Manipulace s nukleovými kyselinami podmiňují 1. enzymy - zásahy do struktury DNA a RNA 2. vektory - klonovdní fragmentů DNA a RNA 3. hybridizace - identifikace specifických sekvencí Výhody enzymů: vysoká specifičnost reakcí možnost pracovat s malým množstvím substrátu Klasifikace enzymu, jejichž substrátem jsou nukleové kyseliny Podle typu substrátu: - DNA enzymy - RNA enzymy Podle typu reakce: - enzymy anabolické = polymerázy - enzymy katabolické = nukleázy - enzymy spojující řetězce nuk. kyselin = ligázy - enzymy modifikující nukleové kyseliny Anabolické enzymy Syntetizovaná molekula Matrice Enzymová třída Příklad Zdrojový organismus DNA DNA ĎNA-polymerázy ĎNA-polymeráza I E co li RNA Zpětné transkriptazy Zpětná transkriptaza AAAV AAAV (virus ptačí myeloblastózy) Žádná Terminálni transferázy Terminálni transferáza Telecí brzlík Anabolické enzymy Syntetizovaná molekula Matrice Enzymová třída Příklad Zdroj RNA DNA RNA-polymerázy RNA-polymeráza T3, T7, SP6 Ecolimf. fágem T3, T7, SP6 Žádná Poly (A) polymerazy Poly (A) polymeráza E co li Katabo I ické enzymy Rozkládaná molekula Typ degradace Enzymová třída Specífíta Příklad Zdroj DNA od koncu exonukleazy 55 Exonukleáza III E coli ĎS Bal 31 Alteromonas espejiani uvnitř molekuly endonukleazy 55 SI nukleaza Aspergillus oryzae ĎS EcoRI(RE) E co li ĎNáza I hovězí pankreas Katabo I ické enzymy Rozkládaná molekula Typ degradace Enzymová třída Příklad Zdroj RNA od koncu exonukleázy fosfodiesteraza hadí jed uvnitř molekuly endonukleazy ribonukleaza A hovězí pankreas Enzymy modifikující ONA Typ enzymu Příklad Zdroj Metyldzy Z>tf/n-metyldza E coli Z)(T/77-metyldza Eccfcl-metyláza Kindzy T4-polynukleotid kindza Eco//"\r\f. fdgem T4 Fosfatdzy BAP-fosfatdza bakterie CIP-fosfatdza hovězí střevo Enzymy spojující molekuly ONA Typ enzymu Příklad Zdroj ONA ligáza T4-ĎNA-ligáza E.colimí. fágem T4 Reštrikční endonukleázy (RE) • endonukleázy izolované z bakterií • spolu s metylázami představují jednoduché varianty imunitního systému: jejich úkolem je ochrana bakteriálních buněk před cizorodými molekulami DNA • součást reštrikčné modif ikačních systémů • omezují propagaci bakteriof agů (např. f dg namnožený v kmeni C E colinemůže účinne infikovat Ecoli kmen K, protože f agova DNA je v kmeni K účinně degradována) • DNA hostitelské buňky je před účinkem vlastní endonukleázy chráněna metylací • objevitelé : H.O. Smith, K.W. Wilcox, and T.J. Kelley, (Johns Hopkins University, 1968) Restrikce bakteriofága Chromosomai ^-f* DNA \ Phage Chromosomal DNA is protected by methylation 0 Restriction endonuclease attacks incoming DNA Degraded phage DNA Význam restrikčních endonukleaz • nástroj pro prípravu rekombinantních molekul DNA • prostředek pro studium struktury, organizace, exprese a evoluce genomu • zaklad pro genové inženýrství Vlastnosti restrikčních endonukleáz sekvenčně specifické endonukleazy producenty jsou bakterie Štěpí dvouretezcove molekuly DNA většina RE rozeznává palindromy („radar") Štěpí oba řetězce DNA -------------------------------»- rozdělují se do tříd 51 G A A C C A A G Tři třídy RE • rozdělení založeno na způsobu štěpení DNA, molekulové hmotnosti a požadavcích r\a kofaktory • RE třídy I a III nesou v jediném proteinu aktivitu modif ikační a reštrikční • v genovém inženýrství se téměř výhradně používají RE třídy II, které mají pouze aktivitu reštrikční Reštrikční endonukleázy třídy I (EccK, EccB) • vážou se na specifické nukleotidové sekvence • štěpí náhodně v místech vzdálených až několik 1000 pb od místa vazby • molekulová hmotnost dosahuje cca 300.000 • zajišťují modifikaci (metylaci) i restrikci DNA • vyžadují kofaktory ATP, Mg2+ a S-adenosylmetionin • nevhodné pro analýzu sekvencí DNA nebo