Analýza genové exprese
Analýza genomu ­ genomika
Analýza transkriptomu ­ transkriptomika
Analýza proteinu - proteomika
Analýza transkripce
ˇ studium množství určitého transkriptu v daném vzorku a v
daném čase
ˇ studium transkripční aktivity daného genu
POZOR:
ˇ množství dané molekuly mRNA v dané buňce a v daném čase
závisí nejen na transkripční aktivitě, ale také stabilitě mRNA
ˇ množství mRNA nemusí korelovat s množstvím proteinu, který
kóduje
Northernový přenos
Princip:
- izolace mRNA
- elektroforéza v denaturujícím gelu
- přenos na membránu
- hybridizace se značenou sondou
Výsledek:
- zjištění přítomnosti specifické mRNA
- zjištění relativní molekulové hmotnosti mRNA
- zjištění relativní hladiny mRNA (po kalibraci s využitím
hybridizačního signálu pomocného genu o známé úrovni exprese)
Northernový přenos
Northernový přenos - nevýhody
ˇ neposkytuje údaje o absolutním množství dané
mRNA
ˇ nízká citlivost (nutnost izolace poměrně vysokých
množství RNA ­ obvykle alespoň 1 g polyA mRNA
nebo 10 g celkové RNA)
Northernový přenos - výhody
ˇ nízké riziko falešných artefaktů ve srovnání s
metodami založenými na PCR
ˇ umožňuje určení relativní velikosti transkriptu a
existenci různých transkriptů daného genu
(alternativní sestřih)
Test rezistence k RNáze
(,,RNase protection assay")
ˇ stanovení přítomnosti určité mRNA ve směsi různých molekul RNA
izolovaných z daného vzorku
ˇ značená sonda (protismyslná RNA) se specificky váže k hledané
mRNA
ˇ hybridizace probíhá v roztoku
ˇ RNáza degraduje všechny jednořetězcové molekuly mRNA
ˇ zviditelnění neštěpených hybridů gelovou elektroforézou a
autoradiografií
Příprava protismyslové RNA
- využití vektorů s opačně orientovanými promotory
Test rezistence k RNáze
(,,RNase protection assay")
Test rezistence k RNáze
(,,RNase protection assay")
Výhody:
ˇ vysoká citlivost a přesnost
ˇ toleruje částečnou degradaci vzorků RNA
Nevýhody:
ˇ neumožňuje určit velikost transkriptu (pohyblivost proužku v
gelu ovlivňuje velikost sondy)
ˇ pracnější příprava RNA sondy než u northernového přenosu
ˇ nutnost empirické optimalizace reakčních podmínek u nových
genů
Test rezistence k nukleáze S1
(,,S1 nuclease protection assay")
Postup:
ˇ obdoba ,,RNase protection assay"
ˇ jako sonda se používá jedno- nebo dvou-řetězcová DNA
ˇ příprava plazmidu nesoucího studovanou oblast s použitím systému
M13
ˇ protismyslová radioaktivní sonda hybridizuje s mRNA
ˇ jednořetězcové úseky jsou odstraněny nukleázou S1
ˇ velikost hybridu rezistentního k nukleáze je určena denaturační
polyakrylamidovou gelovou elektroforézou
RT-PCR
ˇ amplifikace specifické mRNA
ˇ vysoká citlivost: lze detegovat specifickou mRNA v
jediné buňce (výhodné pro detekci mRNA, které se v
buňkách vyskytují ve velmi nízkých koncentracích)
ˇ nevýhoda konvenční RT-PCR: kvantifikace (není
spolehlivá úměra mezi množstvím templátu a
množstvím amplifikátu)
RT-PCR
RT-PCR v reálném čase
ˇ cílem je sledování množství produktu reakce od
okamžiku jeho vzniku až po ukončení PCR
ˇ využití barviva, které fluoreskuje po navázání na
dvouřetězcovou DNA
ˇ ve speciálním přístroji, který funguje jako
termocykler a zároveň jako detektor fluorescence
lze monitorovat postup PCR v reálném čase
RT-PCR v reálném čase
Jednořetězcový templát: žádný signál
Vytvoření dostatečného množství dvouřetězcového amplifikátu: signál
zaznamenán
Extrapolací vzniklé křivky zpět k nule lze určit počet cyklů nutných pro
vytvoření detekovatelného množství produktu
Tato hodnota závisí na prvotním množství templátu
RT-PCR v reálném čase
Experimentální požadavky: je třeba zajistit, aby množství
vstupního materiálu (počet buněk, celkové množství mRNA) bylo
vždy stejné.
