Dělící techniky nukleových kyselin ˇ Metody ­ Centrifugační ­ Elektromigrační ­ Chromatografické ˇ Vlastnosti využívané pro dělení biomakromolekul ­ Molekulová hmotnost ­ Konformace a tvar ­ Náboj ­ Hustota Metody elektroforetické ˇ Princip ­ Pohyb nabitých molekul nukleových kyselin v elektrickém poli ­ Hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou záporně nabité fosfátové skupiny ˇ Cíl ­ Dělení molekul na základě rozdílných elektroforetických pohyblivostí Elektroforéza patří v molekulární biologii k nejpoužívanějím separačním technikám při izolaci a analýze nukleových kyselin a proteinů Gelová elektroforéza ˇ Základ ˇ Z praktických důvodů se elektroforéza neprovádí přímo v roztoku, ale na vhodném nosiči ˇ V případě nukleových kyselin bývá nosičem nejčastěji gel ˇ Pro přípravu gelu jsou výhodné látky, které samy gelují a mají různou porozitu v závislosti na koncentraci gelu ˇ Výhody ˇ Elektroforetické metody nahradily ultracentrifugaci ˇ Aparatury jsou levné, často je lze vyrábět svépomocí ˇ Dělit lze všechny důležité biomakromolekuly ˇ Změnou podmínek lze dělit podle různých hledisek ˇ Rychlost ˇ Lze pracovat s mikrokvanty nebo preparativně v mikrogramových množstvích ˇ Rozdělené molekuly lze snadno prokázat a ve funkční formě izolovat z gelu Používané nosiče ˇ Elektroforetické gely používané pro separaci nukleových kyselin jsou nejčastěji tvořeny ­ agarózou ­ polyakrylamidem ˇ Vytvářejí složitou síťovou strukturu polymerních molekul s póry ˇ Velikost pórů lze ovlivnit složením roztoku a koncentrací polymeru ˇ Optimální velikost separovaných molekul ­ agarózové gely 100 bp až 50 000 bp ­ polyakrylamidové 10 až 1000 bp Uspořádání gelové elektroforézy ˇ Horizontální ˇ Vertikální Elektroforetická pohyblivost DNA ˇ Rychlost pohybu molekul DNA v gelu označovaná jako elektroforetická pohyblivost je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. ˇ Velikost fragmentu DNA o neznámé velikosti lze proto stanovit srovnáním jeho elektroforetické pohyblivosti s elektroforetickou pohyblivostí fragmentů o známé velikosti, označovaných jako standardy velikosti nebo hmotnostní standardy. ˇ Těmi bývají většinou restrikční fragmenty plazmidových molekul nebo genomu bakteriofágů, jejichž přesná velikost byla stanovena sekvencováním. Vztah mezi velikostí DNA a její elektroforetickou pohyblivostí v agarózovém gelu Agarózové gely 0,1 ­ 2 kb2,0 % 0,2 ­ 3 kb1,5 % 0,4 ­ 4 kb1,2 % 0,5 ­ 7 kb0,9 % 0,8 ­ 10 kb0,7 % 1 ­ 20 kb0,6 % 5 ­ 60 kb0,3 % Rozsah dělení ds DNAKoncentrace agarózy Separační schopnosti gelu v závislosti na koncentraci agarózy Speciální typy agaróz ˇ Některé komerčně dostupné agarózy nejsou zcela čisté; jsou kontaminovány dalšími polysacharidy, solemi a proteiny. ˇ Tyto látky mohou ovlivnit jak rychlost migrace DNA v gelu, tak použitelnost DNA vyizolované z gelu. ˇ Řada výrobců přiravuje speciální typy agaróz pro daný účel ­ Agarózy s nízkým bodem tání/tuhnutí (LMT) pro preparativní účely ­ Agarózy s vysokou rozlišovací schopností pro analýzu velmi malých fragmentů (10 ­ 500 bp). Používané koncentrace jsou 4-10 %. Alkalická