genové inženýrství Reštrikční endonukleázy třídy II • vážou^se na specifické (4-8 pb) dlouhé rozpoznávací (cílové) místo (Často palindrom) • katalyzují štěpení dvouřetězcových molekul ĎNAo hydrolýzojj fosfodiesterových vazeb obou řetězců v restrikčním místě, které je uvnitř vazebného místa nebo v jeho bezprostředním sousedství • produktem jsou definované reštrikční fragmenty DNA • Štěpení se podrobují všechna cílová místa v dané molekule DNA • molekulová hmotnost: 20.000 -100.000 • kofaktor: pouze ATP • v soucasné/ době zndmo více než 3500 restrikcních endonukledz II Reštrikční endonukleazy třídy III • vážou se r\Q specifická místa DNA, ale štěpení není sekvenčně specifické • kofaktorem je ATP Charakter cílových míst RE třídy II 5'... GAATTC..3' 3'... CTTAAG...5' 5'... GAA TTC...3' 3'... CTT AAG...5' 5%, GAA, AAG...3' i 3'... CTTÍTTC...5' Restnction enzyme recognition sequences... are rotationally symmetric... not mirror symmetric 5 ... NGAATTCN... 3... NCTTAAGN... ^^^ : M !! !! !! '!»!! !Ü 5 ... NCTTAAGN... 3 ... NGAATTCN... ^^^*^*m^*^mm^^*^^^^**w-—* 5 ... NCTTAAGN... 3 ... NGAATTCN... + EcoRI + A/1ÍI ... NG .NCTTAAp -« pAATTCN... --------IGN... ... NCTTAAGN... ... NGAATTCN... (no digestion) ...NC .. NGAATTp pTTAAGN. —ICR, ííííííííííííí Produkty štěpení restrikčních endonukleáz • tupé („blunt") konce (po štěpení obou řetězců ve stejném místě) • ostré („sticky") konce (po Štěpení řetězců v různých místech, která jsou obvykle vzdálena 1-4 nukleotidy) - 5' přečnívající („overhang") přečnívající ± FcoRI G Á A D^CT 3P DiŮ O' AAGIP ♦ 5' Psfl i ÉŮIÉÓtGCAGÉiDÉD n^GACGTCESDBEl 3' + 5" i Smál DBflČČČGGGiÉD ■□iGGGCCC^PI 3 n 3' 4 i 5" C -, « b b O □ ■ El G E3 ■ q ^ 9 ' k k : " A ^ r csiáiu G ^□■ElH * J 31- 5] 5' Sticky ends 5'" D 3' G C A P^ Q A C G d^D CSD 3' Sticky ends 5' 3' 3" n ■ m c c c □ 0GGG 5' Blunt ends Přečnívající kompatibilní konce usnadňují spojení fragmentu DNA pocházejících z různých zdroju 5' a □ Cut site t E G A A I nm c c ůmnmc A A G p n ■ rj T Cut site D T í □ 0Ú n ei c GOD A A EcoRI cut fragment from another source A A m Mix and anneal D □ M Ú Sticky ends O D E3 D annealed ready tor ligation Restriction Enzyme Action of EcoRI The enzyme cuts both it randí at 1 he ume ai Dhft fragment juii at sti;ky ends Sticky end rm A A T T J^OOŕX Sticky enc I Recombinent DMA Využití restrikčních enzymu • fyzikální mapovaní DNA • analýza populačních polymorfizmu • změny v uspořádaní molekul DNA • příprava molekulárních sond • příprava mutantů • analýza modifikací DNA Názvosloví restrikčních endonukleáz napr. Eccfcl • 1. písmeno: počáteční písmeno rodu produkční bakterie • 2. a 3. písmeno: první dvě písmena druhu produkční bakterie • označení kmene (serotypu) produkční bakterie (ne vždy) • rímska Číslice vyjadruje pořadové číslo endonukleazy izo ovane z dané bakterie Examples of restriction endonucleases Enzyme Recognition site Number of bases Ends generated Original source of enzyme EcoKl G/AATTC 6 5' sticky Escherichia coli R Y13 BamHl G.GATCC 6 5' sticky Bacillus amyloliquefaciens H mm A/GATCT 6 5' sticky Bacillus glohigii Pstl CTGCA/G 6 y sticky P rov ide. n cia st uuri i i Xma\ C/CCGGG 6 ,V sticky X an í h on wnas mahacearun i Sma\ CCC/GGG 6 blunt Serratia mareexeens Sau3A GATC 4 5' sticky Staphylôcocccus aureus 3A AM AG/CT 4 bltint Arthrohacter luteus Not} GC/GGCCGC 8 5' sticky $0 cü fdia o t íľ idis-ca v iar um ľad TTAATTAA 8 3' sticky Pseudomonas a kal ige n e s Only one strand of the recognition site is shown, with a slash (/) showing the position of the cleavage site. All the examples shown are palindromic, so the sequence of the second strand, read as the reverse complement, and the position of the cleavage site, will be the same as that shown. Thus the reverse complement of 5'-GAATTC-3' is also 5'-GAATTC-3, and both strands are cut by EcoRl between G and A. Příklady cílových míst některých RE místo štěpeni B---6 6 T 6 6' G G £J ĽJ Haelll Č] |Č| G G 3-"6 6 6 6^ £ kostra cukerných fosfátů [gJ jel EJ Ug [q [c| [g] [g] "6 0 0 > 0 0"" ¥ Id |a| |a| LU m icj ,..,,:, Hif W W ffl lil Ěl 6 6 6 6 6 ô 6 0 6 0 0 ob £_£.. X o: W tö H S "61 '6lwť>'n6' 'g "6. 