvu vyskytuje v somatických i
zárodečných buňkách, přenáší se křížením do dalšího potomstva
stejně, jako kterýkoliv jiný gen
Vytvoření transgenní myši
Přenosy genů do myší prostřednictvím
embryonálních kmenových (ES) buněk
ES buňky jsou uměle kultivované buňky odvozené z raných
myších embryí, tzv. blastocyst, které mohou být kultivovány in
vitro a později raným embryím opět předány a podílet se tak na
vývoji všech tkání.
Princip:
- přenos DNA do ES buněk v kultuře
- selekce stabilně transfekovaných buněk
- přenos transfekovaných buněk do blastocysty mikroinjekcí
- přenos blastocysty do pseudobřezí myši
Přenosy genů do myší prostřednictvím embryonálních
kmenových (ES) buněk
Výsledek:
některá z mláďat budou obsahovat jednak
buňky odvozené z transfekovaných ES buněk a
jednak normálních buněk.
Myši představující směs dvou různých
buněčných typů ­ chimérické myši.
U některých mláďat mohou být buňky
odvozené z transfekovaných ES buněk
v zárodečné linii:
- jejich křížením se transfekovaný gen bude
přenášet na potomstvo jako stabilní znak
(transgenní myši).
- pokud byl normální gen pozměněn ve smyslu
úplné ztráty funkce, označují se tyto myši
jako "knockout ­ myši".
Souhrn technik používaných
při genetických manipulacích
s myšími ES buňkami
Biologické transfekční postupy
1. Transfekce virovými vektory
Vlastnosti retrovirových vektorů:
- velmi účinné, protože životní cyklus retrovirů zahrnuje zpětnou
transkripci a integraci virové DNA do genomu infikované buňky
- mají charakter plazmidů, do kterých byly klonovány určité
retrovirové sekvence
- studovaná DNA se začlení do virové sekvence daného plazmidu a
rekombinantní plazmidová DNA se izoluje z bakterií
Biologické transfekční postupy
Transfekce virovými vektory - princip:
- živočišné buňky pěstované v kultuře jsou transfekovány
retrovirovým vektorem obsahujícím žádanou DNA např.
metodou precipitace fosforečnanem vápenatým
- v buňkách, které DNA přijaly, se tvoří rekombinantní
retrovirové částice, které nesou cizorodou DNA a
pučením buňky opouštějí
-tyto rekombinantní virové částice se použijí pro infekci
žádaných buněk
- v infikovaných buňkách retroviry zajistí stabilní
integraci dané DNA do chromozomu tvorbou provirů
A. tumefaciens:
- bakterie, která vyvolává tvorbu nádorů na tělech rostlin
- přenáší Ti (,,tumor-inducing") plazmid do rostlinných buněk
- Ti plazmid se začleňuje do chromozomální DNA
Funkční elementy Ti plazmidu:
- oblast T, která se integruje do chromozomu rostlinné buňky
- oblast vir, která nese geny, jejichž produkty napomáhají přenosu
T oblasti
- pokud se do T-DNA začlení žádaná nukleotidová sekvence, dojde k
jejímu přenosu do rostlinných buněk
2. Transfekce rostlinných buněk zprostředkovaná Ti plazmidy
Agrobacterium tumefaciens
Biologické transfekční postupy
Transfekce rostlinných buněk Ti plazmidy
A. tumefaciens
Postup:
- začlenění žádaného úseku DNA do oblasti T plazmidu Ti
přenos rekombinantního plazmidu do A. tumefaciens
- infekce kultivovaných buněk touto bakterií
Výsledek:
- oblast T plazmidu včetně studované DNA se přenese do
rostlinných buněk, kde se začlení do chromozomální DNA
- z transgenních buněk lze regenerovat transgenní rostlinu
Přenos genů do rostlin
Výběr cílových buněk pro transfekci
- schopnost rozeznat a aktivovat promotor řídící
expresi exogenního genu
- účinný růst
- primární buňky versus transformovaná (nesmrtelná)
buněčná linie
Selekční systémy eukaryotických buněk
- podmínka izolace vzácných stabilních transfektantů
- původně založeny na obnovení porušených metabolických
drah v buňce (70. léta)
- např. mutantní buňky s inaktivní thymidin kinázou byly
transfekovány genem HSV-TK (herpes virus simplex TK)
a získaly tak schopnost růstu na médiu obsahujícím
aminopterin.