agarózová elektroforéza ˇ Pro analýzu ssDNA nebo RNA ­ Analýza velikostí cDNA ­ Analýza S1 nukleáza rezistentních DNA:RNA hybridů ­ Srovnání velikostí prvního a druhého řetězce cDNA syntetizovaného zpětnou transkriptázou ­ Kontrola aktivity enzymů vytvářejících jednořetězcové zlomy ˇ Alkalické pufry obsahují 50 mM NaOH. Za přítomnosti NaOH se agaróza nerozvaří, proto musí být NaOH přidáván až po rozvaření. ˇ Detekce pomocí 32P značených konců Příprava agarózového gelu Příprava polyakrylamidových gelů ˇ Složení: kopolymer akrylamidu a N,N,- metylenbisakrylamidu ˇ Monomer je neurotoxin a mutagen ˇ Katalyzátor ­ tetramethylethylendiamin (TEMED) ˇ Iniciátor ­ persíran amonný (NH4)2S2O8 ˇ Radikálová polymerace ˇ V důsledku přítomnosti bifunkčního agens N,N,- metylenbisakrylamidu řetězce kroslinkují a vytvářejí gel 6 ­ 100 bp20 % 25 ­ 150 bp15 % 40 ­ 200 bp12,0 % 60 ­ 400 bp8,0 % 80 ­ 500 bp5,0 % 1000 ­ 2000 bp3,5 % Rozsah dělení dsDNAKoncentrace polyakrylamidu v gelu Separační schopnosti elektroforetických gelů v závislosti na koncentraci akrylamidu Polyakrylamid + Aparatura pro vertikální elektroforézu Polyakrylamidové gely se připravují obtížněji než agarózové. Obvykle se lijí mezi dvě skla oddělená mezerníky. Typy polyakrylamidových gelů ˇ Nedenaturující gely ­ Gely pro separaci dvouřetězcových molekul v nativním stavu ­ Jsou používany pro separaci malých fragmentů dsDNA a heteroduplexů ˇ Denaturující gely ­ Gely separující jednořetězce ­ Jsou používány při sekvencování ˇ Denaturující gradientové gely ­ Fragmenty DNA se pohybují gelem, v němž se zvyšuje koncentrace denaturačního agens ˇ Močovina ˇ Formamid ­ Používají se pro separaci stejně dlouhých fragmentů lišících se svou sekvencí Gely pro sekvencování ˇ Výsledkem reakcí používaných při sekvencování DNA jsou jednořetězcové oligonukleotidy o délce desítek až stovek bází. ˇ Lze je účinně oddělit na denaturujících polyakrylamidových gelech. ˇ Podmínky elektroforézy musí být takové, aby se během separace zabránilo vytváření lokálních dvouřetězcových struktur. ˇ Používají se gely s vysokou koncentrací denaturujících látek (např. močoviny). ˇ Vlastní elektroforéza probíhá při vysokém napětí. ˇ To má za následek, že se gel zahřeje na 50-70 °C. ˇ Kombinace těchto dvou faktorů zaručuje úpnou denaturaci jednořetězců. ˇ Nanášecí pufry slouží při elektroforéze NA ­ Zvýšení hustoty vzorku - to umožní, že DNA klesne na dno jamky ­ Obarvení vzorku pro snadnější nanášení ­ Přidání pohyblivého barviva do vzorku pro možnost sledování průběhu elektroforézy ˇ Rozdělení nanášecích pufrů ­ Založené na sacharóze ­ Založené na glycerolu ­ Založené na Ficollu ­ Kombinované ­ Alkalické Pufry pro nanášení vzorků Přehled pohyblivých barviv v nanášecích pufrech Pouze pro alkalickou agarózovou elektroforézu 100 bp Bromkresolová zeleň --50 bpOranž G 25 bp40 bp300 bpBromfenolová modř 105 bp170 bp4 kbXylencyanol 6 % polyakrylamid 4 % polyakrylamid 0,5 ­ 1,4 % agaróza Migrace barviv je více ovlivněna nábojem než velikostí molekuly Používané elektroforetické pufry 50×1×: 0,04 M Tris-acetát 1 mM EDTA TAETris-acetátový 