0 ť 6. 0 6' í --665666660 "6 6 6 G G ra ^ 6 6 0 6 0 6 6 r i j ' i i ' j ■ ' p i ' j i ' i i '— Hati [G] Igl + |Gj [oj 1CJ |Cj Joj M IcÍ?IÍciÍcÍ^1[g1ĚÍ[g] fä |o| [č| [č| [g] |p] ícj [s] "6 6 6 6 6 0 6 0 6"~ ;:Ö_ÖTÖ > o o ± 1- qmnro: ;:."äzs o, p. p. .o, ,o.ľ£ a| U g| Hind III m jÄf + |A| [Oj ISI ĽLJ w ...JjleJíL lí pri [ti a N A A •"6 '6' '6 6 6 6 6 ± L Izoschizomery různé RE, které se stejným rozpoznávacím místem (odlišní producenti, reakce může být odlišná) izoschizomery mohou mít odlišnou citlivost k metylovaným bažím v cílové sekvenci Isoschizomers Products + Kasl 3 »,,LjCjCtL»CjCjv + Narl 5 .„G 3'.,.CCGCGp pGCGCG... (4 bp 5'overhang) "[G... 5 ...GG 3'...CCGCp PCGCC- (2 bp 5'overhang) GG ■;íííí::íííísí:í;;;;;í;íííí;í;ííí;í;íííííííí;í;:;í;;;í;w ■ Izokaudamery • různé RE, které mají odlišné cílové sekvence, ale vytvářejí stejné lepivé konce • výhodné pro cílené spojování různých molekul ÓNA Relaxovaná (uvolněná) specif ita (hvězdičková aktivita) • schopnost RE štěpit kromě cílového místa také jiné - příbuzné sekvence • většinou za neoptimálních reakcních podmínek • Napr. Ecckl může vedle sekvence GAATTC štěpit i sekvence GGATTC, GGATTT, AGATT1 Citlivost RE k metylaci bází v rozpoznávací sekvenci + + AC - štěpení je inhibováno přítomností N6-metyladeninu nebo 5-metylcytozinu oo AC - Štěpení není přítomností N6-metyladeninu nebo 5-metylcytozinu ovlivněno Jednotka RE množství RE, které zcela rozštěpí 1 |ig DNA fága Lambda za 1 hodinu při optimální teplotě a v optimálním prostředí Počet restrikčních míst pro daný enzym v molekule DNA klesá s jejich velikostí DNA Genome Number of restriction sites source size (kb) 4bp 6bp 8bp 1 pUC19 3 10 0~l o~i 2 SV40 5 20 1 0-1 3 Bacteriophage I 48 190 12 0-1 4 Bacteriophage 74 165 660 40 2-3 5 Bacteria 4700 18400 1100 70 6 Yeast* 16000 62500 390Ö 250 7 Fruit fly* 120000 470000 30000 1800 8 Mammals* 3000000 11700000 730000 46000 * Haploid values (most somatic cells have twice as much DNA) Nukleázy • Jejich aktivity jsou obvykle nežádoucí - narušují integritu vzorku DNA a RNA • Existuje řada různých nukleáz, které se lisí substrátovou specif itou, požadavky na přítomnost kof aktorů nebo způsobem degradace substrátu (exonukleázy, endonukleázy, příp. obě aktivity současně) • Substrátová specif ita Často závisí na koncentraci enzymu (vysoké koncentrace - nižší specif ita) Deoxyribonukleáza I (ĎNáza I) Aktivita: • nespecifická endonukleáza • v DNA vytváří jednořetezcové zlomy, od kterých se DNA dale degraduje na mono- a oligonukleotidy Substrát: dvouretezcová i jednoretezcovd DNA Hlavní produkty: Dinukleotidy, trinukleotidy, tetranukleotidy f osf orylované na 5' konci Zdroj: hovězí pankreas beoxyribonukleáza I (DNáza I) Vliv kofaktoru: • za přítomnosti Mg2+ jsou místa Štěpení rozmístěna statisticky na obou řetězcích: náhodné zlomy • za přítomnosti Mn2+ jsou přednostně Štěpena místa ležící ve ds DNA proti sobě: tupé konce nebo přesahy 1-2 nukleotidů Využití: • nízké koncentrace: vytváření jednoretezcových zlomů v ds DNA před značením „nick translací" • vyŠŠí koncentrace: odbouraní DNA z roztoků RNA • Analýza interakcí protein-ĎNA („ĎNase f ootprinting") Mung bean nuclease" Aktivita: • Štěpí jednoretezcovou DNA na mononukleotidy nebo oligonukleotidy • vysoké koncentrace rovněž degradují