Dělící techniky nukleových kyselin ˇ Metody ­ Centrifugační ­ Elektromigrační ­ Chromatografické ˇ Vlastnosti využívané pro dělení biomakromolekul ­ Molekulová hmotnost ­ Konformace a tvar ­ Náboj ­ Hustota Rozdělení centrifugačních technik A. Diferenciální centrifugace - separace směsi heterogenních částic v homogenním roztoku B. Zonální centrifugace - separace směsi částic s podobnými vlastnostmi v gradientním roztoku a) Izokinetická centrifugace ­ separace podle rychlosti sedimentace částic ˇ Stanovení sedimentačního koeficientu S b) Izopyknická centrifugace ­ separace podle hustoty částic ˇ Stanovení vznášivé hustoty Typy centrifugace podle účelu ­ Preparativní centrifugace ­ Analytická centrifugace Centrifugační metody ˇ Centrifugace patří k separačním metodám, které se v molekulární biologii používají k ­ Izolaci ­ Purifikaci ­ Charakterizaci informačních makromolekul a nadmolekulárních struktur ˇ Základním principem separace založené na centrifugačních technikách je pohyb částic v tekutém prostředí pod vlivem odstředivého pole, které vzniká otáčením rotoru centrifugy ˇ Chování částic při centrifugaci je dáno jejich fyzikálními vlastnostmi a povahou prostředí, v němž centrifugace probíhá. Teoretické principy centrifugace Výpočet relativní odstředivé síly ˇ 1000×g, 5 min bakteriální buňky ˇ 3000×g, 10 min chloroplasty, jádra ˇ 10 000×g, 10 min mitochondrie, inkluzní tělíska ˇ 40 000×g, 30 min membrány, mikrozómy, peroxizómy aj. ˇ 200 000×g, 16 hr velké proteinové komplexy (ribozómy) ˇ 400 000×g, 24 hr proteiny 50 kDa r RCF rpm 12,1 1000×= 2 1000 12,1 = rpm rRCF RCF ­ relativní odstředivá síla (relative centrifugal force) rpm ­ počet obrátek za minutu r ­ vzdálenost od středu otáčení, poloměr rotoru [mm] ( ) rrpm g rn g r mg rm RCF 2 2 2 2222 980 60 4 4 ==== Nomogram pro přepočet relativní odstředivé síly (RCF) a otáček rotoru (rpm) RCF = relativní odstředivá síla r = vzdálenost od středu otáčení(poloměr rotoru) v cm n = počet otáček za minutu (rpm) r [cm] RCF [×g] n (rpm) [min-1 ] V publikacích je nutno udávat ˇ RCF, dobu centrifugace a teplotu ˇ rpm, typ centrifugy, typ rotoru, dobu centrifugace a teplotu Teplota je vzhledem k velkému vlivu na viskozitu důležitá. Diferenciální centrifugace ˇ Jestliže se centrifugaci v homogenním roztoku podrobí směs částic lišících se podstatně svou velikostí, hmotností nebo hustotou, budou jednotlivé složky směsi sedimentovat různou rychlostí. ˇ Opakovanou centrifugací lze z původní směsi při postupném zvyšování otáček získat jednotlivé složky nebo frakce ve formě sedimentu. ˇ Výchozí krok pro hrubou separaci a izolaci složek z lyzátů buněk nebo homogenátů tkání, např. ­ buněčných jader ­ ribozomů ­ mitochondrií Směs látek v roztoku. Centrifuface při nízkých otáčkách (1 000 g). Shromáždění sedimentu. Centrifugace supernatantu při středních otáčkách (20 000 g). Shromáždění sedimentu. Centrifugace supernatantu při vysokých otáčkách (80 000 g). Diferenciální centrifugace ­ buněčných membrán ­ nukleových kyselin ­ proteinů Zonální centrifugace ˇ Rychlost sedimentace jednotlivých komponent přítomných ve výchozí směsi není vždy odlišná natolik, aby je bylo možné diferenciální centrifugací oddělit ­ různé typy nukleových kyselin ­ ribozomální podjednotky ­ jiné částice, vykazující podobné vlastnosti ˇ Pro oddělováni neboli separaci těchto látek se využívá zonální centrifugace, při níž je homogenní roztok v centrifugační zkumavce nahrazen roztokem, jehož