5×1×: 25 mM Tris 250 mM glycin 0,1 % SDS Tris-glycinový 1×1×: 50 mM NaOH 1 mM EDTA Alkalický 5×0,5×: 45 mM Tris-borát 1 mM EDTA TBETris-borátový 10×1×: 0,09 M Tris-fosfát 2 mM EDTA TPETris-fosfátový Zásobní koncetrace Pracovní koncentraceZkratkaPufr Provedení elektroforézy Faktory ovlivňující rychlost migrace v gelu 1. Molekulová velikost DNA ˇ Molekuly lineární dsDNA se pohybují rychlostí, která je nepřímo úměrná logaritmu (log10) jejich velikosti - počtu párů bazí) ˇ Molekuly se pohybují ve tvaru závitu přímočaře a plynule od katody k anodě ˇ Efekt molekulárního síta ­ větší molekuly migrují mnohem pomaleji vzhledem k většímu třecímu zbržďování M v log 1 = 2. Koncentrace gelu ˇ Lineární DNA fragmenty dané velikosti migrují různou rychlostí gely obsahujícími různou koncentraci gelu. Platí lineární vztah mezi logaritmem elektroforetické mobility DNA (m) a koncentrací gelu (t): log m = log m0 - Krt, kde m0 je volná elektroforetická mobilita DNA a Kr je retardační koeficient, konstanta, která souvisí s vlastnostmi gelu a velikostí a tvarem migrujících molekul. Viz též tab. koncentrací. Faktory ovlivňující rychlost migrace v gelu 3. Konformace DNA ˇ Superhelikální forma (forma I), otevřená kruhová forma (forma II) a lineární forma (forma III) DNA téže velikosti migrují agarozovým gelem různou rychlostí. ˇ Relativní mobilita těchto tří forem závisí především na koncentraci agarozy v gelu, ale je ovlivněna rovněž silou aplikovaného proudu, iontovou silou pufru a hustotou superhelikálních otáček u formy I. ˇ Za určitých podmínek migruje forma I rychleji než forma III; za jiných podmínek je tomu naopak. Forma II je vždy nejpomalejší. ˇ Jednoznačnou metodou pro identifikaci různých komformačních forem je provedení elektroforézy za přítomnosti zvyšující se koncentrace EtBr. ­ Odstraňují se negativní superhelikální otáčky v DNA, zvětšuje se průměr molekuly a rychlost pohybu se snižuje ­ Při kritické koncentraci barviva (0,1 ­ 0,5 mg ml-1) již žádné superhelikální otáčky nejsou a DNA dosahuje nejnižší migrační rychlosti Faktory ovlivňující rychlost migrace v gelu 4. Aplikovaná voltáž (V/cm) ˇ Při nízké voltáži je rychlost migrace lineární DNA proporcionální aplikované voltáži. ˇ Se zvyšující se silou elektrického pole se rychlost migrace fragmentů zvyšuje rozdílně a efektivní rozsah separace v agarozovém gelu je snížen. ˇ Pro maximálního rozlišení DNA fragmentů větších než 2 kb je horní hranice 5 V/cm. Faktory ovlivňující rychlost migrace v gelu 5. Směr elektrického pole ˇ DNA molekuly větší než 50 kb migrují v agarozovém gelu stejnou rychlostí ve směru konstantního elektrického pole. ˇ Jejich rychlosti se změní v pulzním poli při pulzní gelové elektroforéze. Faktory ovlivňující rychlost migrace v gelu 6. Složení bází a teplota ˇ V agarozovém gelu na rozdíl od PAGE složení bází ani teplota (v rozmezí 4 ­ 30 °C) neovlivňují rychlost migrace. ˇ Elektroforéza se obvykle provádí při pokojové teplotě ˇ Gely z LMT nebo o nízké koncentraci (0,3 %) se pouští při 4 °C. 7. Přítomnost interkalačních barviv ˇ EtBr snižuje elektroforetickou mobilitu lineárních