- následovala selekce transfektantů na médiu s
aminopterinem, ve kterém je znemožněna syntéza
thymidinu de novo ­ požadavek aktivní TK
- nevýhoda: nutnost inaktivace TK v cílových buňkách
Selekční systémy eukaryotických buněk
80. léta ­ objev dominantních selekčních markerů:
- není třeba používat mutantní buněčné linie, protože
byly objeveny dominantní selekční markery
- izolovány z E. coli:
xantin-guanin-fosforibozyltransferáza (gpt)
aminoglykozid-fosfotransferáza (neo)
hygromycin B-fosfotransferáza
puromycin-N-acetyl transferáza
Xantin-guanin- fosforibozyl transferáza - GPT
- katalyzuje syntézu GMP z xantinu nouzovou drahou
- za přítomnosti aminopterinu a kyseliny mykofenolové, kdy je
blokována syntéza GMP de novo savčími enzymy, je přežití
buňky závislé na integraci a expresi gpt
- kyselina mykofenolová specificky inhibuje inosinát
dehydrogenázu, tj. enzym, který katalyzuje přeměnu
inosinmonofosfátu na xantinmonofosfát (ten je potřeba pro
biosyntézu GMP)
- aminopterin inhibuje aktivitu dihydrofolát reduktázy, která
je nutná pro biosyntézu purinů a pyrimidinů
- tento blok lze uvolnit xantinem, pokud mají buňky k dispozici
funkční produkt genu gpt E. coli
Aminoglykozid-fosfotransferáza - Neo
- poskytuje hostitelským buňkám rezistenci na antibiotikum G418
(strukturně příbuzné neomycinu)
- pokud se do růstového média přidá G418 závisí přežití buněk na
stabilní integraci a expresi genu neo
- G418 narušuje funkci ribozomů a tak blokuje proteosyntézu
- bakteriální enzym aminoglykosid fosfotransferáza pozměňuje
G418 do netoxické formy
Další selekční markery
PAC (N-acetyl transferáza)
zdroj: Streptomyces alboniger
princip: poskytuje rezistenci na puromycin
HPH (hygromycin B aminoglykozid
fosfotransferáza)
zdroj: E. coli
princip: poskytuje rezistenci na hygromycin B
DHFR (dihydrofolát reduktáza) - mutantní
varianta
zdroj: myš
princip: kompetitivní inhibitor DHFRwt, poskytuje
rezistenci na metotrexát
Izolace přechodně transfekovaných buněk
- současná transfekce buněk žádaným plazmidem
(např. obsahujícím reportérský gen) a plazmidem
kódujícím povrchový protein
- buňky obvykle přijmou oba plazmidy
- transfekované buňky lze oddělit od
netransfekovaných např. magnetickými kuličkami
potaženými příslušnou protilátkou nebo
průtokovým cytometrem vybaveným rozdělovacím
zařízením ("cell sorter")
Izolace
transfektantů
Využití technologie přenosu DNA do buněk pro
studium funkce genů
1. Utišování genů pomocí RNA interference
(,,knock-down")
2. Vypínání genů pomocí homologní rekombinace
("knock-out")
3. Určování funkce genů vnášením jejich mutovaných
verzí (,,knock-in")
Další přístupy ke studiu funkce genů
­ zásahy do genové exprese
Genetické přístupy:
posílení nebo oslabení exprese
genu zásahem do jeho primární
struktury nebo do struktury
jeho regulačních oblastí
- přenos genů
- cílené mutace
Epigenetické přístupy:
změna úrovně exprese genu
zásahem bez zásahu do jeho
primární struktury
- ovlivnění struktury chromatinu
- zásah do metylace DNA
- ovlivnění pozdějších fází genové
exprese:
změna stability transkriptu,
ovlivnění translace,