dvouřetězcovou DNA Využití: • odstranění jednoretezcových přesahů z konců fragmentů DNA: vznik tupých konců NukleózQ Bal31 • Štěpí lineární dvouretezcovou DNA od obou konců bez tvorby intramolekulárních zlomů, vznikají zkrácené fragmenty DNA se zarovnanými konci Aktivita: • endonukleazova specifická pro jednoretezcovou DNA • exonukledzovd 5' ->3' • exonukledzovd 3' -> 5' Podmínka aktivity: • přítomnost iontů Ca2+ (možnost inaktivace chelatacními Činidly) NukleózQ Bal31 Zdroj: • bakterie Alteromonas espejiana Využití: • cílené zkracovaní dvouretezcove DNA z obou konců • odstranění restrikcních míst • zavadění delecí (odstraňuje jednoretezcove oblasti v duplexu DNA a RNA) • mapovaní restrikcních míst fl*v*rí# p rfm*r Vytváření delecí nukleázou Bal31 klonován í DNA do místa RE3 v obou orientacích Clům wbn RES inď RE* L/\* linearizace RE2 Štěpení Bat31 po různou dobu TwgtiDNA tintotrul Mm4r &a£ll Sí>rt3!N dlV !dd Ö r dľlIV-*- N, N. TL 1HC i 1 sseßn ■4- di^V"95Bön J VNa paipiN .e 1 1 ^ ^ v ^ 1 J_ Nl >P!N .cK ioidzd6i| yfslQ 3UDAozX|D4.d>| aD^oay Použití DNA ligáz příprava rekombinantních molekul DNA spojovaní fragmentů DNA různého původu (reštrikční fragmenty DNA, uměle syntetizované molekuly DNA, produkty zpětné transkripce, atd.)QS komplementárními konci, k připojení spojek a adaptorů, cirkularizaci inedrních molekul DNA Běžné typy DNA ligáz T4-ĎNA-liqáza • izolovaná z buněk E coli infikovaných fagem T4 • spojuje lepivé i tupé konce DNA • opravuje jednoretezcove zlomy („nicks11) v dvouřetězcové DNA, RNA a u hybridů ĎNA/RNA • vyžaduje přítomnost fosfátové skupiny na 5' konci a OH skupiny na 3' konci molekuly Bakteriální DNA liqáza • izolovaná z buněk E coli • spojuje jen DNA s lepivými konci Metody spojovaní molekul DNA A. s lepivými konci: za vhodných podmínek dochází k párování komplementárních úseků, kovalentní spojení zajistí ĎNA ligáza B. s tupými konci: - vysokými koncentracemi T4 ĎNA ligázy - přeměnou tupých konců na lepivé prostřednictvím tzv. linkerů, dále viz A C. s přečnívajícími konci, které nejsou kompatibilní: - terminálni transf erázou přidat k 3' koncům jednoho fragmentu homopolymerní extenze (napr. poly-dA) a k 3' koncům druhého fragmentu komplementární homopolymerní extenze (poly-dT) - „zatupení" konců (polymerace, degradace) Vytváření rekombinantních molekul DNA in vitro í A) SPOJEM DVOU KOMPLEMENTÁRNÍCH NEROVNÝCH KONCŮ &' "O, ,C 3' 3" O O O O 0 O s + 5"O 0 0 O O O"3" 5'"O 0 O O O O 0"" 3- |a| |a| LU LTJ l£| +iigáía |q| |a| |a| :r; .'M :, 3' + ATP LTl It] A A |GÍ ľ" O O O O O O O" s- rekombrnantní DNA (8) SPOJENf OVOU TUPÝCH KONCŮ G + [Č| |g| |a| > 0 O" + lígáza + ATP "6 ó 0 ,0 b" G ii g1 h ó ó o o o rekombinantní DNA (O SPOJENI TUPÉHO KONCE S NEROVNÝM KONCEM G + dfloxyrib nukleotidv o- "0. A P. P. <> < [Ť] [Ť] [Ä] A + polynnerářa 'ó' -ó" ó' ó' c5~fr S Ö t m itÍ íti S * ligäfs + ATP a ,ol 'ó o1 'er^ 7^ lei ic 6 Ô Ó Ö 0, 0, ,0. 6'" LU _U Kl fifi R P roxo rekoiribinsnmi DNA rTT" Orientace ligo vany c h fragmentu DNA Blunt end ligation can combine fragments from different restriction enzyme digestions... Insert Recombinants (with blunt ends) Hindi Hindi *i J Smal Vector/plasmid (opened with the blunt-cutter Smal) +1 igase (a) ...but the products are heterogeneous 'Sticky end1 ligations combine only fragments with matching restriction enzyme digestion-produced overhangs.. Insert Recombinants {with different, 'sticky' ends) PstI pr~^L-j EcoRI EcoRI + ligase Vector/plasmid (cut to generate insert-matching ends) ..but the products are more uniform ' o o Úpravy koncu fragmentu DNA vzniklých RE pro účely ligace Přeměna lepivých koncu na tupé: • doplněním chybějících nukleotidů polymerací („filling in") • odstraněním přečnívající