molekul asi o 15%. ˇ Interkalací EtBr se prodlužuje délka molekul DNA (lineárních a OC). Faktory ovlivňující rychlost migrace v gelu 8. Složení elektroforetických pufrů ˇ Mobilita je ovlivněna iontovou silou a složením elektroforetického pufru. ˇ Za nepřítomnosti iontů je rychlost migrace nízká nebo žádná. ˇ 3 základní pufry: TAE, TBE a TPE (pH okolo 7,5-7,8). Faktory ovlivňující rychlost migrace v gelu Metody detekce ˇ Po proběhnutí elektroforézy je třeba identifikovat polohy rozdělených molekul, které nejsou pouhým okem viditelné. ˇ Molekuly DNA lze snadno zviditelnit ­ Přímým barvením vhodným barvivem ˇ Nejjednodušší a nejlevnější ˇ Barvivo se váže na DNA ˇ Zbarvení je proporcionální koncentraci DNA a tím i velikosti fragmentů ­ Příklad: Spolehlivě detekovatelné množství DNA v proužku na gelu je 1-2 ng. Aby byl detekován fragment o velikosti 200 bp pocházející ze sekvence dlouhé 20 kb, musí být do jamky na gel naneseno 200 ng DNA. ­ Koncovým značením 32P označených dNTP připojených na konce fragmentů DNA ˇ Lze aplikovat jen na vysoce přečištěné sekvence ˇ Každý fragment má stejný počet konců, intenzita značky není závislá na délce fragmentu ˇ Polohy proužků na gelu se znázorní autoradiograficky ˇ Je citlivější než barvící metody, ovšem dražší ­ Hybridizací se značenou sondou Rozdělení barviv pro detekci nukleových kyselin ˇ Klasická barviva NA ­ Interkalační fenantridinová barviva ˇ Etidium bromid ˇ Etidium homodimer ˇ Propidium jodid ­ Indolová a imidazolová barviva vázající se na menší žlábek ˇ DAPI ˇ Hoechst (bis-benzimid) ­ Další barviva ˇ Akridin oranž ˇ 7-amino-aktinomycin D ˇ Hydroxystilbamidin ˇ LDS 751 ­ Nevyžadující detekci UV-světlem ˇ Metylénová modř ˇ Barvení stříbrem ˇ Kyaninová barviva ­ Původní patentovaná ˇ Pro barvení gelů ­ SYBR Gold ­ SYBR Green I ­ SYBR Green II ˇ Pro kvantifikaci ­ PicoGreen ­ OliGreen ­ RiboGreen ­ Pro buňky impermeabilní s vysokou citlivostí ˇ TOTO, TO-PRO a SYTOX ­ Pro buňky permeabilní ˇ Cytologická barviva SYTO ­ Chemicky reaktivní SYBR barviva tvořící biokonjugáty Fenantridinová barviva ­ Etidium bromid ˇ Interkalační barviva vázající se bez sekvenční specifity na nukleové kyseliny s četností 1 molekula na 4­5 bp DNA ˇ Mutageny a karcinogeny ˇ EtBr a PI se váže jak na DNA, tak na RNA ˇ Po vytvoření komplexu EtBr-DNA je pozorována ~20 - 30 × vyšší fluorescence ˇ Citlivost 1-5 ng DNA, 5 ng RNA (254 nm) ˇ Polyakrylamid zháší fluorescenci EtBr, není možné detekovat méně jak 10 ng DNA Etidium bromid (fenantridinium, 3,8-diamino -5-etyl-6-fenyl-bromid) Srovnání výsledků Amesova testu u EtBr a SYBR ˇ vysoká afinita k NA ˇ 1000× vyšší fluorescence po vazbě na NA ˇ 25 ­ 100 × citlivější než EtBr ˇ Vhodná pro ds DNA, ssDNA a RNA ˇ 60 pg dsDNA nebo 1 ng RNA (při 300 nm) ˇ mnohem méně mutagenní než EtBr Komerční kyaninová barviva - SYBR Green a SYBR Gold SYBR EtBr SYBR Green I SYBR Gold a. POPO-1 b. BOBO-1 c. YOYO-1 d. TOTO-1 e. JOJO-1 f. POPO-3 g. LOLO-1 h. BOBO-3 i. YOYO-3 j. TOTO-3 Citlivost 15 ­ 50 pg dsDNA (300 nm) TOTO-1 chinolinium, 1-1'-[1,3- propandiyl