Standardizace reakcí pomocí paralelní RT-PCR pro amplifikaci
pomocného genu, který se exprimuje konstitutivně.
RT-PCR v reílném čase se rovněž používá pro kvantifikaci
určitých sekvencí DNA pro identifikaci specifických změn v
genomu (diagnostický význam v medicíně).
Hybridizace in situ
ˇ současné využití hybridizace a mikroskopie
ˇ hledaná sekvence RNA (nebo DNA) je imobilizována
uvnitř buňky v mikroskopickém preparátu a vizualizována
prostřednictvím sondy
ˇ identifikace buněk, které tvoří specifickou mRNA (nebo
DNA)
ˇ identifikace buněk infikovaných viry
Nevýhoda: obtížná kvantifikace
Test prodloužení primeru
(,,Primer extension assay")
ˇ přesné mapování 5´konce mRNA
ˇ na rozdíl od 3´konce není 5´konec mRNA vždy
převeden do cDNA (degradace templátu, přítomnost
sekundárních struktur, přítomnost proteinů
navázaných na mRNA, zpětná transkripce neproběhne
až na konec templátu)
ˇ možnost přesné identifikace začátku transkripce
Test prodloužení primeru
(,,Primer extension assay")
Postup:
ˇ příprava značeného primeru, který je komplementární k sekvenci
mRNA vzdálené 50-150 nukleotidů po proudu transkripce od
předpokládaného 5´konce
ˇ izolace celkové RNA nebo mRNA ze studovaných buněk
ˇ hybridizace primeru s cílovou molekulou mRNA
ˇ prodloužení primeru zpětnou transkripcí
ˇ na konci templátu se polymerace automaticky zastaví
ˇ analýza radioaktivní cDNA denaturační polyakrylamidovou
elektroforézou
ˇ podle pohyblivosti produktu zpětné transkripce a kombinací se
sekvencováním lze určit místo počátku transkripce
Test prodloužení primeru
(,,Primer extension assay")
Výhody:
ˇ rychlost a jednoduchost
ˇ požadována pouze mRNA a radioaktivně značený primer
komplementární k sekvenci uvnitř daného genu
Nevýhody:
ˇ může být obtížné nalézt dobře fungující primer pro
dosud nepopsaný gen
ˇ přílišné pozadí může znemožnit přesnou lokalizaci místa
startu
ˇ sekundární struktury mRNA ztěžují zpětnou transkripci
Srovnání transkriptomů
ˇ identifikace genů exprimovaných v jednom
organismu (tkáni) a ne v jiném
ˇ identifikace genů exprimovaných za různých
podmínek
ˇ poskytuje klinicky významné informace
(identifikace genů spojených s genetickými
chorobami)
Diferenciální skrínink genové knihovny
(,,Differential screening")
ˇ nejjednodušší metoda identifikace genů, které se
exprimují s odlišnou účinností
ˇ příprava dvou identických kopií genové knihovny na
filtrech
ˇ příprava dvou typů značených sond v podobě cDNA
připravených z mRNA dvou různých vzorků
ˇ oddělená hybridizace genové knihovny se sondami
ˇ klony, které jsou pozitivní po hybridizaci s jednou,
ale ne s druhou sondou, nesou odlišně exprimované
geny
Diferenciální skrínink genové knihovny
(,,Differential screening")
Diferenciální skrínink genové knihovny
(,,Differential screening")
Nevýhoda:
-postup předpokládá, že v jednom vzorku daný
transkript není vůbec přítomen (obvykle však exprese
genů není zcela vypnuta)
Subtraktivní hybridizace