sekvence („trimming back") Doplněni 5 přečnívajících koncu DNA polymerací umožněny přítomností 3' OH skupiny, která se uplatní jako primer (nutnd podmínka pro funkci DNA polymerdzy) chybějící sekvence je doplněna polymerací a) Filling in 51 OH 3' □ ÉJ G n^B^CTTAA Extension by addition ol nucleotides to 3'-OH DIGAA 3h n EcoRl sticky end 3' A A 5' Polymerazy • syntetizují nukleové kyseliny postupným doplňovaním nukleotidů k 3'OH konci stávající molekuly nukleové kyseliny • není známá žádná polymeráza prodlužující 5' konec DNA • matricí (templátem) je jednoretezcova DNA nebo RNA • polymerazy vytvářejí komplementární kopii templátového řetězce Polymerace DNA II« U^8 \ 4 HO-P-O-P-OjP-0 i i /// \ o~ o\A> o DNA polymerázy DNA polymeraza I (DNA-dependentní, Kornberguv enzym) 1. Polymerace: prodlužování polynukleotidoveho řetězce ve směru 5' ->3' matrice čtena ve směru 3' -> 5' tvorba fosfodiesterove vazby nukleof Mním atakem 3' OH skupiny rostoucího řetězce q5'P dNTP za tvorby pyrofosfátu požadavek přítomnosti primeru 2. Exonukleázová aktivita 5' -> 3' i 3' -> 5' hydrolýza řetězce DNA v obou směrech 3. Degradace DNA ve směru 5' -> 3' a současná syntéza degradovaného řetězce oprava chybně začleněných nukleotidů />71//V0 („proof-reading") využití při značení DNA („nick translace") ONA polymeraza I (Kornberguv enzym) Zdroj: E. coli Využití: • značení DNA metodou posunu jednoretezcoveho zlomu („nick translací") • syntéza druhého řetězce cDNA DNA polymeráza I E.coli 3 aktivity, jejichž rychlost ie ovlivněna stavem DNA a koncentrací dNTP v reakční směsi: • DNA-dependentní DNA polymerdza • 3' ^5' a5' ^ 3' exonukleazova aktivita • jeden aminokyselinový řetězec (109 kĎa) • kofaktorem je Mg++ • každá ze 3 enzymových aktivit je zajištěna distinktní doménou • proteolýzou lze vytvořit zkrácené varianty, které postrádají některou z domén • DNA polvmeráza I se v minulosti hoj nepoužívala při značení DNA, syntéze cĎNA a při prvních pokusech o konstrukci rekombinantních molekul DNA • nyní jsou k dispozici výkonnější enzymy Schematické znázornění tří aktivit DNA pol I polymerázová 5'-CCG dATP ,2+ dCTP^ Mg 5'_cCGATCG- GGCTAGC- ^ dGTP dTTP -GGCTAGC- 5' 5'--3" exonukleázová 5'gcatgatt-"gcgtactaa-^ Mi .2 + 5< ATGATT GCGTACT-5' 3'—5' exonukleázová 5'-CGATGGA--GCTAC"5. Mg 2+ -^- 5'-CGAT--GCTA-51 T4 ĎNA polymeráza • polymerázová aktivita 5'-» 3' • exonukleazova aktivita 3'^ 5' (200 x vyšší než u Klenowova enzymu) • využití při značení 3' konců DNA nahrazovaci reakcí: • exonukleazova aktivita degraduje dyouretězcovou DNA za tvorby mojekul s překrytými 3' konci. PojDřidání značených dNTP jsou konce doplněny polymeraČni aktivitou enzymu. Klenowuv fragment DNA polymerazy I přítomnost 5'^ 3' exonukleazove aktivity u DNA polymerazy I je nevýhodná (riziko poškození přečnívajícího konce) Klenowuv fragment DNA polymerazy I: produkt proteolýzy E co//bNA polymerazy I subtilisinenr odstranění domény zodpovědné za 5'-» 3' exonukleázovou aktivitu Komerční enzymy: produkty exprese zkráceného genu pro DNA pol I v bakteriích. DNA polymerase I Holoenzyme polymerase domain Proteolysis L 5' -> 3' exonuclease 3' -> 5' eKonuclease domain domain \__yf Large fragment (K-lenow fragment] 51 -> 31 exonuclease Klenowuv fragment DNA polymerázy I - využití syntéza dvouretezcove DNA z jednoretezcových templatu oligonucleotide primer Ĺgägttc 3 ' lUhGCTCIUlGTCCGIlTGCCTGIlGCCIlTIlGTCCGGIlTIlGCCTGACGILTCCGATCATTC 5 I template DNA Klenow fragment, dATP, dCTP, dGTP, dTTP GIU^TTCAGGCTACGGACTCGGTATCAGGCCTATCGGACTGCTAGGCT 3 ' JUkGCTCltftGTCCGaTGCCTGllGCCATllGTCCGGaTÄGCCTGÄCGaTCCGftTCATTC 5 Klenowuv fragment DNA polymerázy I - využití Doplnění zkrácených 3'koncu fragmentů DNA („fill-in reaction"): vytváření tupých konců vhodných pro klonování. 