bis[(dimetyliminio)-3,1- propandiyl]]bis[4-[(3-metyl-2(3H)- benzotiazolyliden)metyl]] tetrajodid a b c d e f g h i j Dimerní kyaninová barviva s vysokou afinitou k NA Barvení stříbrem ˇ Barvení NA stříbrem má mírně vyšší citlivost než barvením EtBr ˇ Citlivost 100 pg DNA v PA ˇ dsDNA, ssDNA i RNA ˇ Lepší citlivost vykazuje u polyakrylamidových gelů než u agarózových ˇ Barvení zahrnuje 3 kroky: ­ Fixace (metanol, ledová kyselina octová a glycerol) ­ Barvení (uhličitan sodný, dusičnan amonný, dusičnan stříbrný a kyselina wolframovokřemičitá) ­ Zastavení (ledová kyselina octová) Dokumentace ˇ Používané vlnové délky UV-světla ­ 254 nm ­ 302 nm ­ 365 nm Metody izolace DNA z gelu ˇ Elektroeluční ˇ Vymražování ˇ Zachycení na membránu ˇ Agaráza ­ enzym degradující agarózu ˇ Fenolová extrakce po roztavení v LMT agaróze ˇ Pasážování přes DEAE-Sephacel ˇ Komerční kity s purifikací na kolonkách Pulzní gelová elektroforéza ˇ Při konvenční gelové elektroforéze se molekuly DNA pohybují od katody k anodě přímočaře a plynule a rychlost pohybu je úměrná jejich velikosti. ˇ Rozdělení molekul je podmíněno rychlejším průchodem menších molekul pórovitou strukturou gelové matrice. ˇ Tento princip separace se uplatňuje u molekul DNA do velikosti přibližně 50 kb. ˇ Větší molekuly se pohybují stejnou rychlostí a nerozdělí se. ˇ K jejich separaci se využívá pulzní gelová elektroforéza. ˇ Gel vystaven elektrickému poli, jehož směr se pod určitým úhlem (90-180°) v časových intervalech periodicky mění. ˇ Aby se molekuly DNA mohly pohybovat ve směru změněného elektrického pole, musí nejdříve změnit svou orientaci. ˇ Větší molekuly DNA spotřebují na svou reorientaci více času než molekuly menší a jejich výsledný přímočarý pohyb je proto pomalejší. ˇ Techniky pulzní elektroforézy se využívá k separaci neporušených molekul DNA (např. chromozomů kvasinek) nebo restrikčních fragmentů o velikosti několika megabází. Horní limit velikosti separovaných molekul je 6 000 ­ 10 000 kb. Základní termíny týkající se PFGE ˇ Pulzní pole (pulsed field). Elektroforetický proces, který používá více než jedno elektrické pole, a ve kterém se elektrická pole střídavě aktivují. ˇ Pulzní interval (switch interval, switch time, pulse time). Čas, po který je každé ze střídajících se elektrických polí aktivováno. ˇ Reorientační úhel (reorientation angle). Úhel mezi dvěma střídajícimi se elektrickými poli, tj. úhel mezi různými směry, ve kterých molekuly DNA putují. ˇ Homogenní pole (homogeneous field). Elektrické pole, které má uniformní potenciálové rozdíly po celém poli. Princip separace molekul v pulzním poli ˇ A. Molekuly DNA o různých velikostech v prostředí bez elektrického pole ˇ B. Separace molekul v konvenční gelové elektroforéze (molekuly o velikosti 50 - 500 kb se pohybují stejnou rychlostí) ˇ C. Při pulzní elektroforéze je elektrické pole E1 přerušeno a nahrazeno polem E2 v jiném směru. Aby mohla DNA ve směru druhého pole migrovat, musí se nejdříve reorientovat ve směru u nového pole. Čím jsou molekuly větší, tím delší dobu spotřebují ke své reorientaci, a dochází tak ke zpomalení jejich pohybu. ˇ Pokud jsou obě