Studium přítomnosti proteinů v buňkách
(analýza proteomu)
Metody pro stanovení fyzické přítomnosti proteinů:
ˇ polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE)
ˇ westernový přenos
ˇ imunoprecipitace
ˇ imunohistochemie
ˇ izoelektrická fokusace
ˇ dvourozměrná elektroforéza v polyakrylamidovém
gelu
ˇ chromatografie
ˇ fluorescenční a elektronová mikroskopie
ˇ průtoková cytometrie
Elektroforetické techniky
ˇ založeny na schopnosti pohybu nabitých molekul v
elektrickém poli
ˇ proteiny se obvykle rozdělují polyakrylamidovou
gelovou elektroforézou
ˇ polymerovaný gel se vloží mezi dvě nádoby naplněné
pufrem, do kterých se ponoří elektrody
ˇ u deskové varianty se vzorky nanesou do jamek na
horní straně gelu
ˇ používají se alkalické pufry, které proteinům udílejí
negativní náboj - v elektrickém poli pohyb směrem
k anodě
Faktory ovlivňující pohyblivost proteinů v gelu
ˇ velikost: se vzrůstající velikostí molekuly se snižuje
pohyblivost proteinů v gelu (efekt molekulárního síta)
ˇ tvar: globulární proteiny se pohybují rychleji než vláknité
ˇ hustota náboje (náboj/jednotka hmoty): čím vyšší hustota
náboje tím vyšší pohyblivost v gelu
ˇ koncentrace akrylamidu: se vzrůstající koncentrací
pohyblivost klesá
SDS-polyakrylamidová gelová elektroforéza
(SDS-PAGE)
ˇ proteiny zaujímají různé tvary a disponují různými
náboji (na rozdíl od molekul DNA, které jsou
uniformní z hlediska tvaru a rozdělení náboje):
ˇ pro separaci proteinů se běžně používá denaturační
varianta PAGE zvaná SDS-PAGE
ˇ proteiny se rozpouští ve roztoku obsahujícím
negativně nabité molekuly SDS
ˇ disulfidové vazby se eliminují redukčním činidlem
(-merkaptoetanolem)
ˇ denaturace proteinů je dokončena varem
SDS -polyakrylamidová gelová elektroforéza
(SDS-PAGE)
Důsledky vazby SDS na molekuly proteinu:
ˇ elektrostatické odpuzování molekul SDS způsobí natažení proteinu
(denaturaci) a eliminuje se tak vliv tvaru proteinu na pohyblivost
ˇ počet molekul SDS navázaných na protein je zhruba úměrný jeho
molekulové hmotnosti. Proto má každý protein, bez ohledu na svou
velikost, ekvivalentní hustotu náboje.
ˇ větším proteinům bude kladen v gelu větší odpor a jejich pohyb
bude pomalejší (efekt molekulárního síta).
Proteiny se při SDS-PAGE separují pouze podle jediné vlastnosti:
molekulové hmotnosti.
Zviditelnění proteinů separovaných PAGE
- nespecificky: obarvení všech proteinů ve vzorku proteinovými
barvivy
- specificky: westernový přenos (detekce specifických proteinů
protilátkami)
Nespecifické barvení proteinů v gelech:
- stříbro, ,,coomassie brilliant blue"
Specifické barvení proteinů při westernovém přenosu:
- přenos rozdělených proteinů z gelu na pevný filtr (elektroblotting)
- navázání protilátky na příslušný antigen při promývání filtru
v roztoku specifické primární protilátky (protilátka musí rozeznat
lineární epitop ­ protein je denaturován)
- zviditelnění protilátky na filtru např. radioaktivní sondou nebo
sekundární protilátkou konjugovanou s určitým enzymem
Zviditelnění proteinů westernovým přenosem
Imunoprecipitace
- technika izolace specifických proteinů z proteinových směsí
prostřednictvím protilátek
Obvyklý postup:
- označení buněčných proteinů inkubací buněk za přítomnosti
radioaktivně značených aminokyselin (není nutné, pokud jsou k
dispozici jiné metody pro detekci vysrážených a od protilátek
oddělených proteinů)
- lýze buněk
- inkubace buněčných extraktů, které obsahují značené proteiny
s protilátkou specifickou pro cílový protein
- vytvořené komplexy se oddělí od zbytku extraktů
prostřednictvím kuliček vážoucích imunoglobuliny