ovlivnění funkce (aktivity) proteinu
Genetické přístupy
Změna struktury endogenů nebo regulačních oblastí:
- cílená mutageneze
Přenos cizorodých genů do buněk:
- transfekce
- infekce
- příprava transgenních organismů
- technologie ,,knock-out" a ,,knock-in"
Epigenetické přístupy: metylace DNA
Připojení metylové skupiny na C5 cytozinu: vznik 5-metylcytozinu
Donorem metylové skupiny je S-adenosyl-L-metionin, reakci katalyzují
DNA metyltransferázy
Metylace DNA
Frekvence výskytu a význam:
ˇ 5-metylcytozin tvoří 1-6% bazí DNA většiny eukaryot
ˇ v genomu obratlovců se 5-metylcytozin objevuje
především v dinukleotidech 5´-CpG-3´
ˇ 60-90% dinukleotidů CpG je v genomu obratlovců
metylovaných
ˇ dinukleotidy CpG nejsou zastoupeny v genomu rovnoměrně, ale
tvoří tzv. CpG ostrovy, které se objevují převážně v oblastech
promotorů
ˇ hypermetylace DNA v těchto oblastech způsobuje zastavení
transkripce příslušných genů
Dva mechanismy zastavení
transkripce metylací cytosinu
1. přímé znemožnění vazby transkripčních faktorů citlivých k
metylaci na cílové místo DNA (např. E2F, CREB, c-Myb, NFB)
2. proteiny vážoucí metylované CpG sekvence znemožní transkripci
transkripčními faktory, které nejsou citlivé k metylaci (MeCP1,
MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3)
Inhibitory metylace DNA
1. Nukleosidové analogy (5-azacytidin, zebularin): tvoří kovalentní
vazbu s DNA metyltransferázou a tak ji inhibují
2. Látky působící na enzymy zapojené do metabolismu S-
adenosylmetioninu (donor metylové skupiny):
- kompetitivní inhibitory AdoMet-dependentních
metyltransferáz
- inhibitory syntézy AdoMet (metotrexát)
3. Deriváty kyseliny 4-aminobenzoové (prokainamid, prokain) se
vážou na sekvence bohaté na GC a znemožňují tak vazbu
metyltransferázy na DNA
Omezují metylaci DNA a umožňují reaktivaci exprese genů.
Demetylační činidla se používají při léčbě některých nádorových
onemocnění ­ zvýšení exprese nádorových supresorů.
Hypermetylační činidla
S-adenosylmetionin
Zastavení nežádoucí genové exprese.
Acetylace histonů
ˇ přenos acetylové skupiny z acetylkoenzymu A na lysin
(Lys5, Lys12 nebo Lys16) histonu
ˇ úroveň acetylace histonu vyplývá ze směru vychýlení
rovnováhy histonových acetyltransferáz (HAT) a
histonových deacetyláz (HDAC)
Acetylace histonů má vliv na
strukturu chromatinu
ˇ acetylované histony usnadňují přístup transkripčních faktorů k DNA
­ spjaty s transkripčně aktivním chromatinem
ˇ odstraněním acetylové skupiny získá lyzin pozitivní náboj ­ umožněna
elektrostatická interakce mezi pozitivně nabitými histony a negativně
nabitou DNA (kompaktní chromatin neumožňuje transkripci)
Regulace acetylace histonů
U nádorových onemocnění je častá nadměrná aktivita HDAC
(umlčení nádorových supresorů)
Inhibitory HDAC (terapeutický potenciál):
ˇ deriváty kyseliny hydroxamové (trichostatin A, pyroxamid,
oxamftalin)
ˇ mastné kyseliny (butyrát sodný, fenylbutyrát)
ˇ cyklické peptidy (depsipeptid, apicidin)
ˇ benzamidy (MS-275)
Mechanismus účinku trichostatinu A ­ přímá vazba na HDAC:
inhibice HDAC)
U jiných inhibitorů HDAC není mechanismus účinku známý.