5' fl-G-G-C-fl-G 3' T-C-C-G-T-C-C-T-fl-G Klenow and \ G-A-T-C nucleotides / ! Klenowuv fragment DNA polymerázy I - využití Odstraněni přečnívajících 3' koncu s využitím 3'-» 5' exonukleazove aktivity: vytváření tupých konců vhodných pro klonování Odstraňování nukleotidů od 3' konců má tendenci pokračovat, ale za přítomnosti nukleotidů je tato aktivita vyrovnána aktivitou polymerační a vede k tvorbě tupých konců S' G-fi-C-G-fl-G-C-T 3' C-T-G-C v 5' G-fi-C-G Klenot* > g. C_T_G_C • • Úpravy 3 přečnívajících koncu DNA doplnění polymerací r\er\\ možné k zatupení je třeba použít enzym, který disponuje 3'^ 5'exonukieazovou aktivitou (např, Klenow, T4 DNA polymerdzu) b) Trimming back 5' (m sticky end □ n ^ C T G C A G Removal of unpaired ^ bases by 3'-5' exonuclease action S D M C □ f 3' J 5' • krátké synteticky připravené oligonukleotidy (napr. CCGGATCCGG) • nesou cílovou sekvenci pro RE (napr. ßamiril - &&ATCC) • v případě, že jsou autokomplementární, postačuje jen jeden řetězec Použití: 1. linker se připojí k tupým koncům DNA ligací 2. štěpením RE se vytvoří jednovláknové lepivé konce DNA 3. spojení původně nekompatibilních molekul DNA ligací Význam: • umožňují opatřit jakoukoliv DNA žádoucími konci C C G G A 3' C C G i Seľf-complementary oligonucleotide G G C C 3' A G G C C Blunt-ended {SmaJ\) fragment 5' - -.....i i 3' I Anneal 3' sním Híí 5' G G G TI C C G G A G G C C 3" C C G G A G G C C 5* 3' - nm ????TŤ????_ I Cut with 6am H1 5' AilAUUIľ T?TTf f f ??Ť?TTT- Fragment with sticky ends Adaptory • dvojice krátkých synteticky připravených oligonukleotidů, které se spo u částečně párují a přitom vytvoří krátký fragment dvouretezcove DNA zakončený jedním tupým a jedním přečnívajícím koncem nebo dvěma přečnívajícími konci Použití: 1. přeměna tupých konců na ostré 2. přeměna jedné přečnívající sekvence na jinou 5' 5f Two synthetic, partly complementary, oligonucleotides G G G C C C 3' "; L GATCCCCGGG k 31 DiCC A G Fragment with BamHI sticky ends 51 3' Anneal A A 5r G A C C C C G G G G G G C C C U A A Li g ate □ M i G G A C C 3' C C C C G G G AGGGGCCC A A Fragment with FcoRl compatible ends p HO 5f-H0-GATCCCCGGG-0H 3*- HO-GGGCCC-P Adaptor fTOtecuto HO(—-.OH OH, HOL-Jp ŕíLJ HO,-----1 OH T4DNA ligase, ATP HO1 Použiti adaptoru HOl-i te£*ÄfeTL?H i Polynucleotide kinase, ATP HO S OH P T7 ĎNA polymeraza DNA polymeraza bakteriofaga T7 Aktivity: ĎNA polymerázová 5'-» 3' 3'^ 5' exonukleazova (5'-> 3'exonukleazova doména chybí) Velmi podobná Klenowovu fragmentu a T4 ONA polymerase T7 ĎNA polymeráza - výhody Vysoká procesivita: Průměrná délka syntetizované DNA před tím nežwenzym dispciuje od templatu je podstatně vyšší nez u jiných enzymů. Využití při sekvenování ĎNA Sekvenaza a Sekvenaza 2.0 jsou chemicky ošetřené nebo genetickými manipulacemi vytvořené deriváty T7 DNA polymerázy, které postrádají 3' ^> 5' exonukleázovou^ aktivitu - Široce používány při sekvenování. Termostabilní DNA polymerázy Tag DNA polymeraza byla purifikovana z bakterie Thermus aquaticus, která žije v horkých pramenech v roce 1976. Zhruba o 10 let později byla objevena polymerazova řetězová reakce. Termostabilní DNA polymerazy • Katalyzují syntézu DNA z nukleosid trifosfatu na templatu (jako jiné DNA polymerazy) • Požadavky pro iniciaci polymerace: - volna 3'OH skupina - přítomnost horečnatých iontů Termostabilní DNA polymerázy Katalytická aktivita je maximální mezi 75 a 80°C a klesá při nižších teplotách. Při 37°C, má 7Í7<7polymeráza pouze asi 10% své maximální aktivity. Kromě Taq DNA polymerázy bylo izolováno několik dalších termostabilních DNA polymeráz, např. Pfua Vent polymeráza Taq z Thermus aquaticus, poločas života je 1,6 hod v 95°C Pfuz