- varem se cílové proteiny oddělí od imunoglobulinů a kuliček
- elektroforéza, autoradiografie (westernový přenos)
Použití imunoprecipitace pro studium
meziproteinových interakcí
- technika kombinující imunoprecipitaci za nativních
podmínek a westernový přenos
Obvyklý postup:
- precipitace cílového proteinu z buněčných extraktů
protilátkou za takových podmínek, které neničí vazby mezi
proteiny
- cílový protein bude precipitován v komplexu se svými
přirozenými partnery
- purifikované komplexy se denaturují a podrobí SDS-PAGE
- přítomnost současně precipitovaných partnerských
proteinů se stanoví westernovým přenosem
Imunohistochemie
ˇ určení, ve kterých buňkách je daný protein přítomen (obdoba
hybridizace nukleových kyselin in situ)
ˇ určení, v které části buňky je daný protein přítomen (membránový,
cytoplazmatický, jaderný) ­ lokalizace naznačuje funkci
Izoelektrická fokusace
ˇ varianta elektroforézy, kde podpůrným médiem je polyakrylamidový
gel obsahující směs amfolytů
Amfolyty:
ˇ polymery o nízké molekulové hmotnosti, které mají různé poměry
pozitivně nabitých aminoskupin a negativně nabitých karboxylových
skupin
ˇ při elektroforéze se amfolyty rovnoměrně rozdělují v gelu podle
náboje a tak v něm vytvářejí gradient pH
Princip:
ˇ proteiny se pohybují gelem a jsou vystaveny gradientu pH
ˇ změnou pH se mění iontový náboj, který proteiny nesou
ˇ protein se dostane do oblasti takového pH, při kterém nemá žádný
náboj (je v izoelektrickém bodu) a jeho pohyb se zastaví
Výhoda:
ˇ protein je soustředěn do velmi ostrého proužku
Dvourozměrná elektroforéza v
polyakrylamidovém gelu
- pro dělení komplexních směsí proteinů, které nelze řádně rozdělit
jednorozměrnou elektroforézou
- možno srovnat úplný proteom v buňkách vystavených různým
podmínkám, v buňkách zdravých a nemocných, zjistit změny proteomu v
průběhu diferenciace, apod.
Obvyklý postup:
- nativní proteiny se dělí v úzkém pásu gelu podle elektrického náboje
izoelektrickou fokusací
- pruh gelu s proteiny se umístí na desku gelu a zapojí se elektrické
pole jako u SDS-PAGE ve směru kolmém ke směru fokusace
- každý protein má na ploše gelu jedinečné místo
Výhoda: vysoká rozlišovací schopnost - více než 1000 proteinů/gel
Dvourozměrná elektroforéza proteinů
Sloupcová chromatografie
Obvyklý postup:
- směs proteinů v roztoku se pomalu nalévá na válcovou kolonu
naplněnou propustnou pevnou matricí ponořenou do rozpouštědla
- kolona se promývá
- různé proteiny mají různou míru afinity s náplní kolony a proto je lze
odděleně sbírat při výtoku z kolony
- podle typu náplně můžeme proteiny dělit např. podle velikosti nebo
podle schopnosti vázat se na určité chemické skupiny náplně
Tři druhy sloupcové chromatografie
- iontoměničová: podle náboje, vazba mezi proteinem a náplní
kolony závisí na pH a iontové síle roztoku
- gelová: podle velikosti
- afinitní: náplň je opatřena molekulami, které specificky
interagují s cílovým proteinem (např. protilátka/antigen,
enzym/substrát)
Tři druhy sloupcové chromatografie
Proteomika
ˇ určuje úplný profil všech proteinů,
které daný organismus (buňka) vytváří
za definovaných podmínek
ˇ na rozdíl od genomu, který se neliší v
buňkách téhož organismu, je proteom
proměnlivý podle vnějších a vnitřních
faktorů
Proteomické přístupy
- dvourozměrná elektroforéza
- definování proteinů rozdělených na gelu (určení
sekvence aminokyselin, westernový přenos)
nebo
- štěpení eluovaných proteinů proteolytickým enzymem a
stanovení molekulové hmotnosti vzniklých peptidů
hmotnostní spektrometrií, srovnání hmotnostních
spekter s databázemi ­ identifikace proteinu
Průtoková cytometrie
Co dokáže?