ˇ ze sondy jsou odstraněny společné sekvence
ˇ hledáme transkripty přítomné v jednom vzorku (,,tester") a
nepřítomné v druhém vzorku (,,driver")
Postup:
ˇ izolace mRNA z obou vzorků a příprava cDNA
ˇ cDNA ,,driver" je označena biotinem
ˇ smíchání cDNA ,,tester" s nadbytkem cDNA ,,driver"
ˇ denaturace, renaturace
ˇ molekuly cDNA ,,tester", která reprezentuje mRNA přítomné v
obou vzorcích, bude tvořit hybridy s cDNA ,,driver"
ˇ odstranění hybridů driver/tester a driver/driver (streptavidin)
ˇ sonda je tak obohacena o cDNA reprezentující transkripty
přítomné jen ve vzorku ,,tester"
ˇ skrínink genové knihovny nebo klonování a vytvoření
subtraktivní knihovny cDNA
Nevýhoda subtraktivní hybridizace
- vzácné transkripty nemusí poskytnout dostatečně silný signál
- řešení: vytvoření subtraktivní knihovny cDNA
Subtraktivní knihovna cDNA:
- cDNA testeru se prostřednictvím adaptorů vkládá ligací do vektoru
- vytvoření knihovny bakteriálních klonů
- systematický skrínink analýzou všech klonů
Nevýhoda: nutnost relativně vysokých množství mRNA
Analýza reprezentativních rozdílů
(,,Representational difference analysis" ­ RDA)
Princip:
- vzorky cDNA nebo genomové DNA fragmentované
restriktázami, které pocházejí ze srovnávaných vzorků
se amplifikují PCR
- po smísení, denaturaci a renaturaci se využívá toho, že
hledané molekuly (přítomné v jednom a ne ve druhém
vzorku) vzájemně nehybridizují
Využití:
- hledání genů, které zodpovídají za dědičné poruchy
- hledání diferenciálně exprimovaných genů
Analýza reprezentativních rozdílů
(,,Representational difference analysis" ­ RDA)
ˇ příprava cDNA vzorků ,,driver" a ,,tester"
ˇ ligace linkerů na konce cDNA a jejich využití pro amplifikaci PCR
ˇ odstranění linkerů
ˇ jiná dvojice linkerů se připojí k produktu PCR testeru, ale ne
driveru
ˇ smísení molekul cDNA testeru a driveru (driver je v nadbytku)
ˇ denaturace, renaturace
ˇ unikátní sekvence testeru nebudou tvořit hybridy s řetězci
driveru, ale jen testeru (komplexy tester/tester)
ˇ PCR budou amplifikovány pouze komplexy tester/tester
ˇ komplexy driver/driver nebudou amplifikovány (absence primerů)
ˇ komplexy tester/driver mají nespárované konce, které mohou být
odstraněny nukleázou (nebudou amplifikovány)
Postup:
Diferenciální display
ˇ metoda srovnávající dvě populace cDNA
ˇ založena na PCR
ˇ jeden primer se váže na sekvenci poly-A
ˇ druhý primer se váže náhodně
ˇ PCR probíhá při velmi nízké připojovací teplotě
ˇ dojde k amplifikaci určité subpopulace molekul
cDNA
ˇ tato subpopulace je natolik malá, že ji lze rozdělit
na polyakrylamidovém gelu
ˇ stejné primery se použijí k amplifikaci DNA ze
srovnávaných vzorků
ˇ metoda neusnadňuje analýzu odlišně exprimovaných
genů (nutno zkoušet různé sady primerů)
Metody založené na čipech
Zodpovídají globálnější otázky typu:
Jaké je celkové spektrum genů, které se exprimují
nebo neexprimují za určitých podmínek?
Pro analýzu většího počtu genů není vhodný northernový
přenos ani RT-PCR.