koncentrace od povrchu ke dnu zkumavky narůstá. ˇ Takový roztok se označuje jako gradientní roztok. ˇ K jeho přípravě se používají dobře rozpustné a vůči analyzovaným částicím inertní látky ­ Sacharóza ­ Glycerol ˇ Vzrůstající hustota a viskozita gradientního roztoku eliminují vliv zvyšujícího se odstředivého zrychlení směrem od osy otáčení, čímž brání nárůstu rychlosti sedimentace částic v průběhu centrifugace. ˇ Před zahájením centrifugace se vzorek obsahující směs částic nanese v tenké vrstvě na povrch gradientního roztoku v centrifugační zkumavce. ˇ Jednotlivé složky výchozí směsi budou v závislosti na své velikosti, tvaru a hustotě sedimentovat gradientním roztokem různou rychlostí a vytvářet dobře oddělené zóny. ˇ Gradient roztoku zároveň zabraňuje proudění uvnitř zkumavky, udržuje stabilitu a ostrost vytvořených zón a umožňuje jejich odebrání. Zonální centrifugace Hustotní gradienty ˇ Gradienty mohou být podle toho, zda se koncentrace roztoku mění plynule nebo stupňovitě. ­ Kontinuální ­ Diskontinuální ˇ Diskontinuální gradient je předem připravený gradient v centrifugační zkumavce postupným navrstvováním roztoků o různé koncentraci. Vzorek je pak nanesen na jeho povrch. ˇ V obou případech jsou po ukončení centrifugace částice příslušného druhu zkoncentrovány do úzkých pruhů, které lze detegovat a izolovat stejným způsobem jako při zonální centrifugaci. ˇ K přípravě hustotních gradientů se používají látky, které se vyznačují vysokou rozpustností. ˇ Běžně používanými látkami jsou. ­ chlorid cesný ­ sacharóza ˇ Rozdíly v hustotách se pohybují v rozmezí 1,0-1,3 g/ml u sacharózy a 1,0-1,9 g/ml u CsCl, což umožňuje oddělit a izolovat např. buněčná jádra, mitochondrie, nukleové kyseliny atp. ˇ Čistota získaných preparátů je vysoká. Vzorek nanesený na povrch 5 - 20 % sacharózového gradientu. Centrifugace. Pomaleji sedimentující částice. Rychleji sedimentující částice. Frakcionace obsahu zkumavky. Sběr frakcí. Izokinetická centrifugace 2 typy zonální centrifugace Roztok CsCl obsahující směs částic. Centrifugace. Částice s nižší hustotou. Částice s vyšší hustotou. Frakcionace obsahu zkumavky. Sběr frakcí. Izopyknická centrifugace Odběr frakcí po ultracentrifugaci v hustotním gradientu Sběr frakcí Izokinetická centrifugace ˇ Volbou vhodných podmínek při zonální centrifugaci lze dosáhnout toho, aby rychlost sedimentace částic byla v průběhu centrifugace konstantní. ˇ Tento způsob centrifugace se využívá k podrobnější charakteri- zaci částic, např. K přesnému stanovení jejich velikosti. ˇ Při analýze nukleových kyselin se obvykle používá 5-20% sacharózový gradient, v němž se koncentrace sacharózy lineárně mění od hladiny ke dnu zkumavky. ˇ Pohyb vytvořených zón lze monitorovat ­ Přímo během centrifugace pomocí speciálních zařízení (analytické centrifugy) ­ Stanovit polohu po ukončení centrifugace ˇ Spektrofotometricky ˇ Změřením radioaktivity jednotlivých frakcí ˇ Rychlost, při níž částice sedimentuje, závisí na její velikosti, tvaru a hustotě a je ovlivňována vlastnostmi prostředí a podmínkami, při nichž centrifugace probíhá. Chloroplastová DNA po ultracentrifugaci v gradientu CsCl-EtBr Sedimentační koeficient ˇ Veličina, kterou lze rychlost pohybu částice při izokinetické centrifugaci charakterizovat, se označuje jako sedimentační koeficient nebo též hodnota S. Rychlost sedimentace částice při centrifugaci lze vyjádřit obecným vztahem: dr/dt = S.a = s.2r, kde r je vzdálenost částice od osy