ˇ spočítat buňky v suspenzi
ˇ rozlišit živé buňky od mrtvých
ˇ vyhodnotit více než 100 buněk za 1 minutu
ˇ zhodnotit míru emitované fluorescence
ˇ frakcionovat buňky podle určitých vlastností, které
korelují s mírou fluorescence
Průtoková cytometrie
Účel: Studium vlastností individuálních buněk v
buněčné populaci
ˇ míra přítomnosti určitých antigenů (diferenciace)
ˇ míra přítomnosti DNA (buněčný cyklus, apoptóza)
ˇ velikost buněk, přítomnost granulí v cytoplazmě
(determinace buněčných typů ve směsích buněk)
ˇ možno využít k frakcionaci buněk dle určitých
vlastností (FACS - Fluorescence-Activated Cell
Sorter)
Průtoková cytometrie
Princip: Počítačové zpracování míry fluorescence
jednotlivých buněk
Předpoklad: Míra fluorescence odpovídá sledovanému
parametru (antigen, DNA...)
Pojmy:
,,Flow cytometry" - měření určité vlastnosti buněk v průběhu
jejich toku přístrojem
,,Flow sorting" (Fluorescence-activated cell sorting FACS)
oddělování buněk podle jejich vlastností zjištěných v
průběhu průtokové cytometrie
FACS není totéž jako průtoková cytometrie (termín
označuje jen separaci buněk, ne analýzu)
Průtoková cytometrie
Postup:
ˇ koncentrovaná suspenze buněk je opatřena fluorescenční
značkou specifickou pro cílovou molekulu (pro DNA -
propidium jodid, pro protein - fluoreskující protilátka)
ˇ buněčná suspenze je rozdělena na malé kapičky (každá z
nich obsahuje jednu buňku) ultrazvukem
ˇ jednotlivé kapičky jsou ozářeny laserovým paprskem -
dojde k excitaci fluorescenční značky a emisi
fluorescence
ˇ měření míry fluorescence pro každou buňku (určuje míru
přítomnosti cílové molekuly)
ˇ měření míry rozptylu světla pro každou buňku (určuje míru
granulace cytoplazmy, velikost a tvar buňky)
Frakcionace buněk - FACS
Princip:
ˇ podle míry fluorescence je každé kapičce s
jednotlivou buňkou udělen proporcionální elektrický
náboj
ˇ kapičky procházejí prostorem mezi dvěma
elektrodami a dochází k jejich frakcionaci podle
náboje
Výhoda:
ˇ buňky nejsou průtokovou cytometrií poškozeny -
udržují si životaschopnost
ˇ buňky nejsou kontaminovány - lze je dále kultivovat
Využití průtokové cytometrie pro analýzu
buněčného cyklu
Princip:
ˇ měření obsahu DNA jednotlivých buněk, který se v
průběhu cyklu periodicky mění
Postup:
ˇ obarvení DNA fluorescenčním barvivem - propidium
jodidem
ˇ měření míry fluorescence emitované jednotlivými
buňkami
ˇ počítačové zpracování dat a grafické vyhodnocení
Protilátky
- proteiny tvořené lymfoidní tkání jako reakce na
přítomnost cizorodého materiálu - antigenů
- vysoká specificita
- jedna protilátka může rozlišit polypeptidy lišící se
jedinou aminokyselinou nebo dokonce jedinou
modifikaci dané aminokyseliny (např. fosforylaci)
Příprava polyklonálních protilátek
- opakovaná injekce antigenu lab. zvířeti (králík, koza)
- po několika týdnech se zvíře utratí a odebere se mu krev
- z krve se odstraní buňky a srážlivé faktory - antisérum
- test titru a čistoty imunoglobulinů
Nevýhody:
- tvorba různých Ig proti danému antigenu (polyvalence)
- Ig se chemicky navzájem podobají, nelze získat čistou frakci
daného Ig
- množství získané protilátky je omezené (celý postup nutno
opakovat)
Monoklonální protilátky
- produkt jednoho klonu B lymfocytů, který je chemicky
a funkčně homogenní
- B lymfocyty izolované z laboratorních živočichů nelze
kultivovat in vitro
Myelomové buňky:
- maligní buňky
- možnost kultivace in vitro
- vysoká schopnost tvorby protilátek
- protilátky nejsou specifické pro určitý antigen
- vznikají maligní transformací normálního lymfocytu