Pyrococcus furiosus, která má nejvyšší přesnost Vent z Thermococcus litoralis, poločas života je 7 hod v 95°C Polymerázy syntetizující jednořetězce Poly(A) polymerazQ • katalyzuje přidání cca 200 A na 3' konec mRNA při sestřihu eukaryotické mRNA • požadavky: přítomnost substrátu (ATP) a kof aktoru (ionty Mg a Mn) (není potřeba matrice) Využití: • Syntéza cDNA: prostřednictvím primerů oligo (dT) lze sekvenci mRNA zpětnou transkriptazou převést do cDNA Terminálni transf eráza • katalyzuje pridaní deoxynukleotidu k 3' konci DNA Substrát: • přečnívající, zkrácené i tupé konce dvouřetězcové molekuly DNA (preferované jsou přečnívající 3' konce) nebo jeanořetězcová DNA • nevyžaduje matrici ani primer Kofaktor: kobalt Zdroj: telecí brzlík (jedna se o savČíenzym exprimovaný vlymfocytech, komerčné dostupné varianty jsou produktem exprese hovézího genu v E coli) Využití: • přidaní homopolymerních koncu k 3' koncům DNA • značení 3' koncu DNA Pridaní homopolymerních koncu terminálni transferázou V minulosti obvyklý postup při klonování cĎNA do plazmidových vektoru. Princip: terminálni transferáza se využije k přidání úseku &&&... k linearizovanemu plazmidovemu vektoru a k přidání úseku CCC... k cĎNA. Po smísení a inkubaci obou molekul dojde k vazbě komplementárních úseků a tím k včlenění cĎNA do vektoru, který se pak použije k transformaci E coli. í Linearized plasmid cDNA c + dGTP ■GGGGGGG terminal transferase + dCTP GGGGGGG- D ccccc- ■ccccc r ■GGGGGGG-CCCCC- ■CCCCC -•GGGGGGG- D Výhody terminálni transferázy • velikost pripojených úseku nemusí být stejná (pokud se jedna o úseky větší než 20 nukleotidů, jejich párovaní je dostatečně silné, aby zajistilo stabilitu duplexu v pokojové teplotě) • v transformovaných buňkách se nesporované oblasti opraví reparacními mechanismy kJonoTaný fragment 5' 3' 3' 3 Vektor S'1^ í 5' dCTP terminálni 1 deoxynukleotldyl-transteraza ,, dGTP 3f (c)ncc připojení 1 „annealing" a) odstranění jed n ořetězcových konců exonukleazou b) zaplnění mezer pomocí DNA-potymerazy c) ková len tni spojeni DNA-Ugázou Značení 3'koncu terminálni transferázou Substrát: - obvykle fragment DNA s 3' přečnívajícím koncern, vzniklý restrikcním Štěpením - oligodeoxynukleotid Princip: DNA je inkubovana s nukleotidy, terminálni transferdza začlení skupinu nukleotidů k 3' přečnívajícímu konci nebo k 3'konci oligonukleotidu 5g-a-t-c-a-c-t-g-c-a a-c-g-t-c-t-a-g-t-g 5. ^ Terminal transferase dTTP G-A-T-C-A-C-T-G-C-A-T-T-T-T-T-T-T T-T-T-T-T-T-T-A-C-G-T-C-T-A-G-T-G Terminálni transferaza upravuje i neprečnívající 3'konce dvouretezcove DNA 3' 3'OH dGTP 5' Terminal transferase 3h ir í 3' G G G G G G G U □ Zpětná (reverzní) transkriptáza RNA-dependentní DNA polymeráza přepis genetické informace z RNA do DNA požadována přítomnost primeru a matrice poskytuje v první fázi hybrid RNA/ĎNA, po odstranění RNA působením hydroxidů nebo RNázy H lze zpětnou transkriptázou katalyzovat i syntézu druhého vlákna DNA syntézu 2. vlákna může zajistit také DNA polymeráza I Zdroj: retroviry AA-AAuLV (Moloney Murine Leukemia Virus) AMV (Avian Myeloblastosis Virus) RSV (Rous Sarcoma Virus) Zpětná (reverzní) transkriptáza Aktivity: • Polymcrazova: v životním cyklu retroviru se uplatňuje pouze při kopírování RNA, v laboratoři Jze^využít pro transkripci^ jednořetězcové RNA i jednořetězcové DNA. V obou případech je pro iniciaci syntézy nutná přítomnost primeru. • 5' -> 3' exoribonukleazova • 3' -> 5' exoribonukleazova a endoribonukleazova (RNáza H): zajišťuje degradaci RNA z hybrido RNA-ĎNA, které vznikají při zpětné transkripci. Využití: tvorba cĎNA - specifická (primer: oligo dT) - nespecifická (primer: komplementární k 3' oblasti hledané mRNA) Využití zpětné transkriptázy