Microarrays ­ DNA čipy
ˇ základem jsou syntetické oligonukleotidy nebo
produkty PCR, které odpovídají velkému počtu (nebo
všem) genům daného organismu
ˇ robotem se tyto fragmenty DNA kovalentně připojí na
speciální skleněnou destičku v podobě uspořádaných
teček
ˇ hybridizace se značenou DNA izolovanou z daného
vzorku:
- genomová DNA (genomové studie)
- cDNA (expresní studie)
ˇ izolace mRNA ze dvou různých vzorků (kontrolního a testovaného)
ˇ vytvoření cDNA zpětnou transkripcí
ˇ označení cDNA z jednoho vzorku červenou fluorescenční barvou a druhého
vzorku zelenou fluorescenční barvou
ˇ směs obou značených cDNA (ve stejném poměru) je nanesena na sklíčko s 384
vzorky DNA a výsledek hybridizace je analyzován fluorescenční mikroskopií:
ˇ žlutý signál: cDNA obou vzorků se vážou proporcionálně, daný gen se
exprimuje v obou vzorcích ekvivalentně
ˇ červený signál: preferenčně se váže cDNA prvního vzorku
ˇ zelený signál: preferenčně se váže cDNA druhého vzorku
Studium transkripce reportérskými geny
Reportérský systém: uměle vytvořený plazmidový konstrukt, který
obsahuje sekvence DNA odvozené od specifického genu (včetně
promotoru a potenciálních regulačních signálů) připojené k jinému
genu, který kóduje snadno detegovatelný produkt
Princip: po vnesení reportérského konstruktu do organismu, lze podle
míry exprese reportérského genu usuzovat na míru exprese genu,
jehož promotorové sekvence jsou reportéru předřazeny
Výhoda: studium změn aktivity regulátorů transkripce např. v průběhu
diferenciace nebo při vystavení různým podmínkám
Běžné reportérské systémy
ˇ Chloramfenikol acetyl transferáza (CAT)
ˇ Luciferáza (luc)
ˇ -galaktozidáza
ˇ Lidský růstový hormon (hGH)
ˇ Zeleně fluoreskující protein (GFP)
ˇ enzym katalyzuje přenos
acetylové skupiny z acetyl-
CoA na chloramfenikol
ˇ test aktivity založen na
radiochemické detekci
produktu reakce
Chloramfenikol acetyl transferáza (CAT)
Princip:
- fragment eukaryotické DNA se umístí proti proudu transkripce od
genu CAT
- vzniklý plasmid se přenese transfekcí do eukaryotické buňky
- po určitém čase nutném pro expresi transfekovaného genu se měří
aktivita CAT
- pokud je test proveden správně - je míra aktivity CAT úměrná míře
transkripce transfekovaného konstruktu
- zaváděním mutací do testované promotorové oblasti a měřením CAT
aktivity v transfekovaných buňkách lze definovat regulační
sekvence v DNA
Výhody: vysoká citlivost, reprodukovatelnost, absence genu CAT v
savčích buňkách
ˇ test aktivity založen na luminiscenci (produkci světla)
ˇ katalyzovaná reakce:
ATP + luciferin + O2  AMP + oxyluciferin + PPi + světlo (560 nm)
Výhody:
- vysoká citlivost (citlivější než CAT)
- nulové pozadí v savčích buňkách (gen je izolován ze světlušek)
- není třeba pracovat s radioaktivními materiály
- velký rozsah linearity
- pufr používaný pro lýzi buněk je kompatibilní s jinými testy (CAT,
-gal)
Luciferáza (luc)
test založen na spektrofotometrické detekci
barevného produktu reakce
obvyklé využití: vnitřní reference při
transfekčních experimentech
Princip: k transfekci buněk se použije plasmid s
eukaryotickým promotorem spojeným s genem
CAT nebo luc zároveň s malým množstvím
plazmidu nesoucím gen -gal spojený se silným
konstitutivním promotorem
ˇ v extraktech transfekovaných buněk se
stanoví aktivita -gal a CAT (Luc)
ˇ stanovením podílu aktivity CAT (Luc) : -gal
se údaje o expresi normalizují
Výhody: bezpečnost, levnost
-galaktozidáza
Lidský růstový hormon (hGH)
ˇ test založen na radioimunologické detekci produktu
reakce
ˇ výhoda: jedná se o sekretovaný protein, není třeba
lyzovat buňky
autofluorescence: protein nevyžaduje žádné
exogenní kofaktory ani substráty
ˇ izolován z buněk medůzy Aeguorea victoria
Výhody:
- možno měřit v intaktních buňkách
- vysoká stabilita proteinu
Nevýhody: fluorescence se neamplifikuje,
podmínkou detekce je použití silných promotorů
Běžné použití: fúze s jinými proteiny, sledování
nitrobuněčné lokalizace, transportu a dalšího
osudu označeného proteinu
Zeleně fluoreskující protein (GFP)
Využití reportérských systémů
ˇ sledování aktivity transkripčních faktorů v
průběhu diferenciace nebo za různých
kultivačních podmínek (stabilní transfekce)
ˇ transkripčně aktivační testy (přechodná
transfekce): determinace regulátorů
transkripce, vazebných míst na DNA, atd.