pole stejná (směr, napětí, pulzní časy), bude výsledná dráha pohybu přímá, složená z jednotli- vých !cik-cak" kroků. Pohyb DNA v agarózovém gelu při PFGE Označení systémů používaných pro pulzní elektroforézu ˇ PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis ˇ OFAGE Orthogonal Field Alteration Gel Electrophoresis ˇ TAFE Transverse Alterating Field Electrophoresis ˇ FIGE Field Inversion Gel Electrophoresis ˇ CHEF Clamped Homogenous Electric Field Electrophoresis ˇ RGE Rotating Gel Electrophoresis ˇ ZIFE Zero-Integrated Field Electrophoresis ˇ PHOGE Pulsed Homogeneous Orthogonal Field Gel Electrophoresis Součásti aparatury pro PFGE Faktory ovlivňující separaci molekul DNA při PFGE ˇ Napětí ˇ Typ agarózy ˇ Koncentrace agarózy ˇ Teplota ˇ Typ pufru (TAE- rychlejší migrace, TBE- pomalejší) ˇ Reorientační úhel ˇ Pulzní časy ˇ Zařazení sekundárních pulzních časů nebo přerušení Vliv reorientačního úhlu Volba pulzních intervalů v závislosti na velikosti separovaných molekul Sekundární pulzní pole Používané standardy velikostí pro PFGE ˇ Konkatemery plazmidů ˇ Konkatemery DNA fága lambda ­ Velikost monomeru 48,5 kb ˇ Makrorestrikční fragmenty bakteriálních genomů ­ Staphylococcus aureus ­ Escherichia coli ˇ Chromozomy kvasinek ­ Saccharomyces cerevisiae (240-2200 Kb) ­ Schizosaccharomyces pombe (3,5-5,7 Mb) ­ Hansenula wingei (1,0-3,1 Mb) ­ Candida albicans (1,0-4,0 Mb) ˇ Chromozomy Dictyostelium discodium (3,6-9,0 Mb) ˇ Chromozomy Neurospora crrassa (4,0-10,3 Mb) 25-90 s 1 800 s 60-120 s Pulzní časy Příprava vzorků pro PFGE ˇ Kultivace buněk do přesně stanovené hustoty ˇ Smíchání buněk s roztavenou agarózou ˇ Nalití směsi do malé formičky ˇ lyze buněk v agarózových bločcích ˇ deproteinace DNA ˇ Štěpení restrikční endonukleázou, která štěpí s nízkou frekvencí (velikost fragmentů 50 - 10 000 kbp) ˇ Pulzní elektroforéza ˇ Barvení gelu v etidiumbromidu Schéma přípravy vzorků pro PFGE Buněčná kultura, jednobuněčné organizmy Živočišná nebo rostlinná tkáň Krev Shromáždit centrifugací Disociovat Koncentrovat bílé krvinky Promýt buněčnou suspenzi Stanovit koncentraci buněk a naředit na příslušnou hodnotu Smíchat buňky s nízkotající agarózou a nalít do formičky Štěpit proteiny proteinázou K v pufru s EDTA a detergenty Důkladně promýt v pufru s EDTA Alternativně odstranit proteinázu K pomocí PMSF Skladovat v pufru s EDTA Optimálně štěpit buněčnou stěnu Separace kružnicových molekul DNA pomocí PFGE ˇ Kružnicová DNA se pohybuje v agarózových gelech velice odlišně v porovnání s lineární DNA. Také na změny parametrů pulzní elektroforézy reaguje kružnicová DNA odlišně Příklad separace směsi konkatemerů lineární DNA a monomeru kružnicové DNA v superhelikálním stavu. Při použití dvou různě silných polí putují lineární molekuly v jedné dráze, kdežto kružnicové z této dráhy vybočí. Dvourozměrná pulzní gelová elektroforéza ˇ Preparativní a dvourozměrná PFGE má využití zejména při konstrukci makrorestrikčních map Řešení problémů při PFGE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Problémy při izolaci ­ nanášení vzorku ­ štěpení RE ­ nastavení PFGE