Regulace genové exprese
protismyslovými nukleovými kyselinami
Princip:
sekvenčně specifická hybridizace s následkem
eliminace určitého transkriptu a jeho translace
Různé varianty:
ˇ protismyslové oligonukleotidy
ˇ protismyslová RNA
ˇ ribozymy
ˇ DNAzymy
ˇ návnadové (,,decoy") oligonukleotidy
ˇ RNA interference
Protismyslové oligonukleotidy
PNA:
ˇ syntetický analog DNA
ˇ cukr-fosfátová kostra nahrazena
pseudopeptidovou kostrou složenou z monomerů
N-(2-aminoetyl) glycinu, ke kterým jsou připojeny
dusíkaté báze
ˇ odolnost k nukleázám a proteázám
ˇ vysoká specifita vazby k RNA
ˇ absence elektrického náboje:
- vysoká afinita k RNA
Sekvence DNA nebo peptidové nukleové kyseliny (PNA) dlouhé 6-30
nukleotidů, které do buněk pronikají endocytózou a vážou se na
komplementární mRNA: specifický inhibiční účinek na genovou expresi!
Protismyslové oligonukleotidy
2 mechanismy účinků po vazbě oligonukleotidů na
komplementární sekvenci mRNA:
1. Vazba na mRNA spouští její degradaci RNázou H
2. Zablokování translace: duplexy blokují sestavení
iniciačního komplexu translace
- účinek je reverzibilní
Protismyslová RNA
- přepis opačně orientovaných genů, které jsou do
buňky přeneseny expresními vektory transfekcí
- protismyslná RNA je komplementární přepisu
cílového endogenu a vytvoří s ním duplex (vliv
sekundární struktury)
- zablokování translace (trvalá a stabilní inhibice
exprese cílových genů)
Katalytické nukleové kyseliny
- Ribozymy a DNAzymy
- malé molekuly RNA nebo DNA, které jsou schopny
katalyzovat chemické reakce ovlivňující cukr-
fosfátovou kostru nukleové kyseliny
- pro zásahy do genové exprese jsou důležité ty z
nich, které mohou zajistit štěpení mRNA
- sekvenční specifita je dána sekvencemi, které
sousedí s katalytickým jádrem
Ribozym - funkce
- katalytická RNA
- různé enzymové aktivity, typické pro proteiny:
sestřih transkriptů, štěpení DNA, štěpení
amidových a peptidových vazeb, polymerace,
částečná replikace RNA, atd.
- metaloenzym, nutným kofaktorem je obvykle Mg2+
Ribozym - struktura
- jednořetězcová RNA s dvouřetězcovými úseky
- zahrnuje část pro rozeznání substrátu v blízkosti
5´konce a
- katalytické místo zodpovědné za vlastní
enzymovou aktivitu
Ribozym ­ mechanismus účinku
- rozeznání substrátu (párování bazí mezi sekvencemi
ribozymu a mRNA)
- štěpení mRNA
- uvolnění RNAzymu pro obdobnou reakci s jinou kopií
téže mRNA
- relativně nízké koncentrace RNAzymu postačují pro
degradaci nadbytku mRNA v buňce
- u dlouhých substrátů je účinnost degradace nižší
Ribozym ­ výhody a nevýhody
Výhody ve srovnání s proteiny:
- nižší pravděpodobnost indukce imunitní reakce
- nižší velikost - snadnější přenos do buněk (obvykle
prostřednictvím transformačních vektorů)
Nevýhody:
- nízká účinnost rozeznání substrátu
- nízká účinnost degradace dlouhých (terapeuticky
významných) substrátů
- nestabilita
Facilitátory
- speciální oligonukleotidy, které se vážou na substrátové RNA,
které sousedí s vazebným místem ribozymu (zabraňují
tvorbě sekundární struktury RNA v místě štěpení,
zpřístupňují jej ribozymu)
Ribozymy - využití
Nástroj genové terapie:
- perspektivní využití při léčbě nádorů (cílené ovlivnění
aktivity transkripčních faktorů, proteinových kináz,
adhezivních molekul, růstových faktorů, telomeráz,
atd.)