Syntéza cĎNA: inkubace mRNA s krátkým (12-18 baží) polymerem tymidinu (oligo dT), který se váže na polyA mRNA a zpětná transkriptaza jej využije jako primer pro iniciaci syntézy prvního řetězce. AC GGCUAUAC C GCUAGC CUAAGC AAAAAAA TTTTTTT primer -If ^^1 ^^fl ^^^ ^^^^ ^^^ ^^^ ^^^ AC GGCUAUAC C GCUAGC CUAAGC AAAAAAA dATP.dCTP, transcriptase reverse _^- dQTp^ dcTp TGCCGATArGGCGATCGGATT CGTTTTTTT AC GGCUAUAC C GC UAGC CUAA GC AAAAAAA Syntéza c DNA tkáň (např. mozková) a purifikace mRNA w 5' mRNA , cDNA 3'-konec cDNAtvoří vlásenku mRNA hybridizace s poly(T)-prímerem vytvoření kopie pomocí reverzní transkriptázy užití alkalického roztoku pro odbourání RNA 3' -AAAAAAA 3' r\ r~\ r~\ f~\ i\ Jx AA t 1 11 I I I TTTTTTT 3' 5' ■AAAAAAA TTTTTTT 5' syntéza komplementárního DNA-řetézce s použitím DNA-polymerázy; spárovaný 3'- konec funguje jako primer ^%#%#%#ß-ii transcriptase Alkali.ribonuclease 5' - 3'<*- ♦ AAAAA-3' TTTTT-5' RNAseH" 5' dCTP Terminal transferase 1 Alkati, ribormclease V 3'------------------- C ľ single-stranded TTTT-5' cDNA 3'- CCCCC 5' oligo(dG)12.w dNTP Klenow polymerase oř reverse transcriptase V Klenow polymerase K DNA polymerase or reverse transcriptase S'-GGG 3'- CCCCC - 3' C AAAAA-3' TTTTT-5' S1-Nuclease E.coli DNA polymerase! V Sl-Nuclease #> 5' 3" AAAAA-3' double-stranded TTTTT-5' cONA - AAAA -3 - TTTT-5 <*> <£> Bakteriofágové RNA polymerdzy RNA polymeraza Hostitel fága Promotorova sekvence T7RNA polymeraza £ coli TAATACGACTCACT ATAGGG T3RNA polymeraza E coli AATTAACCCTCACT AAAGGG SP6 RNA polymeraza Salmonella typhimurium AATTTAGGTGACA CTATAGAA Bakteriofágové DNA-dependentní RNA polymerázy Obvyklé využití: 1. transkripce in vitro pro tvorbu definovaných RNA • značené ribonukleotidy se použijí k tvorbě značené RNA • značená RNA se využije jako sonda při hybridizaci 2. Příprava templátu pro translaci in vitro 3. Studium struktury a funkce RNA Enzymy modifikující DNA Fosfatazy, kinázy, metylazy, Alkalická fosfatáza • odstraňuje fosfátové zbytky z 5' koncu DNA, RNA a oligonukleotidů (hydrolýza fosfomonoesterových vazeb) při alkalickém pH • defosforyluje také zbytky šeřinu, treoninu a tyrosinu v proteinech Alkaline phosphatase Alkalická fosfatáza Zdroj: - E coli (BAP) - hovězí střevo (CIP) BAP je velmi aktivní enzym, je obtížné dosáhnout jeho včasné inaktivace CIP se používa nejcasteji: je sice méně aktivní než BAP, ale lze ji účinně inaktivovat proteazovou hydrolýzou nebo zahrátím Alkalická fosfatáza Využití: • reštrikční fragmenty DNA zbavené koncových fosfátů nemohou být spojeny ligací (zabránění recirkularizace prázdných vektorů, usnadnění klonování) • značení DNA 32P v kombinaci s kinazou: odstranění 5'fosfátů z fragmentů DNA před značením radioaktivním fosfátem • defosforylace proteinu Význam defosforylace DNA pro lígací Vector HO P Insert P OH Dephosphorylated V6Ct0r HO P Insert í I m G A A T T C 3 □ ED C T A A G □ D on n ;HO:OH Phosphate group removed 1«^GAATT C ^ D □ ^ O Li9ation PICT T AA60DDID DillÍÁA m c mmn c A A G ^ Ligation □ □ DD n □ Nick unligaied Použití alkalické fosfatazy při kl ono vání ■>"**% *■*':; y - b) regenerováno c) nebozm£n£no Způsoby modifikace koncu DNA 5-G OH 3' 3'-CpTpTpApAp Alkaline S'-G OH 3' y phosphatase S'-CpTpTpApAon 5'-GoH 3' V-32P-ATP v 5'-GnH3' J0H 3'-CpTpTpApAoň ( Polynucleotide- 3'-CpTpTpApAp* kinase 5'-% 3' 3'-CpTpTpApAp S1-Nuclease 5'-Gr 3' ^> J0H a'-cpc. 3' 5'-G0H J-------> Klenow- polymerase S'-GpApApTpT0H 3'-CpTpTpApAp dATP. dTTP 3-CpTpTDÄpAp S'-GpApApTpT0H 3 V-Exonuclease 5'-GpApApTpTnH 3'-CpTpTpApAp5< B'-GpApApT^ToH^' 3'-CpTpTpApAp5. 3'-Cpc. Exonucleaseltl 5'-G0H3' nNp 5' 3'-CpTpTpApAp ►Np 5" 5'-GpApApTpT0n 3* Bat 31 5"pApA0H 3'+ Oligo-and 3'-CpTpTpApAp,. 3'TpTp,, mononucleotide