otáčení, t je doba centrifugace, a je odstředivé zrychlení, S je sedimentační koeficient, je úhlová rychlost rotoru při otáčení. ˇ Po integraci uvedeného vztahu získáme rovnici pro sedimentační koeficient S = d(lnr)/2dt = lnr2/r1/2(t2-t1), z níž lze vypočítat hodnotu sedimentačního koeficientu analyzované částice, jestliže známe její polohy r1 a r2 v centrifugační zkumavce v příslušných časových intervalech t1 a t2 a rychlost otáčení. ˇ Abychom mohli srovnat hodnoty S stanovené při různých podmínkách centrifugace, jsou získané hodnoty přepočítány na standardní sedimentační koeficient So 20,w, které charakterizují rychlost sedimentace částic o koncentraci blízké nule ve vodě při 20°C. ˇ Hodnoty sedimentačních koeficientů se pro většinu informačních makromolekul a molekulárních komplexů pohybují v rozmezí řádů 10- 11 až 10-13 sekund. ˇ Vyjadřují se proto ve Svedbergových jednotkách (S), kde 1 S (Svedberg) = 10-13 sekundy. ˇ Hodnot sedimentačních koeficientů se využívá k popisu a charakterizaci informačních makromolekul, buněčných organel a jejich struktur. ˇ Příkladem je označování jednotlivých druhů ­ ribozomových RNA ˇ 23S-rRNA ˇ 16S-rRNA ­ ribozomových podjednotek ˇ 30S ˇ 50S ˇ Pro jednotlivé typy informačních makromolekul lze pomocí empirických vztahů z hodnot sedimentačních koeficientů vypočítat rovněž jejich molekulové hmotnosti. Sedimentační koeficient Příklady hodnot standardních sedimentačních koeficientů So 20,w Výpočet molekulové hmotnosti DNA z hodnoty S So 20,w = a . M K M = molární hmotnost nukleové kyseliny a, K = empirické konstanty Výpočet srovnáním s vnitřním standardem L= vzdálenost od hladiny M = molární hmotnost K = empirická konstanta K ST x ST x M M L L = Izopyknická centrifugace ˇ Při této metodě centrifugace, označované též jako hustotní centrifugace nebo centrifugace do rovnováhy, se částice oddělují podle své hustoty. ˇ Nejjednodušší provedení této metody spočívá v přípravě homogenní směsi analyzovaných částic ve vhodném mediu a následné centrifugaci. ˇ Během centrifugace tato media sama vytvoří koncentrační a tím i hustotní gradient, v němž se částice analyzovaných látek pohybují oběma směry tak dlouho, dokud nedosáhnou polohy, v níž je hustota roztoku shodná s hustotou částic. ˇ Takto stanovená hustota se označuje jako vznášivá hustota. Její hodnoty jsou ovlivněny interakcí částic s ionty roztoku a jsou obvykle vyšší než je hustota částic v buňkách. Stanovení vznášivé hustoty izopyknickou centrifugací 25 °C = 10,8601 × nD 25 °C ­ 13,4974 nD 25 °C = index lomu roztoku CsCl Výpočet % (G+C) ˇ Separace částic na základě jejich odlišné hustoty se používá k jejich izolaci a charakterizaci. ˇ Je známo, že na vznášivou hustotu dvouřetězcové DNA má vliv zastoupení jednotlivých typů párů bází, čehož se využívá ke stanovení podílu GC-párů ve vzorcích DNA. ˇ Platí, vztah % (G+C) = ( - 1,660/0,098) .100 kde = vznášivá hustota vzorku dvouřetězcové DNA. Separace různých forem DNA ˇ Speciálním případem využití izopyknické centrifugace je rozdělení odlišných strukturních typů DNA v gradientech CsCl za přítomnosti etidium-bromidu. ˇ Po navázání etidiumbromidu na DNA se její vznášivá hustota významně snižuje, přičemž množství navázaného etidiumbromidu a tím i pokles hustoty DNA závisí na jejím strukturním typu. ˇ To umožňuje vzájemně separovat a izolovat různé formy DNA, např. kovalentně uzavřené kružnice plazmidových DNA od otevřených a lineárních molekul plazmidové a chromozomové DNA.