DNAzym (DNA enzym, deoxyribozym)
- katalytická DNA
- připraven uměle v laboratoři (rozdíl ve srovnání s přirozenými
ribozymy)
Struktura:
- jednořetězec DNA
- vazebná ramena dlouhá 7-8 nukleotidů
- katalytická doména složená z 15 nukleotidů
Enzymová aktivita:
- štěpí fosfodiesterové vazby mezi puriny a pyrimidiny v
molekule RNA
- odolnější k nukleázám ve srovnání s ribozymy
- nižší aktivita
Využití:
- podobně jako u RNAzymů: cílená degradace mRNA
Návnadové (,,decoy") oligonukleotidy
- krátké syntetické sekvence DNA nebo PNA
- odpovídají endogennímu cis-elementu v regulační oblasti genu,
jehož expresi mají ovlivnit
- napodobením vazebné sekvence pro transkripční faktor
vyvolávají kompetici mezi cis-elementem a návnadovým
oligonukleotidem: snížení vazby transkripčního faktoru na DNA,
inhibice jeho aktivity
Nevýhody:
- nežádoucí vedlejší účinky (interference s jinými proteiny)
RNA interference
- mechanismus umlčování genů
- jednořetězcová nebo dvouřetězcová RNA přenesená do buněk
nebo vytvořená v buňkách cíleně brání expresi cílové mRNA
- dvouřetězcová RNA je podstatně účinnější než jednořetězcová
- podstatou je enzymová (ATD-dependentní) degradace mRNA
nebo potlačení genové exprese na úrovni transkripce nebo
translace
RNA interference - mechanismus
- dvouřetězcové molekuly RNA jsou přeneseny do buněk a zde
rozeznány iniciačním enzymem - ribonukleázou ,,Dicer"
- štěpením RNA vznikají krátké fragmenty o velikosti 19-23
nukleotidů siRNA (,,small interfering RNA")
- siRNA se stávají součástí komplexu RISC (,,RNA-induced silencing
complex")
- RISC opatřený siRNA se zaměřuje na homologní mRNA a znemožní
její translaci některým z těchto mechanismů:
1. protein Argonaut komplexu RISC zajistí degradaci mRNA
2. vychytáním de novo DNA metyltransferáz (DNMT), histonových
deacetyláz (HDAC) a histonových metyltransferáz (HMT)
komplexem RISC dojde k modifikaci chromatinu a zastavení
transkripce daného genu
3. Dosud neznámým mechanismem může siRNA navázaná na RISC
zablokovat translaci
Ovlivnění genové exprese na úrovni
regulace aktivity proteinů
- přenosem protilátek do buněk
- přenosem nebo expresí dominantně negativních mutantů
Ovlivnění genové exprese na úrovni
regulace aktivity proteinů
Princip dominantní negativity:
Inhibice aktivity normálního funkčního proteinu přenosem jeho
defektních podjednotek
Obvyklý postup:
1. Do buněk se transfekcí přenese zkrácená varianta genu, jehož
funkci chceme eliminovat
2. Nadbytek mutantního proteinu způsobí inhibici jeho endogenní
funkční formy i za její přítomnosti (proto dominantní
negativita)
Příklad ­ inhibice transkripčních faktorů kontrolovaných hormony:
- poteiny disponují DNA-vazebnou doménou, transkripčně
aktivační doménou a doménou pro vazbu hormonu
- fungují ve formě dimerů
- za přítomnosti nadbytku zkrácených variant tohoto proteinu
lze dosáhnout účinné inhibice tvorby funkčních dimerů