Fyzikální mapování genomů
- přístup volen podle velikosti a komplexity genomu
Základní strategie
* restrikční (makrorestrikční) mapování
* kontigové mapování (seřazení souvislých sekvencí genomu)
* přímé sekvencování DNA
Cíl = konstrukce fyzikální mapy - stanovení sekvence genomu
Restrikční mapování srovnáním jednoduchého a dvojitého štěpení RE
8
8
6
6
3
3
RE2
Předpoklady pro restrikční mapování:
- identifikace všech fragmentů
- vyloučení částečných štěpů
- přesné stanovení velikosti
Restrikční mapování koncově značené DNA
1. Linearizace molekuly
2. Značení na koncích
3. Izolace nejdelšího fragmentu a
jeho částečné štěpení RE1 RE2
4. Elektroforéza, stanovení velikosti
fragmentů a sestrojení mapy
Na autoradiogramu jsou vidět
jen značené fragmenty
Restrikční mapování klonovaného fragmentu
Poloha BamHÍ´
1120 + x = 2860 (nový fragment
vzniklý štěpením BamHI)
x = 1740 = poloha BamHI v
inzertu
Klonovací místo EcoRI
Známé restrikční místo BamHI
Základní strategie pro mapování a sekvencování velkých genomů
Přístup shora dolů
Přístup zdola nahoru
Štěpení RE
PFGE
hybridizace
Genomová knihovna
Uspořádání klonů
Srovnání klonů
Mapování pomocí pulzní gelové elektroforézy
Autoradiogramy po
hybridizaci genomové DNA
štěpené NotI (N), MluI (M)
a NruI (R) se sondami (S...)
Restrikční fragmenty
hybridizující k použitým
sondám - barevně
označené fragmenty
hybridizují k více sondám
Šipky naznačují místa
na genomové DNA,
kde se vážou sondy
Makrorestrikční mapa
Částečné štěpení,
chyby ve velikostech
Vektor odvozený od fága
lambda, který se množí jen v
případě, že nese supresor
Mapování genomu s využitím spojovací knihovny
NotI EcoRI
Klonování do
vektoru
Uspořádání fragmentů E1 do mapy
Přenos DNA na
filtr
Označení a použití jako sondy
Kontigové mapování
Procházení po chromozomu
Procházení po chromozomu (chromosome walking)
Příprava sond pro přeskakování po chromozomu
Úsek genomu, který není dosud
zmapován (např. repetitivní
DNA) = ,,mezera" při
procházení po chormozomu
RE RE
Klonování do fágového vektoru -
knihovna pro přeskakování
Příprava knihovny ,,přeskakovacích
klonů" (,,jumping library")
~100 kb
supF
Genomová DNA
10-20 kb
Fágové nebo kosmidové klony
přeskoky
Kombinace procházení a přeskakování po chromozomu
Uspořádání kosmidových klonů srovnáním restrikčních spekter
1. Štěpení kosmidových klonů HindIII
2. Koncové značení restrikčních fragmentů
3. Štěpení značených fragmentů Sau3A1
Autoradiogram jednoho inzertu
7 různých inzertů
srovnání délek fragmentů
vyhledání překrývajících se inzertů
seřazení kosmidových klonů
Fyzikální
mapa
E. coli
(srovnání fingerprintů)
Binární fingerprinting s náhodnými oligonukleotidovými sondami
20 replikových filtrů, každý se
sedmi kosmidy. Každý filtr je
hybridizován s
oligonukleotidovou sondou (1-20)
Kosmid A hybridizuje se
sondami 2,7,14 a 19
Stanovení překryvů
kosmidů (ty, které
hybridizují se stejnými
sondami)
Uspořádání kosmidů do
kontigové mapy
Modelově u HSV
Klonování ve kvasinkových umělých chromozomech (YACs)
Selekce na TRP a URA
Vyhledání specifických genů v YAC-klonech pomocí PCR
240 destiček po 96 komůrkách,
přenos 4 destiček na jeden filtr
Spojení
klonů
Testování
individuálních ,,poolů"
Kontroly:
H = celková lidská DNA
Y = kvasinková DNA
Identifikace YAC-klonu obsahujícího hledaný gen
Mapování YAC-klonů na polyténních chromozomech drosofily
Délka pruhu 22 kb
Polohy YAC-klonů drosofily mapovaných na polytenním chromozomu
Genetická
mapa
polytenní
chromozom 3
polohy YAC-
klonů
PCR in situ
restrikční mapování in situ
Další možnosti
STS - jakákoliv jedinečná sekvence DNA, která splňuje tato kriteria:
1. Musí být známa její sekvence, aby mohly být připraveny primery pro PCR
k testování přítomnosti STS na různých fragmentech.
2. Musí mít na chromozomu jedinečnou lokalizaci (případně v celém genomu)
Typy STS:
A. Expressed sequence tags (ESTs). Krátké sekvence získané analýzou klonů
cDNA. Představuje sekvenci jedinečního genu (ne rodiny genů, v níž mají geny
stejné nebo velmi podobné sekvence).
B. Mikrosatelity a další SSLP (single sequence length polymorphisms) ­
skupiny repetic vykazující délkovou variaci (různé alely obsahují různý počet
jednotek repetice). Patří mezi ně VNTR (minisatelity) a mikrosatelity neboli
simple tandem repeats (STRs, di-, tri- nebo tetranukleotidové jednotky)
C. Náhodné genomové sekvence získané sekvencováním náhodných úseků
klonované genomové DNA, a nebo jednodušeji vyhledáváním sekvencí uložených
v databázích.
STS = místo se sekvenční adresou
STS-1 STS-2
P1 + P1´ P2 + P2´
100 000 bp
200-500 bp
Identifikace STS v klonech, srovnání se sekvencí v databázích
Využití STS k mapování genomů
Použití STS k uspořádání překrývajících se YAC-klonů
Nejasné pořadí
Uspořádání YAC klonů pomocí STS
Genomová DNA
BAC knihovna
uspořádání do
kontigové mapy
příprava náhodných
klonů a stanovení
jejich sekvence
Postup použitý při stanovení sekvence genomu H. influenzae
,,shotgun approach"
1,83 Mb
24 304 sekvenací - 11 631 485 bp (6x genom Hi)
Zaplnění mezer
procházení
primerem
Genomová
knihovna 
STC = sequence tagged connectors
Subklonování do vektoru
M13, uspořádání klonů