Analýza regulačních elementů v sekvenci
DNA a proteinů vážoucích DNA
ˇ přesná lokalizace promotoru a dalších sekvencí DNA,
které jsou zapojeny do regulace transkripce tím, že
pro ně zajišťují vazebná místa
ˇ analýza interakcí DNA-protein
Metody:
ˇ kvasinkový jednohybridový systém
ˇ DNaseI footprinting
ˇ gelová retardační analýza
Kvasinkový jednohybridový systém
Účel:
ˇ identifikace proteinů, které interagují s
definovanou sekvencí DNA
ˇ lokalizace oblastí DNA, které interagují se
známým transkripčním faktorem
Kvasinkový jednohybridový systém
Postup:
ˇ začlenění testované sekvence DNA (návnada ­ ,,bait")
v tandemových kopiích do vektoru proti proudu
transkripce od reportérského genu
ˇ začlenění konstruktu do kvasinkového genomu
ˇ za nepřítomnosti transkripčního faktoru vážoucího
návnadu nebude reportér exprimován
ˇ po transformaci tohoto kvasinkového kmene expresní
knihovnou cDNA bude reportér aktivován v těch
klonech, které exprimují příslušný transkripční
faktor
Využití možnosti kooperace aktivační domény
a DNA vážoucí domény z různých proteinů
Transkripční faktory obvykle obsahují 2 oddělitelné a
nezávislé domény:
ˇ doménu zodpovědnou za vazbu na DNA
ˇ transkripčně aktivační doménu
Proteinové chiméry obsahující tyto domény odvozené z
různých proteinů jsou funkční:
ˇ nahrazením DNA-vážoucí domény proteinu GAL4
jinou doménou pro vazbu na DNA vzniká chiméra
aktivující transkripci jiné sady genů
Postup:
ˇ příprava cDNA s použitím speciálního vektoru, který
kóduje aktivační doménu transkripčního faktoru GAL4
ˇ geny začleněné do tohoto vektoru budou v
transformovaných buňkách exprimovány jako proteinové
chiméry s aktivační doménou GAL4
ˇ reportér bude aktivován pokud vzniklý protein disponuje
příslušnou DNA-vazebnou doménou
Výhoda:
ˇ tento systém může odhalit větší množství proteinů
vážoucích DNA (nejen transkripční faktory)
Stopování DNázou I
(,,DNase I footprinting")
Účel:
ˇ identifikace promotorových sekvencí, na které se
váže daný transkripční faktor
Princip:
ˇ značená DNA je chráněna proteinem před působením
nukleáz
ˇ místo vazby proteinu na DNA je lokalizováno na
gelové elektroforéze jako stopa - chybějící fragment
Stopování DNázou I
(,,DNase I footprinting")
Postup:
ˇ izolace jader z buněk
ˇ purifikace jaderných proteinů
ˇ směs nebo jeden z jaderných proteinů se smíchá s
testovaným značeným fragmentem DNA
ˇ vystavení směsi působení DNázyI tak, aby došlo k
částečnému (náhodnému) štěpení DNA
ˇ elektroforéza fragmentů
ˇ identifikace neštěpených (tj. navázaným proteinem
chráněných) oblastí DNA
Stopování DNázou I
(,,DNase I footprinting")
Výhoda:
ˇ přesná lokalizace místa dotyku mezi proteinem a
DNA na úrovni jednotlivých nukleotidů
ˇ lze provádět i ve variantě in vivo
Gelová retardační analýza
Účel:
ˇ Určení sekvence DNA, která je nutná pro vazbu daného
proteinu
Princip:
ˇ fragment značené DNA obsahující vazebné místo
(sonda) je inkubován s příslušným proteinem
ˇ komplexy protein-DNA se oddělí od nenavázané sondy
elektroforézou v nedenaturačním polyakrylamidovém
gelu
ˇ navázaný protein zpomaluje pohyb sondy gelem
Gelová retardační analýza
Gelová retardační analýza
Výhody:
ˇ při absenci purifikovaného proteinu lze použít jaderné
extrakty (specifitu reakce je třeba ověřit protilátkou
-,,supershift")
ˇ lze využít pro analýzu více-proteinových komplexů
ˇ lze využít pro stanovení vazebných parametrů a
relativní afinity proteinu k vazebnému místu
specifická odpověď na zvýšenou dávku proteinu
- přidání ,,studené" neznačené sondy: kompetice se
značenou sondou ­ slabší signál
- přidání protilátky: ,,supershift"
Ověření specifity reakce protein ­ DNA