Příprava monoklonálních protilátek
Milstein a Köhler 1975:
- provedli fúzi normálních lymfocytů produkujících protilátky s
maligní myelomovou buňkou
- získali hybridní buňky (hybridomy):
- možnost kultivace in vitro
- vysoká schopnost tvorby jediné (monoklonální) protilátky
- protilátka svou specifitou odpovídá produktu normálního
lymfocytu použitého k fúzi
Příprava monoklonálních protilátek
Postup:
- antigen je injekcí přenesen do laboratorní myši a vyvolá proliferaci
specifických protilátkotvorných buněk
- z utraceného zvířete je vyjmuta slezina
- získané lymfocyty se použijí k fúzi s maligními myelomovými
buňkami
- hybridní buňky získávají nesmrtelnost z myelomové buňky a
schopnost tvorby specifické protilátky z lymfocytu
- hybridní buňky se selektují od nefúzovaných buněk na základě
schopnosti růst v selekčním médiu HAT
- skrínink hybridů podle schopnosti tvorby specifické protilátky
- kultivace žádaných hybridů v kultuře nebo jako nádor v lab. zvířeti
- získání neomezeného množství čisté protilátky
Příprava monoklonálních protilátek
Princip selekce hybridů:
Médium HAT
- obsahuje hypoxantin, aminopterin, tymidin
- umožňuje růst jen buňkám s funkční hypoxantin-guanin
fosforibozyl transferázou (HGPRT)
- linie myelomových buněk používaných k fúzi je HGPRT-
Studium interakcí protein-protein
ˇ Dvouhybridní systém
ˇ Ko-imunoprecipitace
ˇ Knihovna ,,Phage display"
ˇ Proteinová ,,microarray"
Interaktom
ˇ soubor všech meziproteinových
interakcí v dané buňce nebo
organismu
ˇ celkový skrínink interaktomu
umožňuje dvouhybridní systém
nebo proteinová ,,microarray"
Dvouhybridní systém
ˇ využívá fúze testovaných proteinů s dvěma oddělenými
doménami transkripčního aktivátoru
ˇ transkripční faktory mají často modulární strukturu: doménu
pro vazbu na DNA (DBD) a aktivační doménu (AD)
ˇ interakce obou domén vede k aktivaci transkripce (kovalentní
propojení domén není nutné)
Dvouhybridní systém - princip
ˇ DBD doména je spojena fúzí s proteinem X a AD doména s
proteinem Y
ˇ ,,návnada" (,,bait"): proteinová chiméra obsahující doménu pro
specifickou vazbu na DNA spojenou se studovaným proteinem
(DBD-X)
ˇ ,,dravec" (,,prey"): proteinová chiméra spojující partnerský
protein s aktivační doménou (AD-Y)
ˇ v kvasinkových buňkách se interakce testovaných proteinů
projeví aktivací reportérského genu, který je stabilně začleněn
do genomu
Význam metody: stanovení interakcí mezi dvěma proteiny
Interakce mezi proteiny někdy podstatně závisí na
posttranslačních modifikacích, které v kvasinkových
buňkách nenastávají
V roce 1995 připraven speciální
kvasinkový kmen, který
exprimuje savčí tyrosinovou
kinázu Lck
Meziproteinové interakce někdy
závisí na přítomnosti dalších faktorů
Trojhybridní systém
Slouží k identifikaci proteinů, jejichž interakci zprostředkovává RNA
Knihovna ,,Phage display"
ˇ fragmenty DNA se začlení do klonovacího místa
uvnitř genu, který kóduje jeden z povrchových
proteinů vláknitého fága M13
ˇ fúzovaný gen kóduje proteinovou chiméru, která
bude včleněna do fágové hlavy a to takovým
způsobem, že cizí protein bude vystaven na
povrchu fágové částice
ˇ přenesení knihovny ,,phage display" do zkumavky
nebo mikrotitrační destičky potažené ligandem,
protilátkou, receptorem nebo jiným testovaným
proteinem
ˇ odmytí nenavázaného fága
ˇ lze testovat velmi vysoké počty fágových částic a
hledat interagující klony
Knihovna ,,Phage display"
ˇ fragmenty DNA se začlení
do klonovacího místa uvnitř
genu, který kóduje jeden z
povrchových proteinů
vláknitého fága M13
ˇ fúzovaný gen kóduje
proteinovou chiméru, která
bude včleněna do fágové
hlavy a to takovým
způsobem, že cizí protein
bude vystaven na povrchu
fágové částice
Knihovna ,,Phage display"
ˇ přenesení knihovny ,,phage
display" do zkumavky nebo
mikrotitrační destičky
potažené ligandem,
protilátkou, receptorem
nebo jiným testovaným
proteinem
ˇ odmytí nenavázaného fága
ˇ lze testovat velmi vysoké
počty fágových částic a
hledat interagující klony
Ko-imunoprecipitace
ˇ vhodná metoda pro ověření meziproteinových interakcí
stanovených dvojhybridním systémem v kvasinkách
ˇ savčí buňky se transfekují genem kódujícím testovaný
protein
ˇ vytvořený protein se z buněk izoluje prostřednictvím
protilátek
ˇ pokud není k dispozici vhodná protilátka může být protein
označen pomocným peptidem FLAG, pak lze k precipitaci
použít anti-FLAG protilátku
ˇ protein se z buněk precipituje za takových podmínek, že není
narušeno jeho případné spojení s jinými proteiny
ˇ protein A izolovaný z buněk S. aureus pevně váže protilátky:
imobilizovaný protein A je vhodným nástrojem pro izolaci
protilátek s připojenými proteiny
ˇ proteinové komplexy se rozdělí elektroforézou SDS-PAGE
ˇ identifikace asociovaných proteinů je možná protilátkami,
hmotnostní spektrometrií nebo sekvenováním proteinů
Hledání neznámých proteinů
asociujících se studovaným
proteinem
Ověření interakcí mezi dvěma
proteiny ko-imunoprecipitací
,,Protein tagging"
ˇ ,,tag" = visačka
ˇ ,,Protein tagging" znamená označení proteinu
připojením zřetelné značky
ˇ obvykle se provádí geneticky ­ sekvence DNA je
opatřena segmentem kódujícím ,,tag"
ˇ sekvence musí být klonována ve vhodném vektoru a
přenesena do vhodné hostitelské buňky, která
bude syntetizovat označený protein
ˇ značku lze využít např. pro účinnou purifikaci
proteinu nebo imunoprecipitační experimanty
Typy peptidových
značek
ˇ ,,His tag" = polyhistidinový tag
ˇ složen ze šesti tandemově
uspořádaných zbytků histidinu
ˇ přidává se k cílovému proteinu na
N- nebo C-konec
ˇ ,,His tag" se velmi účinně váže k
iontům niklu
ˇ proteiny označené ,,His tag" lze
snadno purifikovat
chromatograficky na kolonách, kde
je nosič opatřen niklovými ionty
,,FLAG tag"
Krátký peptid (AspTyrLysAspAspAspAspLys), který
je rozeznáván specifickou protilátkou, která je
komerčně dostupná (Immunex Corp)
Tato protilátka může být imobilizována na koloně
pro chromatografickou purifikaci příslušného
proteinu.
,,Strep tag"
Peptid o velikosti 10 aminokyselin, který napodobuje
trojrozměrnou strukturu biotinu
Má afinitu k avidinu nebo streptavidinu
Protein A ­ afinita k protilátkám
Glutathion S transferáza (GST) ­ afinita k
tripeptidu glutathionu
Protein vážoucí maltózu (MBP) ­ afinita k maltóze
a polymeru maltózy (amylóze)
Sekvence kódující značící protein se obvykle
umísťuje 5´ od studovaného genu
Funkci značky mohou mít nejen krátké
peptidy, ale i celé proteiny
Protein arrays
ˇ umožňují simultánní monitorování
interakcí mnoha proteinů
ˇ používají se pro biochemické a
enzymatické analýzy proteinů a
pro studium meziproteinových
interakcí
ˇ sestaveny z proteinů označených
tagy, které umožňují jejich
připojení k pevnému podkladu
buď ELISA destiček nebo
podložním sklíčkům
Skrínink interakcí proteinů obvykle
využívá fluorescence, méně často
radioaktivity
Příklad: hledání proteinů, které vážou fosfolipidy
ˇ proteinová array se inkubuje s fosfolipidy
konjugovanými s biotinem
ˇ navázaný fosfolipid je zviditelněn přidáním
avidinu konjugovaného s fluorescenční značkou
ˇ fluoreskující ,,spot" reprezentuje protein, který
váže fosfolipidy